Vật liệu, thiết bị và hóa chất Vật liệu thí nghiệm: DNA trong dịch ly trích vi khuẩn Pantoea stewartia, Thiết bị và dụng cụ: Micropipet, Eppendorf, máy điện di, lò vi sóng, máy PCR.. Bả
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
BÁO CÁO THỰC HÀNH
CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH
HỌC PHÂN TỬ
THỰC VẬT BẰNG SHPT
TP Thủ Đức, 12/2024
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
BÁO CÁO THỰC HÀNH CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH
HỌC PHÂN TỬ
Thủ Đức, 12/2024
PGS TS NGUYỄN BẢO QUỐC THẠCH VINH
TRẦN VĂN PHÚC NGUYỄN PHÚC THIỆN
Trang 3MỤC LỤC
MỤC LỤC 3
CHƯƠNG 1 QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA VI KHUẨN BẰNG LYSIS BUFFER 4
1.1 Giới thiệu về vi khuẩn Pantoea stewartia 4
1.2 Thời gian và địa điểm thực hiện 4
1.3 Vật liệu thí nghiệm và hóa chất 5
1.4 Phương pháp thực hiện 5
CHƯƠNG 2 ĐIỆN DI DNA TỔNG SỐ 16S 9
2.1 Vật liệu, thiết bị và hóa chất 9
2.2 Phương pháp tiến hành 9
2.2.1 Điện di DNA tổng số 16S lần 1 9
2.2.2 Chạy PCR 16S DNA lần 2 9
2.3 Kết quả 12
2.4 Thảo luận 12
CHƯƠNG 3: CHẠY PCR VỚI PRIMER CHUYÊN BIỆT CHO LOÀI 13
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 13
3.2 Vật liệu thí nghiệm và hóa chất 13
3.3 Phương pháp thực hiện 13
3.4 Kết quả thảo luận 15
CHƯƠNG 4: CHẠY PCR VỚI PRIMER THAM KHẢO TRÊN BÁO 17
4.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 17
4.2 Vật liệu thí nghiệm và hóa chất 17
4.3 Phương pháp thực hiện 17
4.4 Kết quả thảo luận 19
Trang 4DANH SÁCH HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Vi khuẩn Pantoea stewarti 5
Hình 1.2 Dịch tăng sinh vi khuẩn 6
Hình 1.3 Cho STE vào tube 7
Hình 1.4 Cho lysis buffer vào tube chứa mẫu 7
Hình 1.5 Cho CI vào tube 8
Hình 1.7 Cho Chloroform vào tube chứa mẫu 8
Hình 2.1 Điện di DNA tổng số 10
Hình 2.2 Pha loãng mẫu đi 10 lần 11
Hình 2.3 Hút các thành phần của quá trình phản ứng PCR 11
Hình 2.4 Điện di sản phẩm PCR 13
Hình 2.5 Kết quả điện di tổng số 16S 13
Hình 2.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR 14
Hình 3.1 Vortex mẫu, cho mẫu vào thành phần phản ứng 15
Hình 3.2 Điện di sản phẩm PCR 17
Hình 3.3 Kết quả sau khi điện di 17
Hình 4.1 Cho mẫu vào thành phần phản ứng đã chuẩn bị trước đó 18
Hình 4.2 Điện di sản phẩm PCR 20
Hình 4.3 Kết quà điện di 20
Trang 5DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Các thành phần phản ứng 12
Bảng 2.2 Chu kì nhiệt của quy trình PCR 12
Bảng 3.1 Các thành phần phản ứng: 16
Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt của quy trình PCR với 30 chu kỳ: 16
Bảng 4.1 Các thành phần phản ứng 19
Bảng 4.2 Chu kỳ nhiệt của quy trình PCR với 35 chu kỳ: 19
Trang 6CHƯƠNG 1 QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA VI KHUẨN BẰNG LYSIS
BUFFER
1.1 Giới thiệu về vi khuẩn Pantoea stewartia
Pantoea stewartii là một loài vi khuẩn gây bệnh thực vật gây ra bệnh héo Stewart ở ngô, cũng như bệnh cháy lá mít, bệnh héo lá do vi khuẩn ở mía và bệnh cháy lá ở lúa P stewartii là một loại vi khuẩn gram âm trong Enterobacterales, một nhóm cũng bao gồm Escherichia coli và một số tác nhân gây bệnh khác ở người, động vật và thực vật Hầu hết các nghiên cứu về tác nhân gây bệnh vi khuẩn này cho đến nay đều được thực hiện trên các chủng gây nhiễm cho ngô vì các bệnh khác mới chỉ được xác định gần đây Do tương đối dễ làm việc trong nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, P stewartii đã được sử dụng để nghiên cứu một loạt các quá trình trong sinh lý học vi khuẩn bao gồm cảm biến số lượng, sản xuất sắc tố vi khuẩn, enzyme endoglucanase, và thu nhận sắt qua trung gian siderophore
Hình 1.1 Vi khuẩn Pantoea stewarti
1.2 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian: Vào lúc 12h30, chiều thứ tư , ngày 23/10/2024
Địa điểm: Tại phòng thí nghiệm 304, tòa nhà A1, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM
Trang 71.3 Vật liệu thí nghiệm và hóa chất
Vật liệu: dịch tăng sinh vi khuẩn Pantoea stewartii
Dụng cụ và thiết bị thực: Pipet, đầu tip, tube, máy vortex, máy ly tâm
Hóa chất : STE, Lysin buffer, CI, Chloroform, Isoropanol, Ethanol 70%, TE buffer
1.4 Phương pháp thực hiện
Bước 1: Hút 1 ml dịch tăng sinh khuẩn vào tube 1,5 ml Ly tâm 10000 vòng/ 3 phút.
Loại bỏ dịch nổi Làm lập lại 2 lần như trên
Hình 1.2 Dịch tăng sinh vi khuẩn
Bước 2: Cho 400 ul STE Đem Vortex, ly tâm 10000 vòng/ 3 phút Lập lại tương tự 2
lần
Trang 8Hình 1.3 Cho STE vào tube
Bước 3: Cho 400 ul lysis buffer Vortex đều, đem ủ ở 65oC trong 1 giờ.
Hình 1.4 Cho lysis buffer vào tube chứa mẫu.
Bước 4: Cho 300 ul CI Sau đó đảo đều L y tâm 13000 vòng/ 10 phú
Trang 9Hình 1.5 Cho CI vào tube
Bước 5: Hút 300 ul dịch nổi qua tube mới Sau đó, cho thêm 100 ul Chloroform (tỷ
lệ 3:1) Ly tâm 13000 vòng/ 8 phút
Hình 1.7 Cho Chloroform vào tube chứa mẫu
Bước 6: Hút 200 ul dịch nổi qua tube mới Sau đó, cho thêm 100 ul Isopropanol, đảo
nhẹ cho đồng nhất mẫu Ủ lạnh 30 phút Ly tâm 13000 vòng/ 13 phút Bỏ dịch nổi và thu cặn
Trang 10Bước 7: Rửa tủa bằng 480 ul Ethanol 70% Ly tâm 13000 vòng/ 10 phút Bỏ dịch
nổi, để khô tự nhiên
Bước 8: Cho 50 ul Elution buffer Sau đó bảo quản ở -20oC.
1.5 Kết quả và thảo luận
Thu được DNA của vi khuẩn Pantoea stewartia Tuy nhiên chưa xác định được hàm
lượng nhiều hay ít của mẫu số 7 nên cần phải thực hiện điện di tổng số để xác định nhằm tránh ảnh hưởng đến quá trình PCR
Trang 11CHƯƠNG 2 ĐIỆN DI DNA TỔNG SỐ 16S 2.1 Vật liệu, thiết bị và hóa chất
Vật liệu thí nghiệm: DNA trong dịch ly trích vi khuẩn Pantoea stewartia,
Thiết bị và dụng cụ: Micropipet, Eppendorf, máy điện di, lò vi sóng, máy PCR Hoá chất thí nghiệm: Gel Red, Loading Dye, GreenTag, Primer F, Primer R, Agarose, TBE
2.2 Phương pháp tiến hành
2.2.1 Điện di DNA tổng số 16S lần 1
Hút 1µl Gel red, 0,5µl Loading Dye và 3 µl, mix đều và cho hỗn hợp vào giếng điện di nhằm để kiểm tra mẫu độ sạch của mẫu Điện di ở 100V trong 25 phút
\
Hình 2.1 Điện di DNA tổng số
2.2.2 Chạy PCR 16S DNA lần 2
Bước 1: Vortex mẫu sau đó thực hiện pha loãng mẫu đi 10 lần (Kết quả điện di tổng
số thấy band của nhóm rất đậm và rất sáng)
Trang 12Hình 2.2 Pha loãng mẫu đi 10 lần
Bước 2: Hút 1,0µl DNA mẫu và 9,0µl thành phần phản ứng gồm: Nước, Primer F,
Primer R, Buffer và Tag
Hình 2.3 Hút các thành phần của quá trình phản ứng PCR.
Trang 13Bảng 2.1: Các thành phần phản ứng
Bước 3: Cày đặt máy PCR và thực hiện chạy theo chu kỳ nhiệt với 30 chu kỳ.
Bảng 2.2 Chu kì nhiệt của quy trình PCR
Tiền biến tính 95 3 phút
Bước 4: Đổ gel 1% để thực hiện quá trình điện di sản phẩm:
Đong 30 ml TBE 0,5 X và 0,3 g Agarose cho vào lò vi sóng
Đổ gel và thực hiện quá trình điện di
Bước 5: Hút 5 µl mẫu và 1 µl Gel Red cho vào giếng và thực hiện điện di sản phẩm
vừa chạy PCR
Chú ý: Điện
di ở 100V trong 25
phút
Trang 14Hình 2.4 Điện di sản phẩm PCR.
2.3 Kết quả
Hình 2.5 Kết quả điện di tổng số 16S.
Hình 2.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR.
2.4 Thảo luận
Kết quả điện di tổng số 16S ta thấy band rất và rất sáng có thể thấy được mẫu trong quá trình ly trích không bị nhiễm tạp chất, quá trình thu DNA trong li trích sản phẩm sạch, tuy nhiên hàm lượng DNA quá nhiều sẽ ảnh hưởng đến quá trình PCR nên trước khi PCR cần phải pha loãng mẫu lại để tránh ảnh hưởng đến quá trình PCR
Trang 15CHƯƠNG 3: CHẠY PCR VỚI PRIMER CHUYÊN BIỆT CHO LOÀI 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian: Vào lúc 12h30, chiều thứ thứ 4, ngày 6 tháng 11 năm 20224
Địa điểm: Tại phòng thí nghiệm 304, tòa nhà A1, trường Đại học Nông Lâm
TP.HCM
3.2 Vật liệu thí nghiệm và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ: Máy vortex, Micropipet, Eppendorf, máy PCR, máy điện di, lò
vi sóng
Vật liệu thí nghiệm: Mẫu DNA thu từ dịch ly trích vi khuẩn Pantoea stewartii.
Hóa chất thí nghiệm: Nước (H2O), primer R, primer F, buffer, Green Tag, Agarose,
TBE, Loading Dye, Gel Red
3.3 Phương pháp thực hiện
Bước 1: Đem mẫu DNA của nhóm đi vortex, dùng Micropipet hút các thành phần
phản ứng gồm có: Nước, primer R, primer F, buffer, tag cho lần lượt vào Eppendorf, cuối cùng cho mẫu DNA đã vortex vào Tổng 1 phản ứng là 10ul
Hình 3.1 Vortex mẫu, cho mẫu vào thành phần phản ứng.
Trang 16Bảng 3.1 Các thành phần phản ứng:
Bước 2: Đem đi phản ứng trên máy PCR với 30 chu kỳ trong 40 phút.
Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt của quy trình PCR với 30 chu kỳ:
Tiền biến tính 95 3 phút
Bước 3: Chuẩn bị đổ gel 1% dùng cho điện di, cân 0,3g Agarose và đong 30ml TBE
0.5X cho cả 2 vào lọ đựng, cho lọ vào lò vi sóng đến khi gần sôi thì lấy ra tiến hành đổ gel vào khuôn
Bước 4: Chuẩn bị bồn điện di, mix 3ul mẫu với 1,5ul hỗn hợp Loading Dye và Gel
Red, cho hỗn hợp trên vào giếng trên bồn điện di sau đó bắt đầu điện di trong 25 phút ở 100V
Trang 17Hình 3.2 Điện di sản phẩm PCR.
Bước 5: Hoàn thành điện di, thu kết quả và chụp màn hình.
3.4 Kết quả thảo luận
Hình 3.3 Kết quả sau khi điện di.
Kết quả sau khi điện di thì có xuất hiện band sáng so với đối chứng dương thì cho
thấy kết quả điện di là dương tính nên mẫu DNA phân tích có chứa DNA của loài Pantoea
stewartii
Trang 18CHƯƠNG 4: CHẠY PCR VỚI PRIMER THAM KHẢO TRÊN BÁO 4.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian: Vào lúc 12h30, chiều thứ tư, ngày 13 tháng 11 năm 2024.
Địa điểm: Tại phòng thí nghiệm 304, tòa nhà A1, trường Đại học Nông Lâm
TP.HCM
4.2 Vật liệu thí nghiệm và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ: Máy vortex, Micropipet, Eppendorf, máy PCR, máy điện di, lò
vi sóng
Vật liệu thí nghiệm: Mẫu DNA thu từ dịch ly trích vi khuẩn Pantoea stewartii.
Hóa chất thí nghiệm: Nước (H2O), cặp primer R, primer F tham khảo trên báo,
buffer, Green Tag, Agarose, TBE, Loading Dye, Gel Red
4.3 Phương pháp thực hiện
Bước 1: Đem mẫu DNA của nhóm đi vortex, dùng Micropipet hút các thành phần
phản ứng PCR với cặp primer tham khảo trên báo, ta hút 5,9ul nước, 0,5ul primer R, 0,5ul primer F, 2ul buffer, 0,1ul tag cho lần lượt vào Eppendorf, cuối cùng cho 1,5ul mẫu DNA đã vortex vào Tổng 1 phản ứng là 10ul
Hình 4.1 Cho mẫu vào thành phần phản ứng đã chuẩn bị trước đó.
Trang 19Bảng 4.1 Các thành phần phản ứng
Bước 2: Đem đi phản ứng trên máy PCR với 35 chu kỳ trong 40 phút.
Bảng 4.2 Chu kỳ nhiệt của quy trình PCR với 35 chu kỳ:
Tiền biến tính 95 3 phút
Bước 3: Chuẩn bị đổ gel 1% dùng cho điện di, cân 0,3g Agarose và đong 30ml TBE
0.5X cho cả 2 vào lọ đựng, cho lọ vào lò vi sóng đến khi gần sôi thì lấy ra tiến hành đổ gel vào khuôn
Bước 4: Chuẩn bị bồn điện di, mix 3ul mẫu với 1,5ul hỗn hợp Loading Dye và Gel
Red, cho hỗn hợp trên vào giếng trên bồn điện di sau đó bắt đầu điện di trong 25 phút ở 100V
Trang 20Hình 4.2 Điện di sản phẩm PCR.
Bước 5: Hoàn thành điện di, thu kết quả và chụp màn hình.
4.4 Kết quả thảo luận
Hình 4.3 Kết quà điện di.
Kết quả diện di cho thấy xuất hiện band sáng nhưng có nhiều vệt, so với kết quả của
chương 3 thì cặp Primer tham khảo trên bài báo chưa đặc hiệu đối với loài vi khuẩn Pantoea
stewartii tại Việt Nam, có thể Primer này đặc hiệu đối với loài Pantoea stewartii ở địa
phương khác