Báo cáo nhóm 6th chẩn Đoán bệnh tv

Vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh xơ đen trên mít xâm nhập vào trái theo nước mưa bằng hai con đường: vi khuẩn theo nước mưa đi vào nướm hoa cái mở ra nhận phấn.. Vật liệu, dụng cụ và

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Thao tác thu cặn vi khuẩn Pantoea stewartii. 3

DANH SÁCH CÁC BẢNG

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh Đen xơ mít

Bệnh Đen xơ mít là một trong những căn bệnh nguy hiểm và phổ biến trên cây mít, đặcbiệt là các giống mít siêu sớm Bệnh này không chỉ làm giảm năng suất mà còn ảnh hưởngnghiêm trọng đến chất lượng trái, gây thiệt hại kinh tế lớn cho người trồng

1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh

Vi khuẩn Pantoea stewartii: Đây là tác nhân chính gây bệnh Vi khuẩn xâm nhập vào

trái qua các vết thương, lỗ khí khổng hoặc theo nước mưa

Điều kiện môi trường: Mùa mưa, độ ẩm cao tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn pháttriển

Vệ sinh vườn kém: Cỏ dại, tàn dư cây trồng tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh sôi

1.1.2 Triệu chứng nhận biết

Xuất hiện các đốm đen li ti trên vỏ, sau đó lan rộng và ăn sâu vào thịt quả

Thịt quả chuyển sang màu đen, xơ, mềm nhũn, có mùi hôi

Hạt mít bị thối rữa

1.1.3 Ảnh hưởng của bệnh

Giảm năng suất: Trái bị bệnh không phát triển được, rụng sớm, giảm năng suất.Giảm chất lượng: Trái bị bệnh có vị nhạt, không ngọt, không bảo quản được lâu

Ảnh hưởng kinh tế: Gây thiệt hại lớn cho người trồng mít.

Hình 1.1 Quả mít bị bệnh đen sơ mít

1.2 Vi khuẩn Pantoea stewartii

Vi khuẩn này là một loại vi khuẩn hiếu khí, gram âm, sắc tố màu vàng, tạo chất nhầy,không hình thành bào tử, hình que kích thước 0,4-0,8 x 0,9-2,2 µm Một số chủng phát triển

ở 4°C, một số ở 37°C Khuẩn lạc trên thạch nấm men – dextrose - canxi cacbonat có màuvàng và lồi Khuẩn lạc trên thạch Nutrient dextrose có màu vàng kem đến vàng cam

Vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh xơ đen trên mít xâm nhập vào trái theo nước mưa

bằng hai con đường: vi khuẩn theo nước mưa đi vào nướm hoa cái mở ra nhận phấn Vikhuẩn phát triển trong bầu noãn làm cho múi không thụ tinh và hạt bị lép, hư chuyển quamàu đen Con đường thứ hai là qua khe hở, lõm giữa các múi mít

Hình 1.2 Khuẩn lạc và tế bào Pantoea stewartii.

CHƯƠNG 2: LY TRÍCH VI KHUẨN Pantoea stewartii

2.1 Vật liệu, dụng cụ và hóa chất

Vật liệu: dịch tăng sinh vi khuẩn Pantoea stewartii.

Dụng cụ: Pipet, đầu tip, tube, máy vortex, máy ly tâm

Hóa chất: STE, Lysin buffer, CI, Chloroform, Isoropanol, Ethanol 70%, TE buffer

2.2 Phương pháp tiến hành

Bước 1: Hút 1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn vào tube 1,5 ml sau đó ly tâm 10000 vòng/3

phút, loại bỏ dịch nổi (lặp lại trong 2 lần), thu cặn khuẩn

Hình 2.1 Thao tác thu cặn vi khuẩn Pantoea stewartii.

Bước 2: Thêm vào tube chứa dịch vi khuẩn 400 µl STE, vortex đều sau đó ly tâm

10000 vòng/3 phút (lặp lại 2 lần)

Hình 2.2 Cho STE vào tube.

Hình 2.3 Vortex hỗn hợp dịch mẫu

Hình 2.4 Ly tâm mẫu.

Bước 3: Thêm vào tube 400 µl Lysin buffer, vortex đều sau đó đem ủ ở 65oC trong 1giờ

Hình 2.5 Thêm Lysin buffer vào tube

Bước 4: Sau khi ủ, thêm vào tube 300 µl CI, vortex đều sau đó ly tâm 13000 vòng/10

phút

Hình 2.6 Thêm CI vào tube.

Bước 5: Hút 300 µl dịch nổi qua tube mới Sau đó thêm vào 100 µl Chloroform (tỷ lệ

3:1) Ly tâm 13000 vòng/8 phút

Hình 2.7 Thêm Chloroform vào tube.

Bước 6: Hút 200 µl dịch nổi vào tube mới Sau đó thêm 100 µl Isopropanol vào, đảo

nhẹ cho đồng nhất mẫu Ủ lạnh 30 phút sau đó ly tâm 13000 vòng/13 phút Đổ dịch nổi thualấy cặn

Bước 7: Rửa tủa bằng 480 µl Ethanol 70% sau đó ly tâm 13000 vòng/10 phút Bỏ dịch

nổi và để khô tự nhiên

Bước 8: Thêm vào tube 50 µl TE buffer Bảo quản ở -20oC

Hình 2.8 Dịch mẫu trước khi đem bảo quản

2.3 Kết quả

Kết quả thu được dịch ly trích vi khuẩn Pantoea stewartii để thực hiện các thí nghiệm

tiếp theo

CHƯƠNG 3: ĐIỆN DI TỔNG SỐ 16S

3.1 Vật liệu, dụng cụ và hóa chất

Vật liệu: DNA trong dịch ly trích vi khuẩn Pantoea stewartii.

Dụng cụ: Micropipet, Eppendorf, máy điện di, lò vi sóng, máy PCR

Hoá chất: Gel Red, Loading Dye, GreenTag, Primer F, Primer R, Agarose, TBE

PCR 16S DNA để chắc chắn là DNA vi khuẩn Pantoea stewartii.

Bước 1: Hút 8,5 µl thành phần phản ứng (Nước, Primer F, Primer R, Buffer và Tag) và

1,5 µl DNA mẫu Tổng 10 µl cho 1 phản ứng

Hình 3.2 Hút thành phần phản ứng PCR.

Bước 2: Chạy máy PCR qua 30 chu kỳ.

Hình 3.3 Chạy máy PCR 30 chu kỳ

Bước 3: Đổ gel 1%, đong 30 ml TBE 0,5 X và 0,3 g Agarose cho vào lò vi sóng đến

khi gần sôi và tiến hành đổ gel

Bước 4: Điện di sản phẩm PCR, hút 1 µl Gel Red và 5 µl mẫu cho vào giếng điện di,

điện di ở 100V trong 25 phút

Hình 3.4 Điện di sản phẩm PCR.

3.3 Kết quả

Hình 3.5 Kết quả điện di tổng số 16S

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR.

3.4 Thảo luận

Kết quả điện di tổng số 16S ta thấy band sáng vừa đủ không quá đậm cũng không quảnhạt và không có tạp chất, chứng tỏ DNA đã tinh sạch và nồng độ DNA vừa đủ không quánhiều nên không cần phải pha loãng

Kết quả điện di sản phẩm PCR ta thấy band sáng và đẹp, chứng tỏ nồng độ DNA vừa

đủ cho phản ứng PCR vì nếu DNA quá nhiều sẽ ức chế phản ứng PCR

CHƯƠNG 4: CHẠY PCR VỚI PRIMER CHUYÊN

BIỆT CHO LOÀI

4.1 Vật liệu, dụng cụ và hóa chất

Vật liệu: DNA trong dịch ly trích vi khuẩn Pantoea stewartii.

Dụng cụ: Micropipet, Eppendorf, máy điện di, lò vi sóng, máy PCR

Hoá chất: Gel Red, Loading Dye, GreenTag, Primer F, Primer R, Agarose, TBE

4.2 Phương pháp tiến hành

Bước 1: Tiến hành Vortex mẫu DNA của nhóm.

Bước 2: Hút 8,5 µl thành phần phản ứng (Nước, Primer F, Primer R, Buffer và Dream

Tag) và 1,5 µl DNA mẫu Tổng 10 µl/1 phản ứng

Hình 4.1 Hút thành phần phản ứng PCR.

Bước 3: Thực hiện phản ứng PCR với 30 chu kì trong 40 phút.

Bảng 4.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

30 chu kì

4.4 Thảo luận

Kết quả điện di dương tính cho thấy mẫu sinh vật được phân tích có chứa DNA của

loài Pantoea stewartii Kết quả này có thể được sử dụng để đánh giá sự hiện diện của Pantoea stewartii trong một mẫu môi trường, thực phẩm hoặc sinh vật.

CHƯƠNG 5: CHẠY PCR VỚI PRIMER THAM KHẢO

5.1 Vật liệu, dụng cụ và hóa chất

Vật liệu: DNA trong dịch ly trích vi khuẩn Pantoea stewartii.

Dụng cụ: Micropipet, Eppendorf, máy điện di, lò vi sóng, máy PCR

Hoá chất: Gel Red, Loading Dye, GreenTag, Primer F, Primer R, Agarose, TBE

5.2 Phương pháp tiến hành

Bước 1: Tiến hành Vortex mẫu DNA của nhóm.

Bước 2: Hút 9 µl thành phần phản ứng (Nước, Primer F, Primer R, Buffer và Dream

Tag) và 1 µl DNA mẫu Tổng 10 µl/1 phản ứng

Hình 5.1 Hút thành phần phản ứng PCR.

Bước 3: Thực hiện phản ứng PCR với 35 chu kì trong 40 phút.

Bảng 5.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

35 chu kì

Bước 4: Đổ Gel 1%, đong 30 mL TBE 0,5X và 0,3 g Agarose cho vào lò vi sóng đến

khi gần sôi và tiến hành đổ Gel

Bước 5: Hút 1 µl Gel Red và 5 µl mẫu cho vào giếng điện di, tiến hành điện di ở 100V

trong 25 phút

Kết quả sau điện di cho thấy band còn nhiều vệt sáng chứng tỏ Primer tham khảo trên

bài báo chưa đặc hiệu với vi khuẩn Pantoea stewartii ở Việt Nam, có thể do vị trí địa lý, điều

kiện tự nhiên khác nhau cũng ảnh hưởng đến gene của vi khuẩn