Nhóm 15 chuẩn Đoán bệnh thực vật bằng shpt

Do tính chất nguy hiểm của bệnh virus gây ra với cây trồng và nền sản xuất nông nghiệp, rất nhiều biện pháp, công nghệ đã được xây dựng và pháttriển phục vụ công tác quản lý, phòng trừ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

SỬ DỤNG KỸ THUẬT RPA CHUẨN ĐOÁN TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIRUS TRÊN CÂY TRỒNG

TP Thủ Đức, 12/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

SỬ DỤNG KỸ THUẬT RPA CHUẨN ĐOÁN TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIRUS TRÊN CÂY TRỒNG

TP Thủ Đức, 12/2024

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

iv CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về bệnh hại thực vật do virus gây ra 2

2.1.1 Triệu chứng bệnh virus thực vật 2

2.1.2 Thiệt hại do virus trên cây trồng 6

2.2 Kỹ thuật RPA (Recombinase Polymerase Amplification) 6

2.2.1 Nguyên lý hoạt động 7

2.2.2 Tính ứng dụng 8

2.2.3 Ưu điểm của phương pháp RPA trong chuẩn đoán virus thực vật 9

2.2.4 Nhược điểm của phương pháp RPA trong chuẩn đoán virus thực vật 10

2.2.5 Triển vọng và thách thức trong việc ứng dụng kỹ thuật RPA 12

2.2.5.1 Triển vọng của kỹ thuật RPA 12

2.2.5.2 Thách thức trong việc ứng dụng RPA 12

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

14 3.1 Vật liệu 14

3.1.1 Nguồn mẫu thí nghiệm 14

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị 14

3.1.3 Hóa chất sử dụng 14

3.2 Phương pháp nghiên cứu 14

3.2.1 Chuẩn bị mẫu 14

3.2.2 Phương pháp RPA 15

3.2.3 Điện di 15

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

16 4.1 Kết quả

16 4.2 Thảo luận

16 TÀI LIỆU THAM KHẢO

18 Tài liệu tiếng Việt

18 Tài liệu tiếng nước ngoài 18

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Danh sách thông tin các primer sử dụng trong phản ứng RPA 14 Bảng 4.1 Kết quả chuẩn đoán bệnh virus trên cây trồng bằng kỹ thuật RPA 16 Bảng 4.2 So sánh kỹ thuật PCR, LAMP và RPA 17

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Virus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất đối với cây trồng Sựxâm nhiễm và lây lan của virus trong cây thường gây ra những thiệt hại đáng kể về năngsuất và chất lượng nông sản Do tính chất nguy hiểm của bệnh virus gây ra với cây trồng

và nền sản xuất nông nghiệp, rất nhiều biện pháp, công nghệ đã được xây dựng và pháttriển phục vụ công tác quản lý, phòng trừ và nâng cao tính kháng bệnh virus ở thực vật.Phục tráng, tạo cây giống sạch virus thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kết hợp với xử

lý nhiệt, lạnh hay hóa chất đã cho thấy hiệu quả tốt và được ứng dụng rộng rãi Ngoài ra,việc sử dụng tính kháng chéo hay quy tụ gen kháng cho thấy tính ưu việt trong nâng caophổ kháng và tính kháng bền vững với bệnh virus Đặc biệt, việc sử dụng các công nghệmới như RPA (Recombinase Polymerase Amplification) đã tạo được những bước tiếnvượt bậc trong nghiên cứu chuẩn đoán bệnh virus trên cây trồng Trong khuôn khổ bàitổng quan này, giới thiệu tóm lược về nguyên lý hoạt động, tính ứng dụng cũng như ưunhược điểm, triển vọng và thách thức đặt ra với việc ứng dụng kỹ thuật RPA trong nghiêncứu chẩn đoán virus thực vật

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu là dựa vào hoạt tính enzyme recombinase và polymerase để chuẩn đoánbệnh virus trên cây trồng một cách tiềm năng bằng sử dụng kỹ thuật RPA (recombinasepolymerase amplification) khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt

1.3 Nội dung thực hiện

Ly trích DNA từ mẫu lá, rễ thân hoặc quả của cây trồng bị bệnh, kỹ thuật RPA, điện di

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về bệnh hại thực vật do virus gây ra

Mặc dù có kích thước rất nhỏ và không thể quan sát dưới kính hiển vi thông thườngnhưng virus là bênh hại phổ biến và gây thiệt hại to lớn trong sản xuất nông nghiệp Virusgây bệnh trên thực vật có sự đa dạng lớn về kích thước, thành phần sinh hóa, cấu trúccũng như độ lớn của hệ gen (Nopsa và ctv, 2014) Bệnh virus có thể lan truyền thông quacác phương thức khác nhau bao gồm sử dụng vector trung gian (côn trùng, nấm, tuyếntrùng, thực vật ký sinh), nhân giống sinh dưỡng, hạt giống, hạt phấn, vết thương cơ giớihay thông qua tiếp xúc trực tiếp Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, hệ gen virus được giảiphòng khỏi lớp vỏ protein (decapsidation) và thực hiện quá trình lây nhiễm thông quaviệc dịch mã và tái bản hệ gen, bao gói các thể virus mới và xâm lấn các cơ quan của thểchủ (Nicaise, 2014) Hầu hết các loại virus gây thiệt hại cho cây trồng là dạng cấp tính,tức là chúng xâm nhiễm vào cây và gây hại ở mức độ cao trong một khoảng thời gian rấtngắn Tuy nhiên, đối với thực vật hoang dại bệnh virus có thể tồn tại duy trì, biểu hiệnchậm hơn và cùng tồn tại lâu dài với tế bào chủ (Roossinck, 2012)

2.1.1 Triệu chứng bệnh virus thực vật

Có 2 loại triệu chứng virus phổ biến: loại triệu chứng xuất hiện do kết quả của lầnxâm nhiễm đầu tiên vào tế bào ký chủ như vết đốm và loại triệu chứng xuất hiện do kếtquả của lần xâm nhiễm thứ sinh hoặc xâm nhiễm có hệ thống, khảm lá Không giốngnấm bệnh, virus chỉ có thể xâm nhập vào tế bào thực vật thông qua các vết thương nhưvết gãy của lông biểu vì, lỗ thủng hoặc các vết trầy xước nhỏ trên tầng biểu bì do côntrùng chích hút gây ra

Triệu chứng ban đầu phát triển từ điểm xâm nhiễm của virus vào tế bào thực vậtđược gọi là triệu chứng cục bộ và thường tạo thành từng vết bệnh có giới hạn gọi là vếtđốm Các vết đốm do virus gây ra thường có kích thước to nhỏ khác nhau, có thể mấtmàu (do mất diệp lục) hoặc hoại tử (nếu tế bào chết) Vết đốm thường biểu hiện rõ saukhi virus theo dòng nhựa xâm nhập vào bề mặt lá hoặc dạng ít phổ biến hơn là sau khicôn trùng chích hút ăn nhựa lá

Trong một số trường hợp, do mối tương quan giữa ký chủ và ký sinh mà viruskhông thể lan rộng ra ngoài điểm xâm nhiễm Lúc đó vết đốm tại điểm xâm nhiễm là

triệu chứng duy nhất quan sát được Loại phản ứng này gọi là phản ứng mẫn cảm Nếuvirus không bị hạn chế bởi phản ứng của cây ký chủ, chúng sẽ lan khắp phần thịt lá Khinhiễm đến hệ thống mạch dẫn, virus sẽ lây lan rất nhanh tới toàn bộ các bộ phận của cây

ký chủ, gây hiện tượng xâm nhiễm thứ sinh hay xâm nhiễm hệ thống Hầu hết các virus

có khả năng di chuyển trong libe Triệu chứng xâm nhiễm thứ sinh hoặc xâm nhiễm hệthống dẫn đến những thay đổi bên ngoài mà mắt thường có thể nhìn thấy được (hiệntượng biến mầu và héo) và những thay đổi bên trong chỉ có thể quan sát được dưới kínhhiển vi điện tử (sự hình thành các tế bào có cấu trúc dị thường)

Triệu chứng khảm lá là hiện tượng những tế bào nhất định trong bộ phận cây bịbệnh bị nhiễm virus và biến màu trong khi các tế bào khác vẫn phát triển bình thường.Các tế bào bị nhiễm virus thường có màu xanh lá cây nhạt do lượng diệp lục bị giảm.Dạng triệu chứng khảm khác nhau tùy thuộc vào các loại cây ký chủ khác nhau Đối vớicác cây một lá mầm, triệu chứng thường xuất hiện dưới dạng khảm sọc hoặc vệt Đối vớicác cây hai lá mầm, các phần biến màu thường có hình tròn và xuất hiện triệu chứng nhưcác vết vằn, lốm đốm, loang lổ, thậm chí gồ ghề

Trong một số trường hợp tương tác giữa virus và cây ký chủ, toàn bộ lá biến vàng

do suy giảm quá trình sản xuất diệp lục và lục lạp bị phá hủy Đây là triệu chứng điểnhình của bệnh vàng lá virus, vàng lá củ cải đường và vàng lùn lúa mạch Hiện tượng vàng

lá bắt đầu từ sự biến vàng của phần mô xung quanh gân lá, phần mô gần hệ thống mạchdẫn có thể vẫn xanh, tương phản với các phần mô khác trên lá Một số virus có thể gâytriệu chứng vàng gân lá và trong gân lá, như trường hợp bệnh gân lớn rau diếp và bệnh

khảm (Turnip mosaic virus).

Đốm vòng là triệu chứng các mô bị bệnh bị giới hạn thành từng vòng các tế bào nhiễmvirus Các tế bào nhiễm virus có thể biến màu hoặc chết hoại Các vòng có thể tập trunglại dưới dạng vòng tròn đồng tâm Đốm vòng có thể xuất hiện trên thân và quả mặc dù

phổ biến nhất là trên lá Một số virus gây đốm vòng: Virus đốm héo cà chua Tomato

spotted wilt virus (TSWV) và virus đốm vòng đu đủ Papaya ringspot virus (PRSV).

Tế bào hoại tử có thể tập trung thành các đốm cục bộ xung quanh điểm xâm nhiễmhoặc tập trung một cách hệ thống trong các phần được bảo vệ khác của cây bệnh như quả,hạt hoặc lá Virus khảm lá turnip gây ra các đốm hoại tử ở các lớp lá cải bắp phía trong.Hiện tượng giảm kích thước cây bệnh (lùn, còi cọc) là triệu chứng khá phổ biến dovirus gây ra, thường xuất hiện cùng với các triệu chứng khác Hiện tượng còi cọc có thể

xảy ra trên toàn bộ cây bệnh hoặc chỉ giới hạn ở những bộ phận nhất định của cây nhưđỉnh sinh trưởng Triệu chứng này thường khó nhận thấy, trừ khi cây bị nhiễm virus pháttriển ngay bên cạnh cây khỏe.

Virus khảm lá đậu (Bean common mosaic virus) và virus đốm vòng dâu tây (Strawberry latent ringspot virus) là những ví dụ về virus gây hiện tượng cây bệnh phát

triển không bình thường (lá và thân biến dạng) Sự phát triển không bình thường xảy ra

do sự mất cân bằng hormon trong lá Ngoài ra sự biến dạng và phát triển không bìnhthường còn biểu hiện bằng sự tăng quá nhanh số lượng tế bào, ví dụ virus sưng chồi

cacao Cacao swollen shoot virus Sự tăng nhanh về số lượng tế bào được gọi là hiện

tượng hyperplasia; sự tăng nhanh về kích thước tế bào gọi là hiện tượng hypoplasia Hiệntượng lõm trên thân cành cam quýt do virus tristeza hại cây có múi gây ra

Một số virus gây hiện tượng tăng trưởng quá nhanh tạo thành u bướu trên lá và rễ;

Sự phát triển quá nhanh trên lá tạo các mấu lồi như mụn cơm ở cả mặt trên và mặt dưới

của lá cây bệnh Virus khảm biến dạng đậu Pea enation mosaic virus (PEMV) gây hiện

tượng u lồi trên lá Giống như hiện tượng biến dạng thân và lá, u bướu là kết quả của sựmất cân bằng về hormon, gây hiện tượng tăng nhanh đột biến của tế bào

Hiện tượng biến mầu cánh hoa tulip là một trong những bệnh virus đầu tiên được

mô tả vào thế kỷ 17 Bệnh do virus khảm lá tulip gây ra, hoa tulip xuất hiện các đốm màusắc khác nhau Củ cây hoa tulip nhiễm virus được người trồng hoa ở Hà Lan rất quý,thậm chí bệnh vẫn được khai thác cho đến ngày nay Virus khảm turnip và virus khảmvàng đậu có thể gây hiện tượng đột biến màu trên hoa lay ơn Virus có thể gây triệu

chứng méo mó quả, quả ít và nhỏ Virus khảm lá dưa chuột (Cucumber mosaic virus) gây

triệu chứng quả nhỏ và biến dạng Tương tự, virus khảm lá rau diếp làm giảm quá trìnhtạo hạt, phấn hoa bất thụ và suy yếu

Ngoài ra virus còn gây ra những biến đổi về mô và tế bào, thể vùi được hình thành

do tác động của virus Một số virus ký sinh trong nhân tế bào thực vật Nhiều virus làmbiến đổi lục lạp, phần lớn trong số đó làm suy giảm hệ thống sinh hóa, cấu trúc tế bào dẫnđến hiện tượng mất màu sắc và biến đổi hình dạng Các thay đổi khác về mô bao gồm sựtăng hoặc giảm số lượng tế bào, chết hoại tế bào bên trong, sự hóa gỗ, thoái hóa và chếtcủa tế bào libe Virus có thể tích lũy với số lượng lớn trong tế bào tạo thành các thể vùi.Thể vùi có thể được hình thành trong nhân nhưng phổ biến nhất là trong tế bào chất

Virus trong thể vùi được sắp xếp cạnh nhau, nối đuôi nhau hoặc chồng lên nhau theokhông gian ba chiều.

Nếu cây không xuất hiện triệu chứng không có nghĩa là không nhiễm virus Virus

có khả năng xâm nhiễm những ký chủ nhất định và nhân lên trong tế bào ký chủ màkhông biểu hiện triệu chứng Xâm nhiễm tiềm tàng khá phổ biến đối với các thực vậthoang dại và cỏ dại Virus có thể tồn tại trên ký chủ trung gian và tái xâm nhiễm cây trồngsau một thời gian với sự giúp đỡ của côn trùng chích hút môi giới

Sự phát triển của triệu chứng phụ thuộc vào virus và mức độ độc của gen Bản thâncây ký chủ có thể kháng bệnh, dễ nhiễm bệnh hoặc dung nạp bệnh Tương tự, tuổi cây vàthời gian xâm nhiễm đóng vai trò quan trọng trong việc biểu hiện triệu chứng Nhìnchung, cây càng non thì càng dễ nhiễm bệnh và cây càng già càng dễ dung nạp bệnh.Thời điểm xâm nhiễm càng sớm càng thiệt hại về năng suất nhiều hơn so với thời điểmxâm nhiễm muộn

Triệu chứng bệnh virus thường phát triển chậm trong điều kiện nhiệt độ cao bởi vì

ở điều kiện này virus thường sinh sản chậm Tuy nhiên, nhiệt độ cao cũng có thể làmgiảm khả năng kháng bệnh của ký chủ và vì thế, khi nhiệt độ hạ xuống, quá trình xâmnhiễm thường diễn ra rất nhanh Cây phát triển trong điều kiện cường độ ánh sáng lớnthường ít mẫn cảm với bệnh hơn là trong điều kiện ánh sáng yếu Cây trồng trên đất giàudinh dưỡng thường mẫn cảm với bệnh hơn là trong môi trường nghèo dinh dưỡng Hàmlượng nitơ cao có thể làm tăng khả năng nhiễm bệnh của cây

2.1.2 Thiệt hại do virus trên cây trồng

Sự xâm nhiễm và lây lan của virus với cây trồng thường gây ra những thiệt hại đáng

kể về năng suất và chất lượng nông sản Theo thống kê của Ủy ban Quốc tế về Phân loại

Hình 2.1 Triệu chứng bệnh virus (từ trái qua phải): vòng biến mầu, đốm vòng và

khảm lá

Virus (The International Committee for the Taxonomy of Viruses), hiện nay đã có trên6.500 loài virus được phát hiện, trong đó có khoảng trên 1.516 loài là virus thực vật(King và ctv, 2011) Việc phát hiện và điều trị các bệnh virus thực vật thường khó khăn

và hiệu quả không cao (Jones và Barbetti, 2012; Nopsa và ctv, 2014) Theo ước tính,hàng năm thiệt hại do bệnh virus gây ra với sản xuất nông nghiệp trên thế giới lên đếntrên 30 tỷ đô la Mỹ (Sastry và Zitter, 2014)

2.2 Kỹ thuật RPA (Recombinase Polymerase Amplification)

Do tính chất nguy hiểm của bệnh virus gây ra với cây trồng và nền sản xuất nôngnghiệp, rất nhiều biện pháp, công nghệ đã được xây dựng và phát triển phục vụ công tácquản lý, phòng trừ và nâng cao tính kháng bệnh virus ở thực vật Trong đó, các phươngpháp truyền thống đã được phát triển và ứng dụng từ rất lâu như nuôi cấy đỉnh sinhtrưởng, xử lý hóa chất, xử lý lạnh, xử lý nhiệt… (Lassois và ctv, 2012) Các biện phápnày giúp loại trừ các mầm bệnh virus và tạo nguồn nguyên liệu sạch bệnh phục vụ côngtác nhân giống và ứng dụng sản xuất Bên cạnh đó, các biện pháp sử dụng tính khángchéo (Gal-On và Shiboleth, 2006) hay việc quy tụ các gen kháng (Ratcliff và ctv, 1999)cũng mang lại những thành công đáng kể trong việc mở rộng và nâng cao tính khángvirus ở cây trồng

Gần đây, với các thành tựu của công nghệ sinh học, các công nghệ mới đã đượcphát triển và tạo ra những bước tiến vượt bậc trong công tác chọn tạo giống cây trồngkháng lại bệnh virus Kỹ thuật RPA (Recombinase Polymerase Amplification) đã phá vỡrào cản trong việc phát hiện và xác định virus gây hại với độ chính xác cao và thời giannhanh chóng, tạo điều kiện để kiểm soát bệnh tật hiệu quả hơn trong quá trình sản xuất.Việc áp dụng các kỹ thuật chỉnh sửa gen như CRISPR-Cas9, cũng như các phương phápchuyển gen, đã mở ra khả năng tạo ra các giống cây trồng kháng virus mạnh mẽ và bềnvững, giúp nâng cao năng suất và giảm thiểu sự ảnh hưởng của bệnh virus đối với nềnnông nghiệp

2.2.1 Nguyên lý hoạt động

Để xác định trình tự mục tiêu, RPA yêu cầu 2 mồi oligonucleotide được thiết kế đơngiản (có thể cần thêm 1 probe) để phản ứng bắt cặp xảy ra Đầu tiên, enzymerecombinase được sử dụng để liên kết với mồi tạo thành phức hợp nucleoproteinrecombinase Phức hợp nucleoprotein này sẽ trượt và tìm kiếm trình tự tương đồng trênphân tử ADN mạch kép để hình thành cấu trúc D-loop Trong khi đó, một phân tử proteinbám sợi đơn ADN (single- stranded ADN-binding protein, SSB) sẽ bám và ổn định mạch

bổ sung Cuối cùng, enzyme polymerase bắt đầu tổng hợp sản phẩm theo hướng từ vị trímồi bắt cặp đến đích

Hình 2.2 Các bước cơ bản của chu trình RPA.

Hầu hết các kit thương mại hiện nay đều sử dụng enzyme recombinase RecA từEscherichia coli và enzyme Sau DNA polymerase từ Staphylococcus aureus Bên cạnh

đó, protein T4 UvsY hỗ trợ sự hình thành phức hợp nucleoprotein, polyethylene glycol làdung môi nhằm tăng cường khả năng tương tác giữa các thành phần phản ứng với phân

tử ADN Enzyme creatine kinase xúc tác quá trình tạo ATP từ phosphocreatine để cungcấp năng lượng cho hoạt động của các enzyme khác Đến nay, một số hợp chất cần thiếtcũng được bổ sung vào kit nhằm tối ưu hóa tính đặc hiệu và khả năng nhân đoạn trình tự