Tài liệu ôn thi chẩn đoán bệnh thực vật thầy Quốc

Bệnh cây trồng Plant diseasesi Tình trạng bất thuờng => Thay đổi hình dạng ngoài / chức năng trong của cây ii Quá trình sinh trưởng => ảnh hưởng chức năng thực vật iii Tác hại: giảm năn

TỔNG QUAN

1 Khái niệm bệnh học thực vật

i) Phytopathology: từ Hy lạp

ii) Một nhánh khoa học nông nghiệp

iii) Thưc vật hoặc sinh học liên quan tới việc nghiên cứu nguyên nhân, hậu quả thiệt hại và quản lí/ kiểm soát bệnh cây trồng

Phyton + Pathos + Logos

Thực vật bệnh tật học tập

2 Mục tiêu: nghiên cứu

i) Nguyên nhân sinh học, phi sinh học và môi trường gây bệnh

ii) Cơ chế phát bệnh

iii) Tương tác giữa TV và mầm bệnh

iv) Phát triển phương pháp quản lý/ kiểm soát cây trồng

3 Lịch sử phát triển

i) Cổ đại (Ancien): ancient – 475 AD

ii) Tăm tối (Dark) : 476 AD - 1600

iii) Phục hưng (Renaissance): 1600 – 1853 iv) Hiện đại (Modern): 1853 – 1906

v) Hiện tại (Now) : 1906 - now

4 Bệnh cây trồng ( Plant diseases)

i) Tình trạng bất thuờng => Thay đổi hình dạng (ngoài) / chức năng (trong) của cây ii) Quá trình sinh trưởng => ảnh hưởng chức năng thực vật

iii) Tác hại: giảm năng suất và chất lượng sản phẩm

5 Bệnh (Diseases):

i) Quá trình/ sự thay đổi theo thời gian ko xảy ra ngay lập tức⬄

ii) Triệu chứng: ảnh hưởng trên cây trồng có thể nhìn thấy

(màu, hình dạng, chức năng khi phản ứng với mầm bệnh)

iii) Dấu hiệu: bằng chứng vật lý của mầm bệnh

( quả thể nấm, dịch khuẩn)

7 Nguyên nhân bệnh

i) Bị VSV tấn công và lấy chất dinh dưỡng

ii) Mầm bệnh: sinh vật ký sinh gây bệnh; 4 loại: nấm, VK, virrus, tuyến trùng

iii) Vật chủ: cây bị kí sinh

6 Môi trường:

i) cực kì quan trọng

ii) Ko có mt thuận lợi dù cây có bị tổn

thương khi tiếp xúc lượng lớn mầm bệnh

cũng không phát bệnh

i Nấm

i) Đa số có lợi

ii) hầu hết ko nhìn được => cần KHV

iii) Cấu trúc gồm các sợi nấm => sinh

iii Virus

i) Quen thuộc nhất

ii) Ko pải hệ thống hoàn chỉnh

iii) Chỉ có trrong tế bào sống

iv) Truyền qua: côn trùng or vector

vi Triệu chứngvii Sản xuất mầm bệnh mới

Lý do cần chuẩn đoán

i) Vượt qua đại dịch

ii) Giảm tổn thất năng suất

Kỹ thuật truyền thống

i) Quan sát trực quanii) Sử dụng KHV

iii) nuôi cấy

Hạn chế

Nguy cơ bị nhiễm (Latent infection) : Thối vòng khoai tây

Nhiễm trùng gây nhầm lẫn (Misleading infection): Vết bệnh đen (alternaria) và bệnh bạc lá do vi khuẩn ở cà rốt (Xanthomonas)

Đồng nhiễm (Co-infecton): Thay đổi triệu chứng

PCR

1 Lịch sử phát triển

1983: Tiến sĩ Kary Mullis phát triển PCR

1985: Công bố PCR đầu tiên của Tập đoàn

Cetus xuất hiện trên tạp chí Science

1986 : Taq polymerase tinh khiết lần đầu tiên

được sử dụng trong PCR

1988: PerkinElmer giới thiệu máy luân nhiệt

tự động

1989: Khoa học tuyên bố Taq polymerase:

phân tử của năm”

1990: Khuếch đại và phát hiện các trình tự DNA

cụ thể bằng cách sử dụng thuốc nhuộm liên kết DNA huỳnh quang, đặt nền tảng cho PCR “thời gian thực” hoặc “động học” trong tương lai

1991: RT-PCR được phát triển bằng cách sử dụng một loại polymerase ổn định nhiệt, rTth, tạo điều kiện thuận lợi cho các xét nghiệm chẩn đoán virus RNA

1993: Tiến sĩ Kary Mullis nhận giải Nobel Hóa học cho việc hình thành công nghệ PCR

2 Khái niệm PCR

i) Lấy chuỗi DNA cụ thể với số lượng

nhỏ và khuếch đại nó để sử dụng cho

các xét nghiệm tiếp theo

ii) Kỹ thuật in vitro

3 Mục đích

Khuếch đại nhiều phân tử DNA sợi đôi (đoạn) có cùng kích thước và

trình tự bằng phương pháp enzyme

và điều kiện chu trình

4 Khía cạnh quan tâm

i) Độ chuyên biệt ( Specificity)

ii) Độ hiệu quả ( Efficienty)

iii) Độ tin cậy (Fidelity)

5 Yêu cầu cơ bản

i) Trình tự DNA mục tiêuii) Mồi

iii) DNA polymeraseiv) Máy PCR

4 Quy trình

Biến tính: (Denaturation of ds DNA template)

Gắn kết : (Annealing of primers)

Mở rộng – Kéo dài Extension of ds DNA molecules

Sản phẩm

6 Bỏ mồi cũ không hiệu quả và

thiết kế bộ mồi mới

Realtime PCR

qPCR

1 Lịch sử phát triển

Higuchi và cộng sự (1993): nhận ra rằng quá trình PCR có thể được theo dõi bằng cách thêm

nhãn huỳnh quang liên kết với sản phẩm PCR tích lũy Khi nồng độ sản phẩm PCR tăng thì cường độ tín hiệu huỳnh quang cũng tăng.

Họ đã sử dụng EtBr (Ethidium Bromide) để phát hiện Khám phá này đã mở đường cho

phương pháp PCR thời gian thực định lượng hiện đại (qPCR) Khi EtBr liên kết với DNA sợi đôi

và bị kích thích bởi tia UV, nó sẽ phát huỳnh quang

1966 – Phương pháp phát hiện Taqman được sử dụng thay cho EtBr để phát

hiện sương muối thực sự trong PCR

2 Khái niệm

i) PCR nâng cấp ⬄ Roche, Inc, đã nâng cấp

ii) Sự tích lũy sản phẩm được đo/ hình dung theo thời gian thực, sau mỗi phản ứng

nghiệm tiếp theo => Xác định số lượng trình tự gen mục tiêu

3 Nguyên lí

i) Theo dõi bằng đọc cường độ huỳnh quang sau mỗi chu kỳ

ii) Cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với lượng sản phẩm tạo ra

iii) Nhiều mục tiêu ban đầu => nhiều tín hiệu huỳnh quang hơn

4 Một số định nghĩa

1 Đường cơ sở (baseline) = Mức huỳnh quang cơ bản được xác định trong chu

kỳ PCR ban đầu

2 Ngưỡng (Threshold) = Mức huỳnh quang cố định được đặt trên đường cơ sở

3 Rn = tín hiệu báo cáo đã chuẩn hóa, mức huỳnh quang được phát hiện trong quá trình PCR Được tính bằng cách chia tín hiệu nhuộm của đầu dò cho tín hiệu tham chiếu thụ động (ROX)

4 Ct = chu kỳ ngưỡng, chu kỳ PCR tại đó sự gia tăng huỳnh quang của người báo cáo trên tín hiệu cơ bản lần đầu tiên được phát hiện (chu kỳ khi huỳnh quang vượt qua ngưỡng)

SYBR Green

i) Nhuộm xen kẽ ds DNA ⬄

ii) Nhạy hơn EtBr

Thuận:

i) Dễ sản xuất ii) Rẻ Ko cần đầu dò ⬄ iii) An toàn

Nhược

i) Ko đặc hiệu ii) Tăng nền iii) Ức chế PCR

6 Đường cong nóng chảy

• Đường cong nóng chảy biểu thị sự thay đổi huỳnh quang được quan sát thấy khi dsDNA với các phân tử thuốc nhuộm kết hợp “tan chảy” thành ssDNA khi nhiệt độ của phản ứng tăng lên

• Khi DNA sợi đôi liên kết với thuốc nhuộm SYBR Green I được làm nóng, huỳnh quang giảm đột ngột được phát hiện khi đạt đến điểm nóng chảy Tm

• Sự phát huỳnh quang được vẽ theo nhiệt độ, và sau đó – ΔF/ ΔT (sự thay đổi

huỳnh quang/sự thay đổi nhiệt độ) được vẽ theo nhiệt độ để có cái nhìn rõ ràng về động lực nóng chảy

Taqman Probe

i) Mồi + 2 đầu dò huỳnh quang => xác định độ đặc hiệu

Có hai thuốc nhuộm huỳnh quang được đính kèm:

1 Reporter (R) 5’: phát huỳnh quang; 6-FAM; VIC; TET; HEX,JO; ROX

2 Quenher (Q) 3’ : hấp thu huỳnh quang: TAMRA

ii) Lai với mục tiêu

iii) phát huỳnh quang trong 520 – 660 nm

iv) Dùng vs multiplex PCR

qRT PCR

1 Phân loại

i) Định lượng tuyệt đối: nó xác định mức biểu hiện theo số lượng bản sao tuyệt

đối, sử dụng đường cong hiệu chuẩn

ii) Định lượng tương đối: nó xác định sự thay đổi lần lượt trong biểu thức giữa hai

mẫu

Thu thập dữ liệu trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân

THỜI GIAN THỰC: có thê ghi nhận

khuếch đại trong thời gian thực

CẦN ÍT RNA HƠN

2 Ưu điểm

NHANH CHÓNG: không xử lý hậu

PCR như chạy điện di, chụp ảnh gel

HỢP LÝ: Phát hiện có khả năng thay

đổi gấp 2 lần

ỨNG DỤNG

1 Phân tích biểu hiện gen

2 Phát hiện gen đột biến

3 Đo được số copy gene

4 Phát hiện tác nhân gây bệnh và định lượng

5 Phân tích đa hình dựa trên NSP

Gồm 4 giai đoạn

1 Pha nền tuyến tính (Linear ground

phase): trong pha đầu tiên, PCR mới

bắt đầu, tín hiệu huỳnh quang chưa

vượt lên trên nền

2 Pha hàm mũ sớm (Early

exponential phase) : pha thứ hai là nơi

tín hiệu huỳnh quang chỉ tăng đáng kể

so với nền, chu kỳ xảy ra được gọi là

ngưỡng chu kỳ (Ct)

3 Pha hàm mũ tuyến tính (pha log):

Pha hàm mũ tuyến tính, PCR đang ở giai đoạn khuếch đại tối ưu với số lượng sản phẩm PCR nhân đôi trong mỗi chu kỳ

4 Pha ổn định (Plateau phase): Pha

cuối cùng là khi cơ chất cạn kiệt và Taq DNA polymerase hết tuổi thọ, tín hiệu huỳnh quang sẽ không còn tăng

Loop mediated isothermal

amplification

• LAMP – LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION: sự khuếch đại ADN ở

điều kiện đẳng nhiệt thông qua cấu trúc vòng hay móc (loop)

• Sử dụng 4 mồi (primer) khác nhau được thiết kế đặc biệt nhận ra 6 đoạn riêng biệt

phản ứng thay thế mạch.

• Khuếch đại và phát hiện gene có thể được hoàn thành chỉ trong 1 bước bằng cách ủ hỗn hợp mẫu, primers, DNA polymerase có hoạt tính thay thế mạch và chất nền

ở nhiệt độ cố định (khoảng 65°C)

trong thực phẩm, môi trường,…

Phản ứng