Lí thuyết chẩn Đoán bênh thực vật bằng shpt

Trình tự đoạn mồi để thực hiện phản ứng LAMP.. Cơ chế gây bệnh héo rũ của vi khuẩn Ralstonia solanacearum Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua các vết thương hoặc lỗ khí, sau đó tấn công mạch d

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH HỌC

PHÂN TỬ

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

PGS TS NGUYỄN BẢO QUỐC NGUYỄN QUỐC TRỌNG – 21126557

PHẠM NHẬT TRƯỜNG – 21126562NGUYỄN VĂN TÂN – 21126493CAO MINH TRỰC – 21126559

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Bệnh héo rũ trên cây cà chua 1

1.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn Ralstonia solanacearum 1

1.1.2 Cơ chế gây bệnh héo rũ của vi khuẩn Ralstonia solanacearum 2

1.2 Tầm quan trọng của chẩn đoán nhanh bệnh héo rũ trên cà chua 2

1.3 Kỹ thuật LAMP và ứng dụng trong chẩn đoán vi khuẩn thực vật 3

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

2.1 Chuẩn bị DNA bộ gen và plasmid pUC57-hrpB 4

2.2 Thiết kế và tổng hợp crRNA(crispr RNA ) Cas12a 4

2.3 Xác minh hoạt động cắt xuyên gen Cas12a 5

2.3 Xét nghiệm LAMP 6

2.4 Xét nghiệm huỳnh quang LAMP/Cas12a 6

2.6 Xét nghiệm dòng chảy bên LAMP/Cas12a (LFA: lateral flow assay) 7

2.5 Xét nghiệm LAMP/Cas12a đối với các mẫu bị nhiễm tự nhiên 8

2.6 Phân tích thống kê 9

2.7 Kết quả 9

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 10

3.1 Độ nhạy và đặc hiệu của kỹ thuật LAMP 10

3.2 So sánh với các phương pháp truyền thống 11

3.3 Ứng dụng thực tiễn trên mẫu cà chua 12

3.4 Kết luận và đề xuất 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO 15

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

RS : Ralstonia solanacearum

R solanacearum: Ralstonia solanacearum

PAM: protospacer adjacency motif

DsDNA: double-stranded DNA

CrRNA: crispr RNA

TZC : Tripheny tetrazolium chloride

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Bảng so sánh LAMP và các kỹ thuật truyền thống 11 Bảng 3.2 Bảng biểu biễn tên mồi, trình tự mồi, mục tiêu và phương pháp LAMP 14

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Kết quả giải trình tự cho plasmid tái tổ hợp pUC57-hrpB 4 Hình 2.2 Trình tự đoạn mồi được thế kế trên rgenome 5 Hình 2.3 Trình tự đoạn mồi để thực hiện phản ứng LAMP

Hình 2.4 Các chủng được sử dụng để thử độ đặc hiệu của phản ứng.7

Hình 2.5 Trình tự mồi thực hiện phản ứng qPCR

Hình 2.6 Kết quả phản ứng trên phần mền ImageJ

Hình 2.7 Bảng biểu biễn tên mồi, trình tự mồi, mục tiêu và phương pháp LAMP

Hình 2.8 Bảng biểu biễn tên mồi, trình tự mồi, mục tiêu và phương pháp LAMP

Hình 2.9 Bảng biểu biễn tên mồi, trình tự mồi, mục tiêu và phương pháp LAMP

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Bệnh héo rũ trên cây cà chua

Bệnh héo rũ vi khuẩn trên cây cà chua là một bệnh nghiêm trọng do vi khuẩn

Ralstonia solanacearum (RS) gây ra RS là một vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, không tạo

bào tử, thuộc ngành Pseudomonadota, lớp Betaproteobacteria (Yabuuchi và ctv, 1995).

Đây là một trong mười tác nhân gây bệnh thực vật do vi khuẩn hàng đầu trên thế giới(Mansfield và ctv, 2012), gây thiệt hại nặng nề cho ngành nông nghiệp ở nhiều quốc gia

Vi khuẩn xâm nhập qua các vết thương trên rễ hoặc thân cây và lan truyền trong

mạch dẫn (xylem), gây tắc nghẽn và tiết ra các độc tố làm cây bị héo rũ Triệu chứng phổ

biến bao gồm lá héo vào ban ngày và phục hồi vào ban đêm ở giai đoạn đầu Khi bệnhtiến triển, cây bị vàng lá, chết dần và xuất hiện dịch trắng đục khi cắt ngang thân (Prior &Fegan, 2005) Vi khuẩn này có thể tồn tại trong đất nhiều năm, tạo nên một vòng lâynhiễm qua nước tưới, dụng cụ làm vườn, hạt giống, và côn trùng môi giới

Vì vậy, việc phát hiện nhanh chóng và chính xác bệnh do RS là yếu tố quan trọngtrong quản lý dịch bệnh, giúp ngăn chặn sự lây lan và giảm thiểu thiệt hại kinh tế Kỹthuật LAMP đã được phát triển để hỗ trợ phát hiện RS nhanh chóng với độ nhạy và đặchiệu cao (Notomi và ctv, 2000; Kubota và ctv, 2011) Điều này mang lại tiềm năng lớncho các ứng dụng thực địa trong nông nghiệp

1.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Ralstonia solanacearum là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng di động nhờ

roi đơn cực, thuộc họ Burkholderiaceae Vi khuẩn này hiếu khí, không tạo bào tử và

được biết đến là một trong những tác nhân gây bệnh thực vật nguy hiểm nhất trên toàn

cầu (Yabuuchi và ctv, 1995; Mansfield và ctv, 2012) R solanacearum có phổ ký chủ

rộng, ảnh hưởng đến hơn 200 loài cây trồng, bao gồm cà chua, khoai tây, ớt và chuối,nhưng đặc biệt gây hại nghiêm trọng trên cây cà chua, làm giảm năng suất đáng kể(Hayward và ctv, 1991)

Khả năng sinh tồn mạnh mẽ của R solanacearum trong đất và nước khiến nó trở

thành một mối đe dọa lâu dài Vi khuẩn này có thể tồn tại trong các lớp đất sâu và môitrường nước ở trạng thái tiềm ẩn trong nhiều tháng hoặc thậm chí nhiều năm (Prior &Fegan, 2005) Sự lây lan chủ yếu xảy ra qua nước tưới, các dụng cụ nông nghiệp bịnhiễm khuẩn hoặc qua rễ bị tổn thương Đặc biệt, điều kiện môi trường nóng ẩm là yếu tố

thúc đẩy sự phát triển và bùng phát dịch bệnh của R solanacearum (Kelman và ctv,

1954)

Đặc điểm di động của vi khuẩn nhờ roi đơn cực giúp R solanacearum dễ dàng di

chuyển trong môi trường nước và đất, xâm nhập nhanh chóng vào cây chủ qua các vết

thương hoặc lỗ khí, dẫn đến tắc nghẽn mạch dẫn (xylem), từ đó gây ra các triệu chứng

héo rũ kinh điển trên cây

1.1.2 Cơ chế gây bệnh héo rũ của vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua các vết thương hoặc lỗ khí, sau đó tấn công mạch

dẫn (xylem), gây tắc nghẽn dòng chảy của nước và dinh dưỡng, dẫn đến hiện tượng héo

rũ Trong quá trình gây bệnh, Ralstonia solanacearum tiết ra các enzyme ngoại bào, độc

tố và polysaccharides, phá hủy cấu trúc tế bào và làm tổn thương nghiêm trọng cây chủ.Triệu chứng lâm sàng ban đầu của bệnh là lá cây bị héo vào ban ngày nhưng có thể phụchồi vào ban đêm

Tuy nhiên, khi bệnh tiến triển, tình trạng héo rũ trở nên vĩnh viễn, cây bị chết khô.Khi cắt ngang thân cây, có thể quan sát thấy dịch trắng đục chảy ra, đây là dấu hiệu đặc

trưng của sự nhiễm bệnh do R solanacearum (Hayward và ctv, 1991; Prior & Fegan,

2005) Dịch tiết này chủ yếu là do vi khuẩn tiết ra các polysaccharides và các chất lỏnggây tắc nghẽn mạch dẫn và kích thích sự phát triển của bệnh

1.2 Tầm quan trọng của chẩn đoán nhanh bệnh héo rũ trên cà chua

Chẩn đoán nhanh bệnh héo rũ trên cà chua do Ralstonia solanacearum là yếu tố

then chốt trong việc quản lý và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả Việc phát hiện sớm bệnhcho phép nông dân xác định kịp thời những cây bị nhiễm bệnh, từ đó thực hiện các biệnpháp cách ly và xử lý nhanh chóng, ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn sang những câykhỏe mạnh khác trong vườn Điều này giúp giảm thiểu thiệt hại về năng suất và giảmthiểu thiệt hại kinh tế cho nông dân (Hayward và ctv, 1991; Prior & Fegan, 2005)

Điều này không chỉ giảm thiểu thiệt hại về năng suất và kinh tế cho nông dân màcòn hỗ trợ hạn chế việc sử dụng thuốc hóa học một cách không cần thiết, góp phần giảm

ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khỏe con người Hơn nữa, thông tin chẩn đoán chínhxác về sự xuất hiện và lây lan của bệnh là cơ sở để các cơ quan quản lý dịch hại triển khaicác biện pháp phòng ngừa và kiểm soát hiệu quả trên diện rộng, từ đó nâng cao hiệu quảquản lý dịch bệnh trong nông nghiệp

1.3 Kỹ thuật LAMP và ứng dụng trong chẩn đoán vi khuẩn thực vật

Kỹ thuật LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) là một phương phápkhuếch đại DNA hiện đại, thực hiện ở nhiệt độ đẳng nhiệt khoảng 60–65°C mà khôngcần chu kỳ nhiệt như trong PCR Phương pháp này sử dụng enzyme Bst polymerase vàmột bộ 4 – 6 mồi đặc hiệu để nhận diện và khuếch đại DNA mục tiêu Cơ chế hoạt độngcủa LAMP dựa vào việc bộ mồi đặc hiệu nhận diện 6 – 8 vùng trên gene mục tiêu, từ đótạo ra sản phẩm DNA dạng vòng lặp đặc trưng, giúp tăng cường khả năng khuếch đại(Notomi và ctv, 2000)

Sản phẩm DNA sau khi khuếch đại có thể được phát hiện bằng cách quan sát trựcquan qua sự thay đổi màu sắc khi dùng các thuốc nhuộm như SYBR Green I, phenol redhoặc calcein (Mori và ctv, 2001), hoặc qua phương pháp điện di gel agarose để xác nhậnkích thước sản phẩm Kỹ thuật này mang nhiều ưu điểm nổi bật, bao gồm tốc độ thựchiện nhanh (khoảng 30–60 phút), yêu cầu thiết bị đơn giản (máy ủ nhiệt hoặc bể nước),giúp dễ dàng triển khai ngay tại hiện trường (Parida và ctv, 2004) Đặc biệt, LAMP có độnhạy và đặc hiệu cao, khả năng phát hiện DNA ở nồng độ cực thấp khoảng 10 fg/µL,điều này làm cho nó trở thành công cụ lý tưởng cho chẩn đoán nhanh và chính xác, nhất

là trong các ứng dụng nông nghiệp để phát hiện các bệnh cây trồng như bệnh héo rũ do

Ralstonia solanacearum (Lu và ctv, 2017).

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Chuẩn bị DNA bộ gen và plasmid pUC57-hrpB

Các chủng RS được cấy lên thạch TZC (peptone 10,0 g/L, glucose 5,0 g/L, caseinthủy phân 1,0 g/L, thạch 18,0 g/L, tetrazolium chloride 0,5 g/L) và ủ trong 48 giờ ở 30°C.Các khuẩn lạc đơn lẻ có vẻ ngoài nhầy nhụa, giống sữa và phần giữa màu hồng đượcchuyển vào môi trường NB (glucose 10,0 g/L, pepton 5,0 g/L, chiết xuất nấm men 0,5g/L, chiết xuất thịt bò 3,0 g/L) và ủ trong 24 giờ ở 30°C, 180 vòng/phút Các vi khuẩnkhác được nuôi cấy trong môi trường LB (peptone 10,0 g/L, chiết xuất nấm men 5,0 g/L,NaCl 10,0 g/L) trong 24 giờ ở 28°C, 180 vòng/phút DNA bộ gen được chiết xuất và tinhchế bằng bộ dụng cụ DNA vi khuẩn TIANamp theo hướng dẫn của nhà sản xuất Mộtđoạn 215-bp của RS hrp B gen được tổng hợp, liên kết với vector pUC57 để thu đượcplasmid tái tổ hợp pUC57-hrpB( để làm đối chứng dương) và được giải trình tự bởi Công

ty Công nghệ sinh học Tsingke (Vũ Hán) pUC57-hrpBđược sử dụng làm đối chứngdương trong các thí nghiệm tiếp theo

DNA plasmid được chiết xuất bằng Bộ dụng cụ GeneJET Plasmid Miniprep(Thermo Fisher) Nồng độ DNA được xác định bằng cách đo độ hấp thụ (máy quang phổNanoDrop One, Thermo Fisher)

2.2 Thiết kế và tổng hợp crRNA(crispr RNA ) Cas12a

Trình tự CrRNA được thiết kế trực tuyến (www.rgenome.net) dựa trên họa tiếtliền kề của (protospacer adjacency motif) PAM (TTTV) củahrp B gen Bốn crRNA cóđiểm số cao đã được chọn làm ứng viên

Hình 2.1 Kết quả giải trình tự cho plasmid tái tổ hợp pUC57-hrpB.

Đối với quá trình chuẩn bị crRNA, oligo DNA (100 µM), T7- croligo(cr là crispr)(chứa promoter T7, trình tự hướng dẫn và trình tự khung crRNA) và T7-top đã được tổnghợp bởi Tsingke Biotechnology Đối với quá trình ủ DNA sợi đôi (dsDNA), T7-cR-oligo(100 μM) và T7-top (100 μM) đã được biến tính ở 95°C trong 5 phút, giữ ở nhiệt độphòng trong 1 giờ và dsDNA ủ được sử dụng làm khuôn mẫu phiên mã CrRNA đượctổng hợp từ dsDNA ủ bằng cách ủ trong 16 giờ ở 37°C.

Sử dụng Bộ tổng hợp RNA năng suất cao HiScribe T7 CrRNA phiên mã được tinh chếbằng Bộ làm sạch RNA Monarch (New England Biolabs; Bắc Kinh), phân tích bằng điện

di gel và lưu trữ ở -80°C

2.3 Xác minh hoạt động cắt xuyên gen Cas12a

PCR khuếch đại toàn bộ chiều dài hrp B gen (825 bp) được thực hiện trong hỗn hợp phản ứng 50 μL Sử dụng cặp mồi RS hrp b F/ RS hrp b R (10 μM, 2 μL), 25 μL PrimeSTAR HS (Premix), 100 ng mẫu DNA, tổng thể tích 50 μL bằng cách thêm nướckhông có RNase

Chương trình: 98°C trong 5 phút; 35 chu kỳ 98°C trong 10 giây, 55°C trong 10giây, 72°C trong 50 giây; 72°C trong 5 phút Sản phẩm PCR thu được được phân tíchbằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%

Để đánh giá khả năng của một crRNA đối tượng trong việc kích hoạt hoạt độngcắt xuyên LbaCas12a, chúng tôi đã sử dụng một hệ thống xét nghiệm có chứa FQreporter (5′FAM-TTATT-3′BHQ1),hrp B sản phẩm PCR gen, LbaCas12a và crRNA

Hình 2.2 Trình tự đoạn mồi được thế kế trên rgenome.

Hình 2.3 Trình tự đoạn mồi để thực hiện phản ứng LAMP.

tinh khiết FQ-reporter bao gồm chất huỳnh quang FAM và chất khử được tổng hợp bởiTsingke Biotechnology Một hệ thống hỗn hợp (30 μL) chứa 1× NEBuffer(RestrictionEndonucleases Products) 2.1, 750 nM FQ-reporter, 300 nM crRNA, 100 nM LbaCas12a

và 3 μL sản phẩm PCR ủ trong Hệ thống phát hiện PCR thời gian thực CFX Connect(Bio-Rad; Irvine, CA, Hoa Kỳ) trong 1 giờ ở 37°C Huỳnh quang kết quả được đo trênmáy đọc đĩa huỳnh quang (kênh FAM), với các đĩa được đọc sau mỗi 1 phút Hoạt độngcắt cis được thực hiện trong hệ thống phản ứng (10 μL) chứa 1× NEBuffer 2.1, 300 nMcrRNA và 100 nM LbaCas12a Sản phẩm PCR (3 μL) được ủ trong FlexCycler2Thermal Cycler (Analytik Jena; Jena, Đức) trong 1 giờ ở 37 °C và các sản phẩm phân cắtđược phân tích bằng phương pháp điện di gel

2.3 Xét nghiệm LAMP

Các mồi LAMP được thiết kế để nhắm mục tiêuhrpBtrình tự gen thu được từGenBank (số hiệu #AF295618.1), sử dụng chương trình phần mềm Primer ExplorerV.4 ,và được tổng hợp bởi Tsingke Biotechnology

Hỗn hợp phản ứng (25 μL) (1,6 μM FIP và BIP, 0,2 μM F3 và B3, 1,4 mM dNTP,0,1% Tween-20, 1,0 M betaine, 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM (NH4)2VÌ THẾ4, 50

mM KCl, 8 mM MgSO4, 8 Ubst 2.0 DNA Polymerase, 2 μL mẫu DNA, phủ một lớp dầukhoáng) ủ trong 35 phút ở 65°C trong máy luân nhiệt FlexCycler2 (Analytik Jena) và sảnphẩm thu được được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2%

2.4 Xét nghiệm huỳnh quang LAMP/Cas12a

Để thiết lập xét nghiệm này, phản ứng LAMP như trên được thực hiện như bướcđầu tiên Sản phẩm (3 μL) được chuyển qua đầu ống nhỏ giọt đã lọc vào hệ thống phảnứng (1× NEBuffer 2.1, 300 nM crRNA, 100 nM LbaCas12a, 750 nM FQ-reporter) và ủtrong 1 giờ ở 37 °C Huỳnh quang được đo như trongMục 2.4 Bước tiếp theo, phản ứngtổng thể được tối ưu hóa về mặt hiệu quả chi phí, dựa trên nhiều giá trị thử nghiệm vềnồng độ LbaCas12a (10, 16, 25, 33, 66, 100, 133, 166 nM), nồng độ crRNA (25, 50, 100,

140, 180, 200, 233, 466, 700, 933 nM), nồng độ phóng viên FQ (200, 350, 500, 650, 800,

950, 1100, 1250 nM) và thời gian phản ứng LAMP (10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50phút) Kiểm soát âm tính (thêm 1250 nMFQ-reporter; nước không có RNase làm mẫu)được chạy để loại bỏ tác động của tín hiệu nền Các mẫu được hình dung bằng cách chiếusáng UV Các thí nghiệm được thực hiện theo ba lần

xác nhận bằng cách sử dụng plasmid pUC57-hrpB (Pha loãng tuần tự 10 lần từ 2 ×1010đến 2 × 10-2bản sao) làm mẫu, theo bộ ba Tính đặc hiệu của xét nghiệm được xácnhận bằng cách sử dụng DNA bộ gen (gDNA) của các chủng và loài được mô tả bêndưới.

Độ nhạy cũng được đánh giá bằng cách sử dụng qPCR với mồi F3/B3 của LAMP;chương trình: 98°C trong 5 phút; 40 chu kỳ 98°C trong 10 giây, 55°C trong 10 giây,72°C trong 50 giây; 72°C trong 5 phút; đọc đĩa một lần vào cuối mỗi chu kỳ qPCR đượcchạy trên Hệ thống phát hiện PCR thời gian thực CFX Connect và độ nhạy được xác địnhdựa trên giá trị ngưỡng chu kỳ (Ct) ở nhiều nồng độ khuôn mẫu khác nhau

Primer F3 B3

2.6 Xét nghiệm dòng chảy bên LAMP/Cas12a (LFA: lateral flow assay)

Sự biến đổi của LAMP/Cas12a trong miền ứng dụng được khuếch đại bằng hệthống LFA, theo đó các tín hiệu dải dương được quan sát thấy tại các vị trí cụ thể khiphức hợp ái lực kháng nguyênkháng thể đi qua dải dòng chảy bên ssDNA cụ thể đượcthiết kế để sử dụng làm kháng nguyên trong thử nghiệm ái lực sinh học LAMP/ Cas12a-

Hình 2.4 Các chủng được sử dụng để thử độ đặc hiệu của phản ứng.

Hình 2.5 Trình tự mồi thực hiện phản ứng qPCR.

LFA được thực hiện trong điều kiện thử nghiệm huỳnh quang LAMP/Cas12a được tối

ưu hóa như mô tả ở trên FB-reporter (5′6-FAM-TTTTTTATTTTT-3'biotin) được sửdụng thay cho FQreporter và nồng độ của nó được tối ưu hóa Phản ứng được thực hiệntrong ống nghiệm trong 40 phút ở 37°C, trong 40 phút, thêm 80 μL đệm polyethyleneglycol (PEG) 5%, và đặt dải vào ống và ủ trong 3 phút ở nhiệt độ phòng

Màu sắc nhìn thấy được phát triển ở vạch thử nghiệm (vạch T) và dải đối chứngtrong vòng 5 phút Độ nhạy và độ đặc hiệu của LAMP/Cas12a-LFA tương tự như độnhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm huỳnh quang LAMP/Cas12a Hình ảnh dải đượcchuyển đổi sang thang độ xám 8 bit bằng phần mềm ImageJ và xác định giá trị màu xámcủa cường độ đường T

Tối ưu hóa nồng độ chất báo cáo FB (B) Tối ưu hóa lượng PEG thêm vào hệthống đệm

2.5 Xét nghiệm LAMP/Cas12a đối với các mẫu bị nhiễm tự nhiên

Các mẫu bị nhiễm tự nhiên (mô thân, đất) được thu thập từ cây cà chua và cáccánh đồng nghi ngờ bị héo do vi khuẩn ở Changyang, tỉnh Hồ Bắc và Baise, tỉnh QuảngTây Mẫu đất gDNA được chiết xuất bằng Bộ dụng cụ EZNA Soil DNA theo hướng dẫncủa nhà sản xuất Đối với mẫu mô thân gDNA, cắt mẫu 1 cm bằng kéo vô trùng, rửa bằngnước vô trùng, khử trùng bằng ethanol 70%, đặt vào đĩa Petri có 10 mL nước vô trùng,cắt nhỏ và treo trong 30 phút gDNA của mẫu mô thân và đất được sử dụng làm khuônmẫu cho xét nghiệm huỳnh quang LAMP/Cas12a và LAMP/Cas12a-LFA, và khuếch đạiPCR được thực hiện đồng thời Hệ thống PCR (50 μL) bao gồm cặp mồi 759/760 (Bảng

bổ sung S3) (10 μM, mỗi loại 2 μL), PrimeSTAR HS (Premix) (25 μL), khuôn mẫu DNA

Hình 2.6 Kết quả phản ứng trên phần mền ImageJ.