Nhóm 7 sáng thứ 6 thực hành chuẩn Đoán bệnh thực vật bằng shpt

Kết quả Sau khi thực hiện quá trình ly trích DNA từ vi khuẩn Pantoea stewartii, kết quả thu được là một mẫu DNA trong suốt, được hòa tan trong dung dịch elution buffer, như thể hiện tron

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH

HỌC PHÂN TỬ

THỰC VẬT BẰNG SHPT

Thủ Đức, 1/2025

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH

HỌC PHÂN TỬ

Thủ Đức, 1/2025

NGUYỄN HOÀNG PHÚC – 20126339 NGUYỄN TRUNG HIẾU – 20126247

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH HÌNH ẢNH ii

DANH SÁCH BẢNG iii

BÀI 1 QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA VI KHUẨN BẰNG LYSIS BUFFER 1

1.1 Giới thiệu về vi khuẩn Pantoea stewartii 1

1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 1

1.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 2

1.2.2 Vật liệu thí nghiệm và hóa chất 2

1.2.3 Phương pháp thực hiện 2

1.3 Kết quả và thảo luận 3

1.3.1 Kết quả 3

1.3.2 Thảo luận 3

BÀI 2 THỰC HIỆN QUÁ TRÌNH PCR VỚI PRIMER 16S 5

2.1 Vật liệu và phương pháp 5

2.1.1 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất 5

2.1.2 Phương pháp tiến hành 5

2.2 Kết quả và thảo luận 7

2.2.1 Kết quả 7

2.2.2 Thảo luận 7

BÀI 3: CHẠY PCR VỚI PRIMER ĐẶC HIỆU CHO VI KHUẨN PANTOEA STEWARTII VÀ ĐIỆN DI 8

3.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 8

3.1.1 Vật liệu và hóa chất 8

3.1.2 Phương pháp thực hiện 8

3.2 Kết quả thảo luận 9

3.2.1 Kết quả 9

3.2.2 Thảo luận 10

DANH SÁCH HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Vi khuẩn Pantoea stewartii 1

Hình 1.2 Kết quả sau khi DNA được hòa tan trong elution buffer 3 Hình 1.3 Kết quả kiểm tra sự xuất hiện DNA 3 Hình 2.1 Kết quả chạy điện di sau khi thực hiện PCR 16s a) Leader, b) Đối chứng

âm, c) Đối chứng dương 7

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR với Primer đặc hiệu 9

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Các thành phần phản ứng 5

Bảng 2.2 Chu kì nhiệt của quy trình PCR 5

Bảng 3.1 Các thành phần phản ứng 8

Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt của quy trình PCR với 30 chu kỳ 8

BÀI 1 QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA VI KHUẨN BẰNG LYSIS

BUFFER

1.1 Giới thiệu về vi khuẩn Pantoea stewartii

Pantoea stewartii là tác nhân gây bệnh héo khô do vi khuẩn (Stewart's wilt) trên ngô,

mía và mít gây ra các bệnh nguy hiểm ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng cây trồng Vi khuẩn P stewartii thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, có hình thái trực khuẩn và không sinh nha bào, gây ra các bệnh này qua vết thương cơ học hoặc côn trùng truyền bệnh

Vi khuẩn này xâm nhập vào cây qua các vết thương trên lá hoặc thân, chủ yếu do côn trùng truyền nhiễm Bệnh biểu hiện qua các triệu chứng như héo úa và thối rữa mô cây, đặc biệt ở

vùng lá và thân Pantoea stewartii gây hại mạnh mẽ nhờ khả năng tiết ra các độc tố làm tổn

thương các mô mạch, gây tắc nghẽn dòng chảy nước và dinh dưỡng trong cây

Ngoài ra, quá trình ly trích DNA từ Pantoea stewartii đóng vai trò quan trọng trong

việc phân tích các gene liên quan đến khả năng gây bệnh, kháng thuốc và các đặc tính sinh

lý của vi khuẩn Việc thu thập và phân tích DNA giúp xác định các yếu tố virulance (khả năng gây bệnh) và các gene kháng thuốc, qua đó hỗ trợ phát triển các phương pháp điều trị

và phòng ngừa bệnh hiệu quả hơn

Hình 1.1 Vi khuẩn Pantoea stewartii.

1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian: Vào lúc 8 giờ, sáng thứ sáu , ngày 6/12/2024

Địa điểm: Tại phòng thí nghiệm 304, tòa nhà A1, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

1.2.2 Vật liệu thí nghiệm và hóa chất

Vật liệu: dịch tăng sinh vi khuẩn Pantoea stewartii

Dụng cụ và thiết bị thực: Pipet, đầu tip, tube, máy vortex, máy ly tâm

Hóa chất: STE buffer (Sodium chloride/Tris/EDTA), Lysin buffer, CI (Chloroform/Isoamyl alcohol) (24:1), Ethanol 70%, TE buffer

1.2.3 Phương pháp thực hiện

Bước 1: Hút 1 ml dịch tăng sinh khuẩn vào tube 1,5 ml Ly tâm 10000 vòng/ 3 phút.

Loại bỏ dịch nổi Làm lặp lại 2 lần như trên

Bước 2: Cho 400 μl STE Đem Vortex, ly tâm 10000 vòng/ 3 phút Lập lại tương tự 2 lần

Bước 3: Cho 400 μl lysis buffer Vortex đều, đem ủ ở 65oC trong 1 giờ

Bước 4: Cho 300 μl CI Sau đó đảo đều L y tâm 13000 vòng/ 10 phút

Bước 5: Hút 300 µl dịch nổi qua tube mới Sau đó, cho thêm 100 μl Chloroform (tỷ lệ 3:1) Ly tâm 13000 vòng/ 8 phút

Bước 6: Hút 200 ul dịch nổi qua tube mới Sau đó, cho thêm 100 μl Isopropanol, đảo nhẹ cho đồng nhất mẫu Ủ lạnh 30 phút Ly tâm 13000 vòng/ 13 phút Bỏ dịch nổi và thu cặn

Bước 7: Rửa tủa bằng 480 µl Ethanol 70% Ly tâm 13000 vòng/ 10 phút Bỏ dịch nổi,

để DNA khô tự nhiên

Bước 8: Cho 50 µl Elution buffer Sau đó bảo quản ở -20oC

1.3 Kết quả và thảo luận

1.3.1 Kết quả

Sau khi thực hiện quá trình ly trích DNA từ vi khuẩn Pantoea stewartii, kết quả thu

được là một mẫu DNA trong suốt, được hòa tan trong dung dịch elution buffer, như thể hiện

trong Hình 3.1.

Hình 1.2 Kết quả sau khi DNA được hòa tan trong elution buffer

Tuy nhiên, khi tiến hành điện di để kiểm tra sự hiện diện của DNA, mẫu xuất hiện hiện tượng tạp nhiễm, với sự xuất hiện của băng sáng tại miệng giếng cùng với băng sáng của

DNA vi khuẩn Điều này được thể hiện rõ trong Hình 3.2.

Hình 1.3 Kết quả kiểm tra sự xuất hiện DNA

1.3.2 Thảo luận

Qua quá trình thực hiện, nhóm nhận thấy hiện tượng tạp nhiễm trong mẫu DNA vi khuẩn Nguyên nhân có thể là do trong quá trình thao tác, mẫu bị nhiễm các dị vật từ môi

Nhóm 7

trường bên ngoài Các thao tác không ổn định, cùng với việc môi trường thực hành đông thành viên, đã làm tăng khả năng xảy ra nhiễm chéo trong quá trình ly trích DNA

Để giải quyết vấn đề này, nhóm đã rút ra kinh nghiệm là cần vệ sinh kỹ lưỡng tất cả các dụng cụ và khu vực làm việc trước khi tiến hành ly trích DNA Đồng thời, cần tập làm quen với quy trình và thao tác một cách chính xác, nhằm hạn chế tối đa các sai sót trong quá trình thực hiện

Dù gặp phải một số khó khăn như hiện tượng tạp nhiễm, nhưng nhóm đã hoàn thành

thành công quy trình ly trích DNA từ vi khuẩn Pantoea stewartii và nhận thấy được những

thiếu sót trong từng thành viên trong quy trình thực hiện Từ đó, nhóm sẽ tiếp tục cải thiện quy trình và thực hành để đảm bảo kết quả chính xác và hiệu quả trong những lần thực hiện tiếp theo

BÀI 2 THỰC HIỆN QUÁ TRÌNH PCR VỚI PRIMER 16S

2.1 Vật liệu và phương pháp

2.1.1 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất

Vật liệu thí nghiệm: DNA trong dịch ly trích vi khuẩn Pantoea stewartia,

Hóa chất: Agarose, TBE 0.5X, DNA đã được ly trích, GelRed, TBE Buffer, Loading dye, ống Eppendorf, pipette

Thiết bị và dụng cụ: Micropipet, Eppendorf, máy điện di, lò vi sóng, máy PCR

2.1.2 Phương pháp tiến hành

Bước 1: Vortex mẫu sau đó thực hiện pha loãng mẫu đi 20 lần (Kết quả điện di tổng

số thấy band của nhóm rất đậm và rất sáng)

Bước 2: Hút 1,0 µl DNA mẫu và 9,0 µl thành phần phản ứng theo bảng dưới đây

Bảng 2.1 Các thành phần phản ứng

Bước 3: Cài đặt máy PCR và thực hiện chạy theo chu kỳ nhiệt với 30 chu kỳ.

Bảng 2.2 Chu kì nhiệt của quy trình PCR

Bước 4: Chuẩn bị Gel Agarose 1%

Cân 0,3g Agarose và đong 30 mL dung dịch đệm điện di TBE 0,5M vào ống đong Sau

đó, thêm 0,3g Agarose vào bình chứa có nắp đậy 100 mL và thêm vào bình 30 mL dung dịch điện di TBE và lắc đều để phân tán Agarose trong dung dịch đệm

Tiếp theo, đem bình có chứa dung dịch gel vào lò vi sóng và đun sôi cho đến khi các hạt Agarose tan hoàn toàn trong vòng 1 phút thành dung dịch trong suốt

Lưu ý: Trước khi cho vào lò vi sóng, đậy nắp bình gel không quá chặt để tránh gây nổ.

Bên cạnh đó, bình chứa Agarose nóng có thể gây phỏng nếu tiếp xúc trực tiếp với da nên luôn mang găng tay, áo blouse trong khi chuẩn bị và đổ gel Tiếp đến, đem bình chứa Agarose ra và đợi dung dịch nguội xuống, sau đó đổ gel vào khay có mang lược gel và đợi đến khi gel đông hoàn toàn

Bước 5: Chuẩn bị bồn điện di

Khi gel đã nguội và đặc lại khay gel được đặt vào bồn điện di và ngập trong dung dịch đệm điện di TBE Sau đó, tháo lược gel ra và tạo ra các “giếng” rỗng để bơm mẫu điện di vào Và mẫu được bơm vào giếng bởi micropipette

Bước 6: Sau đó, hút 1 µL Gel Red nhỏ 1 giọt lên miếng nilon Và tiếp tục hút 0,5 µL

Loading dye và 3 µL mẫu DNA tổng số nhỏ vào cùng Gel Red Vặn micropipette lên 4,5 µl rồi trộn đều hỗn hợp chứa mẫu DNA tổng số, Loading dye và GelRed này lên Sau khi trộn xong, hút 4,5 µL hỗn hợp có chứa DNA tổng số rồi bơm vào hàng giếng

Lưu ý: Khi bơm, nếu để đầu tip nằm trên miệng giếng thì sẽ bị bơm ra ngoài, nếu để sâu quá

thì sẽ bị lủng giếng Vì vậy, phải để đầu tip ở giữa giếng và bơm ra từ từ để không tràn ngược

ra ngoài

Sau khi bơm vào giếng, vì hỗn hợp có Loading dye có chứa Bromophenol blue nên có màu xanh, giúp nhận biết giếng nào đã được bơm

Bước 7: Điện di

Sau khi bơm mẫu vào giếng, đậy nắp bồn điện di cẩn thận, không chạm vào mẫu Tiến hành điện di tại hiệu diện thế 100V trong 20 – 30 phút Sau đó, đặt gel dưới tia UV và quan sát, ghi nhận kết quả

2.2 Kết quả và thảo luận

2.2.1 Kết quả

Kết quả điện di PCR của gene 16S rRNA với kích thước 1500bp từ Pantoea stewartii

cho thấy sự xuất hiện của một dải rõ ràng, điều này chứng tỏ quá trình khuếch đại gene 16S

từ DNA của vi khuẩn đã thành công

Hình 2.1 Kết quả chạy điện di sau khi thực hiện PCR 16s a) Leader, b) Đối chứng âm, c) Đối

chứng dương

2.2.2 Thảo luận

Kết quả điện di của tổng số 16S cho thấy các band rõ ràng và rất sáng, điều này cho thấy quá trình ly trích mẫu không bị nhiễm tạp chất và sản phẩm DNA thu được là sạch Tuy nhiên, hàm lượng DNA quá cao có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của phản ứng PCR

Vì vậy, trước khi thực hiện PCR, cần pha loãng mẫu để đảm bảo quá trình này không bị ảnh hưởng Kết quả điện di sản phẩm PCR cũng cho thấy các band sáng, chứng minh có

sự hiện diện của DNA từ mẫu vi khuẩn

N7

BÀI 3: CHẠY PCR VỚI PRIMER ĐẶC HIỆU CHO VI KHUẨN

PANTOEA STEWARTII VÀ ĐIỆN DI

3.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu và hóa chất

Vật liệu: Mẫu DNA từ Pantoea stewartii, mồi PCR Pantoea stewartii đặc hiệu cho

Pantoea stewartii (mồi xuôi và ngược).

Dụng cụ: Ống nghiệm, micropipet, máy votex, ống pipet và pipet tips

Thiết bị: Máy PCR, máy điện di, máy quang phổ và bể điện di

Hóa chất: Taq polymerase, DNTPs, buffer, MgCl₂, ethidium bromide (hoặc SYBR green), agarose, TBE hoặc TAE buffer

3.1.2 Phương pháp thực hiện

Bước 1: Chuẩn bị ống Eppendorf, lần lượt cho các chất vào và tránh tạo bọt

Bảng 3.1 Các thành phần phản ứng

Bước 2: Đem đi phản ứng trên máy PCR với 30 chu kỳ trong 1 tiếng 20 phút Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt của quy trình PCR với 30 chu kỳ

Cân 0,3g Agarose và đong 30 mL dung dịch đệm điện di TBE 0,5X vào bình chứa Cho hỗn hợp vào lò vi sóng đến khi gần sôi, sau đó lấy ra và tiến hành đổ gel vào khuôn

Bước 4: Chuẩn bị bồn điện di

Khi gel đã nguội và đông đặc, đặt khay gel vào bồn điện di sao cho gel hoàn toàn ngập trong dung dịch đệm TBE Tiếp theo, tháo lược gel để tạo ra các giếng trống, sau đó sử dụng micropipette để bơm mẫu vào các giếng này

Sau đó, hút 1 µL Gel Red nhỏ 1 giọt lên miếng nilon Và tiếp tục hút 0,5 µL Loading dye và 3 µL mẫu DNA tổng số nhỏ vào cùng Gel Red Vặn micropipette lên 4,5 µl rồi trộn đều hỗn hợp chứa mẫu DNA tổng số, Loading dye và GelRed này lên Sau khi trộn xong, hút 4,5 µL hỗn hợp có chứa DNA tổng số rồi bơm vào hàng giếng

Bước 5: Điện di

Sau khi bơm mẫu vào giếng, đậy nắp bồn điện di cẩn thận, không chạm vào mẫu Tiến hành điện di tại hiệu diện thế 100V trong 20 – 30 phút Sau đó, đặt gel dưới tia UV và quan sát, ghi nhận kết quả

3.2 Kết quả thảo luận

3.2.1 Kết quả

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR với Primer đặc hiệu

Kết quả sau khi điện di sản phẩm PCR với primer đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea

stewartii cho thấy sự xuất hiện của một dải rõ ràng (214bp) so với đối chứng dương thì

cho thấy kết quả điện di là dương tính nên mẫu DNA phân tích có chứa DNA của loài

Pantoea stewartii.

N7

3.2.2 Thảo luận

Kết quả điện di cho thấy sự hiện diện của một dải có kích thước 214 bp, tương ứng

với sản phẩm khuếch đại từ primer đặc hiệu cho Pantoea stewartii Dải này rõ ràng và so

với đối chứng dương, cho thấy mẫu DNA phân tích chứa vật liệu di truyền của loài vi khuẩn này Điều này chứng minh rằng phản ứng PCR đã được thực hiện thành công, và

mẫu thử là dương tính với Pantoea stewartii Kết quả này khẳng định tính hiệu quả và chính xác của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện và xác định sự có mặt của Pantoea

stewartii, từ đó hỗ trợ trong việc chẩn đoán bệnh hoặc nghiên cứu sinh học phân tử liên

quan đến vi khuẩn này