Phương pháp chiết bằng dung môi dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm Nguyên lý cơ bản: Phương pháp này dựa trên việc sử dụng sóng siêu âm để tăng cườngquá trình chiết xuất các chất từ dung mô
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nội dung 1: Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác
2.1.1 Vật liệu và hóa chất
2.1.1.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian: Vào lúc 13h00, ngày 06/11/2024 Địa điểm: Tại phòng thí nghiệm 304, tòa nhà A2, Viện Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
Nguyên liệu: Cỏ ngũ sắc khô đã xay nhuyễn, giấy lọc, phễu lọc,ống nghiệm, bình Erlen 100 ml, cốc đong, máy sấy, máy đánh sóng siêu âm.
2.1.2.1 Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau
Bước 1: Cân 1g cỏ ngũ sắc đã xay nhuyễn và cho vào bình Erlen 100 ml, lặp lại 2 lần với 2 dung môi khác nhau.
Bước 2: Pha 15 ml dung môi n- Hexane và acetone cho vào bình Erlen.
Bước 3: Cho dung môi vào bình Erlen có chứa nguyên liệu, lắc nhẹ và chiết bằng siêu âm trong thời gian 15 phút.
Hình 2.1 Hỗn hợp dung môi và nguyên liệu.
Bước 4: Sử dụng giấy lọc để thu dịch chiết.
Bước 5: Thêm tiếp 15 ml dung môi vào bã và lặp lại bước 3.
Bước 6: Lọc hết bã trong bình qua giấy lọc ( Lưu ý: cân khối lượng giấy lọc). Bước 7: Sấy khô cả bã và giấy lọc trong tủ sấy để qua đêm.
Bước 8: Cân để biết khối lượng bã sau chiết.
2.1.2.2 Xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp sấy
Bước 1: Cân 2g mẫu cho vào chén thủy tinh đã sấy khô (105 o C) và làm nguội trong bình hút ẩm.
Bước 2: Để cốc chứa mẫu sấy ở 105 o C đến khối lượng không đổi.
(Lưu ý: Để nguội trong bình hút ẩm và cân tổng khối lượng chén và mẫu.)
Nội dung 2: Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật sắc ký cột
2.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Chiều thứ 4, 13 tháng 11 năm 2024. Địa điểm: A2 – Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trường, Trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu: Cỏ ngũ sắc khô đã xay nhuyễn.
Bông thủy tinh, Giấy lọc, Phễu lọc, Ống nghiệm, Pipet Pasteur, Bình Erlen 100 Ml , Cốc đong.
Quá trình phân tách diễn ra trong một cột hở, dựa vào sự khác biệt trong khả năng hấp phụ của các hợp chất với pha tĩnh (chất hấp phụ) Các thành phần có độ hấp phụ và ái lực thấp hơn sẽ di chuyển nhanh hơn so với những thành phần có độ hấp phụ và ái lực cao hơn.
Thí nghiệm thực hiện 2 lần để thu được lượng dịch chiết có thể quan sát được các sắc tố như chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid trong mẫu thực vật.
Chuẩn bị dịch chiết sắc tố
Bước 1: Cân 1g cỏ ngũ sắc đã xay nhuyễn và cho vào bình Erlen
Bước 2: Pha 10 ml dung môi Hexane: acetone (8:2).
Bước 3: Cho dung môi vào bình Erlen có chứa nguyên liệu, lắc nhẹ và siêu âm trong thời gian 5 phút.
Bước 4: Sử dụng giấy lọc để thu dịch chiết.
Chuẩn bị cột sắc kí
Hình 2.5 Hỗn hợp dung môi và nguyên liệu.
Hình 2.6 Dịch chiết thu nhận được sau khi lọc.
Bước 5: Sử dụng pipet Pasteur làm cột, nhét 1 lớp lượng bông thủy tinh vừa đủ vào dưới đáy pipet.
Bước 6: Cân 0,5 g silica gel (kích thước hạt 230− 400 mesh) vào cốc thủy tinh khô và thêm vào 5 ml Hexane ngâm trong 5-10 phút (nhồi cột ướt).
Bước 7: Nạp hỗn hợp silica gel vào pipet Pasteur và gõ nhẹ để loại bỏ không khí, đảm bảo rằng silica gel lắng xuống đều và toàn bộ silica gel bám trên thành cột sẽ rơi xuống.
Hình 2.7 Chuẩn bị silica gel (a) Lần cân thứ 1; (b) Lần cân thứ 2; (c) Ngâm silica gel trong
Khi nạp hỗn hợp vào pipet, cần đảm bảo bề mặt pha tĩnh thẳng để phân tách các chất trong mẫu được đồng đều Sau đó, tiến hành đưa mẫu vào cột.
Khi pha động cách bề mặt pha tĩnh 1 mm, hãy thêm khoảng 1 mL hỗn hợp dịch chiết sắc tố vào cột dọc theo thành, để tránh làm xao động bề mặt pha tĩnh.
Hình 2.8 Silica gel được cho vào pipet.
Bước 9: Tiếp tục cho pha động là n-Hexane qua cột, tránh để cột khô
Bước 10: Sau đó để cho phép tốc độ nhỏ giọt khoảng 1 giọt mỗi giây.
Bước 11: Nhóm carotenoid màu vàng cam được rửa giải trước, thu vào ống nghiệm
Hình 2.9 Cho hỗn hợp sắc tố vào cột.
Bước 12: Sử dụng dung môi phân cực hơn là 70% n-Hexane + 30% acetone để rửa giải diệp lục tố.
Bước 13: Thu nhận hỗn hợp các diệp lục tố chlorophyll a và b có màu xanh.
Bước 14: Quan sát khả năng phân tách sắc tố và đưa ra kết luận về độ phân cực của các sắc tố.
Hình 2.10 Thu nhận nhóm carotenoid.
Hình 2.11 Thu nhận nhóm diệp lục tố.
Nội dung 3: Phân tách sắc tố thực vậtbằng kĩ thuật TLC
2.3.1.Vật liệu và phương pháp thực hiện
2.3.1.1 Thời gian và địa điểm
Vào lúc 13h00 chiều thứ hai, ngày 20/11/2023, sẽ diễn ra sự kiện tại phòng thí nghiệm 304, tòa nhà A2, Viện Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
2.3.2 Vật liệu và phương pháp
2.3.2.1 Vật liệu thí nghiệm và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ: Ống đong, erlen, phễu thủy tinh, giấy lọc, máy đánh sóng siêu âm, ống nghiệm, pipet, bản sắc ký mỏng silica gel F245 – 60
Vật liệu thí nghiệm: dịch chiết cỏ sấy khô và xay nhuyễn thành dạng bột được sàng qua rây có đường kính là ɸ = 1 mm.
Hỗn hợp Hexane: acetone tỷ lệ 7:3.
Hỗn hợp Hexane: acetone tỷ lệ 6:4.
Bước 1 Chuẩn bị dịch chiết sắc tố (nội dung 2).
Bước2 Chuẩn bị bảng mỏng vừa kích thước đủ dùng Sau đó, dùng bút chì đánh dấu vách xuất phát và vạch kết thúc ở trên bản mỏng Silica gel – F245.
Hình 2.12 Dịch chiết cỏ ngũ sắc
Bước 3: Tải mẫu lên bản mỏng bằng cách hút 3-5 L dung dịch mẫu chiết vào vị trí đã được đánh dấu Tiến hành để khô và lặp lại quá trình từ 3 đến 4 lần cho đến khi mẫu trên bảng mỏng đạt độ đậm mong muốn.
Lưu ý: cố gắng load mẫu một cách đồng tâm để cho ra kết quả là các band thẳng hàng, rỏ, đẹp.
Để tiến hành tách chiết mẫu, chuẩn bị hai pha động thể tích 10 L gồm dung môi hỗn hợp Hexane: acetone với tỷ lệ 7:3 và 6:4 Đặt bản mỏng vào hai bình ly giải chứa hai loại dung môi, cho phép dung môi di chuyển lên bảng sắc ký nhờ lực mao dẫn Khi gặp mẫu thử, dung môi sẽ dịch chuyển mẫu lên bản sắc ký, với các hợp chất trong mẫu di chuyển với tốc độ khác nhau do sức hút khác nhau đối với pha tĩnh và độ tan khác nhau trong dung môi Quá trình tách chiết diễn ra dựa trên sự cạnh tranh giữa chất tan và pha động để tìm chỗ liên kết với pha tĩnh.
Lưu ý: mức dung môi trong bình ly giải luôn thấp hơn vạch xuất phát ở bảng mỏng.
Hình 2.13 Load mẫu lên bảng mỏng
THẢO LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Nội dung 1: Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác
4.1.1 Kết luận Độ ẩm đạt tiêu chuẩn dược liệu để bảo quản ở nhiệt độ thường.
Hiệu suất chiết của dung môi Acetone cao hơn đối với n-Hexane khi dùng để chiết cỏ ngũ sắc.
Sử dụng dung môi khác, kiểm tra hiệu suất chiết khi dùng cho cỏ ngũ sắc, để tìm được dung môi phù hợp, đạt hiệu suất cao hơn.
Nội dung 2: Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật sắc ký cột
Thu được carotenoid, chlorophyll a và b với hai sắc màu khác nhau. Dùng sắc ký cột với phương pháp đơn giản để phân tách sắc tố của dịch chiết.
Thay đổi dung môi khác, kiểm tra hiệu suất khi dùng cho mẫu, sắc tốt có tách lớp tốt hơn, lượng mẫu sau thu nhiều hơn.
Nội dung 3: Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật TLC
Kết luận từ sự khác nhau của pha động cho thấy TLC (2) với pha động Hexane: acetone tỷ lệ 7:3 làm cho Chlorophyll a và Chlorophyll b di chuyển chậm hơn so với TLC (1) với tỷ lệ 6:4, trong khi carotenoid không có sự khác biệt nhiều Điều này chỉ ra rằng Chlorophyll a và Chlorophyll b có ái lực cao với dung môi có độ phân cực giảm dần Sử dụng pha tĩnh là silica gel F245 – 60, khi chiếu tia UV 245 nm, các hợp chất trên bảng mỏng sẽ phát huỳnh quang, giúp xác định sự hiện diện của nhiều loại hợp chất hơn.
Kiểm tra với nhiều tỉ lệ và dung môi khác nhau để quan sát hiện tượng và tốc độ di chuyển của các hợp chất, đồng thời thực hiện phân tích dưới ánh sáng UV với bước sóng 245nm.
BÀI TẬP
Xây dựng đường chuẩn cho Protocate acid
Bảng 5.1 Tương quan giữa nồng độ Protocate acid và diện tích pic
Xây dựng đường chuẩn cho Chlorogenic acid
Bảng 5.2 Tương quan giữa nồng độ Chlorogenic acid và diện tích pic
Hình 5.1 Đường chuẩn Protocate acid. y = 20,008x – 9,7092 578,0308 = 20,008x - 9,7092
Xây dựng đường chuẩn cho Caffeic acid
Bảng 5.3 Tương quan giữa nồng độ Caffeic acid và diện tích pic
Hình 5.2 Đường chuẩn Chlorogenic acid.
Hình 5.3 Đường chuẩn Caffeic acid.
