Bai giang chan doan benh thuc vat bang shpt

Bất kỳ thay đổi nào có thể phát hiện được về màu sắc, hình dạng và/hoặc chức năng của cây để phản ứng với mầm bệnh hoặc tác nhân gây bệnh đều là triệu chứng.. Nhóm tác nhân gây bệnh t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG

SINH HỌC PHÂN TỬ MOLECULAR DIAGNOSTICS OF PLANT

DISEASES

PGS.TS NGUYỄN BẢO QUỐC

Introduction to Plant PathologyGIỜI THIỆU VỀ BỆNH CÂY

Plant Pathology (Phytopathology): is a Greek Word which is made by

three words:

Phyton + Pathos +logos

Plant + suffering/ailments + study/knowledge

Bệnh học thực vật là gì?

Định nghĩa:

Bệnh học thực vật là một nhánh của khoa học nông nghiệp, thực vật hoặc sinh học liên quan đến việc nghiên cứu nguyên nhân, nguyên nhân, hậu quả thiệt hại và quản lý/kiểm soát bệnh cây trồng.

Mục tiêu bệnh học thực vật là gì?

1 Nghiên cứu các nguyên nhân sinh học, phi sinh học và môi trường gây bệnh cây trồng

2 Nghiên cứu cơ chế phát triển bệnh

3 Nghiên cứu sự tương tác giữa thực vật và mầm bệnh

4 Phát triển các phương pháp quản lý/kiểm soát bệnh cây trồng

Lịch sử bệnh học phân tử

1 Giai đoạn cổ đại (Ancient Period) ancient - 475 AD

2 Giai đoạn tăm tối (Dark Period) 476 A.D to 1600

3 Giai đoạn Phục Hưng (Renaissance Period) 1600 - 1853

4 Giai đoạn Hiện Đại (Modern Period) 1853 - 1906

5 Giai đoạn hiện tại: 1905 – ngày nay

Bệnh cây trồng là gì?

• Bệnh cây trồng (Plant Diseases) là bất kỳ tình trạng bất thường nào

làm thay đổi hình dáng bên ngoài hoặc chức năng của cây Đó là một quá trình sinh lý ảnh hưởng đến một số hoặc tất cả các chức năng

của thực vật Bệnh cũng có thể làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm thu hoạch.

• Bệnh (Disease) là một quá trình hoặc một sự thay đổi xảy ra theo thời

gian Nó không xảy ra ngay lập tức như chấn thương.

Bệnh cây trồng là gì?

• Những ảnh hưởng có thể nhìn thấy được của bệnh trên

cây trồng được gọi là triệu chứng Bất kỳ thay đổi

nào có thể phát hiện được về màu sắc, hình dạng

và/hoặc chức năng của cây để phản ứng với mầm

bệnh hoặc tác nhân gây bệnh đều là triệu chứng.

• Các dấu hiệu của bệnh thực vật là bằng chứng vật lý

của mầm bệnh, ví dụ như quả thể nấm, dịch vi khuẩn hoặc u nang tuyến trùng Các dấu hiệu cũng có thể

giúp xác định bệnh cây.

Nguyên nhân gây bệnh cây trồng?

• Bệnh truyền nhiễm ở thực vật là do các sinh vật sống tấn công và lấy chất dinh dưỡng từ cây mà chúng lây

nhiễm Sinh vật ký sinh gây bệnh là mầm bệnh

• Cây bị mầm bệnh xâm chiếm và đóng vai trò là nguồn

thức ăn của nó được gọi là vật chủ.

Vai trò của môi trường

• Một môi trường thuận lợi là cực kỳ quan trọng cho

sự phát triển của bệnh - ngay cả những cây dễ bị tổn thương nhất khi tiếp xúc với một lượng lớn mầm bệnh cũng sẽ không phát bệnh trừ khi điều kiện môi trường thuận lợi.

Tam giác bệnh

Host

Nhóm tác nhân gây bệnh thực vật - nấm

• Đại đa số đều có lợi

• Có thể gây bệnh cho cây trồng, con

người và vật nuôi

• Hầu hết không thể nhìn thấy được

nếu không có kính hiển vi

• Thiếu chất diệp lục

• Bao gồm cấu trúc phát triển của các

sợi mảnh, giống như sợi gọi là sợi

nấm

• Sinh sản bằng cách hình thành bào tử

Nhóm tác nhân gây bệnh thực vật - vi khuẩn

• Sinh vật cực nhỏ cần phải nhìn

thấy bằng kính hiển vi

• Quần thể vi khuẩn có thể tăng

số lượng trong thời gian ngắn

• Các tế bào tập hợp lại thành

khối gọi là khuẩn lạc

• Lấy thức ăn từ chất hữu cơ hoặc

mô sống chết hoặc đang phân

• Lây lan cây này sang cây khác nhờ mưa gió

• Lây nhiễm thông qua các lỗ hở hoặc vết thương của cây

tự nhiên

• Quen thuộc nhất vì chúng gây ra

các bệnh cho người và động vật

như cúm, bại liệt, bệnh dại, đậu

mùa và mụn cóc.

• Gây một số bệnh hại cây trồng

• Chỉ đo kích thước khoảng một

phần triệu inch

• Không phải là hệ thống sống hoàn

chỉnh

• Chỉ tồn tại trong tế bào

sốngTruyền qua côn trùng được

gọi là vectơ

University of Florida

Nhóm tác nhân gây bệnh thực vật - virus

Nhóm tác nhân gây bệnh thực vật – tuyến trùng

Fungi Bacteria Viruses Nematodes

Sống sót

(Survival)

Dư thừa thựcvật

Đất

Ký chủ thaythế

Dư thừa thựcvật

Đất

Ký chủ thay thếVector côn trùng

-Ký chủ thay thếVector côn trùng

Dư thừa thựcvật

Đất

Sự phát tán

Dispersal

GióMưaCôn trùng

GióMưaCôn trùng

-Côn trùng

-Làm đấtThiết bị

Rò nước

Gây nhiễm

Infection

Trực tiếpVết thươngVết cắn côntrùng

Vết thươngVết cắn côntrùng

-Vết cắn côntrùng

-Trực tiếp-

-So sánh các chu kỳ bệnh

Nguồn bệnh (Inoculum)

Nguồn bệnh có thể khác nhau đối với từng bệnh:

- Có thể được sản xuất trên dư lượng còn sót lại

trên đồng ruộng

- Có trong đất

- Hiện diện trong cỏ dại hoặc các loại cây trồng khác

trong khu vực

- Hiện diện trong hoặc trên hạt giống

- Có trong đất dính vào thiết bị hoặc dụng cụ

- Mang theo gió hoặc nước

- Được truyền bởi vectơ côn trùng

- Được mang theo bởi động vật, chim và con người

Sự lây lan của nguồn bệnh

Hai cách

1 Cây được trồng trong đất có chứa mầm bệnh

2 Nguồn bệnh di chuyển từ nguồn đến cây chủ

Keith Weller, U.S Department of Agriculture

Sự xâm nhập của nguồn bệnh và nhiễm

• Nhiễm bệnh xảy ra khi mầm bệnh xâm nhập thành công vào

cây và phát triển, sinh sản và lây lan trong cây

• Mầm bệnh xâm nhập vào vật chủ thông qua các lỗ hở tự

nhiên, vết thương trên bề mặt cây hoặc xâm nhập trực tiếp

vào cây

Penetration Mycelial

Pustule formation

Spore

germination

Syngenta

KỸ THUẬT PCR VÀ REALTIME PCR TRONG PHÁT

HIỆN BỆNH THỰC VẬT

Tại sao phải chẩn đoán ?

1 Để vượt qua dịch bệnh

2 Để giảm tổn thất năng suất

CÁC KỸ THUẬT TRUYỀN THỐNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH HẠI THỰC VẬT

Kính hiển vi

Vấn đề với yếu tố sinh học và phi sinh học

Kỹ thuật nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

Kính hiển vi

Những hạn chế của các kỹ thuật truyền

thống trong chẩn đoán bệnh thực vật

Nguy cơ bị nhiễm (Latent infection) : Thối vòng khoai tây

Nhiễm trùng gây nhầm lẫn (Misleading infection): Vết bệnh đen (alternaria) và bệnh bạc lá do vi khuẩn

ở cà rốt (Xanthomonas)

Đồng nhiễm (Co-infecton): Thay đổi triệu chứng

PCR là gì ?

• PCR là một kỹ thuật lấy chuỗi DNA cụ thể với số lượng nhỏ và khuếch đại nó để sử dụng cho các xét nghiệm tiếp theo

• Kỹ thuật in vitro

Lịch sử vắn tắt về PCR

• 1983: Tiến sĩ Kary Mullis phát triển PCR

• 1985: Công bố PCR đầu tiên của Tập đoàn Cetus xuất hiện trên tạp chí Science

• 1986: Taq polymerase tinh khiết lần đầu tiên được sử dụng trong PCR

• 1988: PerkinElmer giới thiệu máy luân nhiệt tự động1989: Khoa học tuyên bố Taq polymerase: phân tử của năm”

Lịch sử vắn tắt về PCR

• 1983: Tiến sĩ Kary Mullis phát triển PCR

• 1985: Công bố PCR đầu tiên của Tập đoàn Cetus xuất hiện trên tạp chí Science

• 1986: Taq polymerase tinh khiết lần đầu tiên được sử dụng trong PCR

• 1988: PerkinElmer giới thiệu máy luân nhiệt tự động

• 1989: Khoa học tuyên bố Taq polymerase: phân tử của năm”

• 1990: Khuếch đại và phát hiện các trình tự DNA cụ thể bằng cách sử dụng thuốc nhuộm liên kết DNA huỳnh quang, đặt nền tảng cho PCR “thời gian thực” hoặc “động học” trong tương lai

• 1991: RT-PCR được phát triển bằng cách sử dụng một loại polymerase ổn định nhiệt, rTth, tạo điều kiện thuận lợi cho các xét nghiệm chẩn đoán virus RNA

• 1993: Tiến sĩ Kary Mullis nhận giải Nobel Hóa học cho việc hình thành công nghệ PCR

• Biến tính

• Nhiệt độ : 91-940C

• Tách sợi đôi DNA  sợi đơn DNA

• Gắn kết

• Nhiệt độ: ~50-700C (tùy thuộc vào nhiệt độ của mồi)

• Mồi liên kết với trình tự bổ sung của chúng

• Chu trình

• Sản phẩm của bước kéo dài PCR

• Nguyên lý chung của PCR

• Trình tự DNA của vùng mục tiêu phải được biết

• Mồi (primers) – thường có kích thước từ 20 – 30 base Mồi có thể được sản xuất dễ dàng bởi các công ty thương mại Cũng có thể chuẩn bị bằng cách sử dụng thiết bị tổng hợp DNA

• DNA polymerase bền nhiệt Ví dụ Taq polymerase không bị bất hoạt ở nhiêt độ 950C

• Máy khuếch đại DNA (Máy PCR) – máy có thể được lập trình để thực hiện gia nhiệt và làm mát mẫu trong một số chu kỳ

Các yêu cầu cơ bản của phản ứng PCR

• Độ chuyên biệt (Specificity)

• Độ hiệu quả (Efficiency)

• Độ tin cậy (Fidelity)

3 khía cạnh khi sử dụng PCR

Khi PCR thất bại cần lưu ý những gì ?

(A) Nếu không có sản phẩm khuếch đại (đúng kích thước) được tạo ra trong quá trình PCR:

1 Kiểm tra chất lượng DNA

2 Giảm nhiệt độ bắt cặp (annealing temperature)

3 Tăng nồng độ Magnesium

4 Thêm dimethysulphoxide (DMSO) vào phản ứng (khoảng 10%)

5 Sử dụng các enzyme ổng định nhiệt khác nhau

6 Bỏ mồi cũ không hiệu quả và thiết kế bộ mồi mới

(B) Nếu xuát hiện nhiều band phụ

1 Tăng nhiệt độ bắt cặp (annealing temperature)

2 Giảm nồng độ Magnesium

3 Giảm số chu kỳ

4 Thừ các loại enzyme Taq khác nhau

• Kary Banks Mullis là một nhà hóa sinh người Mỹ

• Để ghi nhận phát minh PCR của ông, ông đã chia sẻ giải thưởng Nobel về hóa học năm 1993 với Michel Smith

• Nhà khoa học của Roche, Inc, đã nâng cấp nó lên qPCR

Lịch sử Real-time PCR

• Higuchi và cộng sự (1993) nhận ra rằng quá trình PCR có thể được theo dõi bằng cách thêm nhãn huỳnhquang liên kết với sản phẩm PCR tích lũy Khi nồng độ sản phẩm PCR tăng thì cường độ tín hiệu huỳnhquang cũng tăng

• Họ đã sử dụng EtBr (Ethidium Bromide) để phát hiện Khám phá này đã mở đường cho phương pháp PCR thời gian thực định lượng hiện đại (qPCR) Khi EtBr liên kết với DNA sợi đôi và bị kích thích bởi tia UV,

nó sẽ phát huỳnh quang

• 1966 – Phương pháp phát hiện Taqman được sử dụng thay cho EtBr để phát hiện sương muối thực sự trongPCR

PCR truyền thống – bán định lượng

Nguyên lý của real-time PCR

• Theo dõi tiến trình PCR khi nó diễn ra (trong “thời gian thực”) bằng cách đọc cường độ huỳnh quang saumỗi chu kỳ

• Cường độ tín hiệu tỷ lệ thuận với số lượng bộ khuếch đại được tạo ra

• Nhiều vật liệu ban đầu hơn, tăng huỳnh quang sớm hơn

Các định nghĩa

• Đường cơ sở (baseline) = Mức huỳnh quang cơ bản được xác định trong chu kỳ PCR ban đầu

• Ngưỡng (Threshold) = Mức huỳnh quang cố định được đặt trên đường cơ sở

• Rn = tín hiệu báo cáo đã chuẩn hóa, mức huỳnh quang được phát hiện trong quá trình PCR Được tính bằng

cách chia tín hiệu nhuộm của đầu dò cho tín hiệu tham chiếu thụ động (ROX)

• Ct = chu kỳ ngưỡng, chu kỳ PCR tại đó sự gia tăng huỳnh quang của người báo cáo trên tín hiệu cơ bản lầnđầu tiên được phát hiện (chu kỳ khi huỳnh quang vượt qua ngưỡng)

Ct là số chu kỳ tại đó huỳnh quang vượt qua ngưỡng

Thiết bị PCR thời gian thực bao gồm BA thành phần chính:

1 Máy luân nhiệt (máy PCR)

2 Mô-đun quang học (để phát hiện huỳnh quang trong ống

trong quá trình chạy)

3 Máy tính (để dịch dữ liệu huỳnh quang thành kết quả có ý

Các hóa chất được sử dụng trong real-time

PCR

Làm thế nào để đánh dấu sản phẩm PCR

• Thuốc nhuộm xen kẽ (Intercalating dye)

• Chỉ phát huỳnh quang khi liên kết với ds DNA

• Nhạy cảm hơn EtBr

Thuốc nhuộm SYBR Green

Thuận lợi :

- Dễ sản xuất

- Giá rẻ, không cần thiết kế đầu dò

- Dễ dàng xử lý và an toàn hơn EtBr

Đường cong nóng chãy và đường cong phân ly

• Đường cong nóng chảy biểu thị sự thay đổi huỳnh quang được quan sát thấy khi dsRNA với các phân tửthuốc nhuộm kết hợp “tan chảy” thành ssDNA khi nhiệt độ của phản ứng tăng lên

• Khi DNA sợi đôi liên kết với thuốc nhuộm SYBR Green I được làm nóng, huỳnh quang giảm đột ngộtđược phát hiện khi đạt đến điểm nóng chảy ™

• Sự phát huỳnh quang được vẽ theo nhiệt độ, và sau đó –ΔF/ ΔT (sự thay đổi huỳnh quang/sự thay đổi

nhiệt độ) được vẽ theo nhiệt độ để có cái nhìn rõ ràng về động lực nóng chảy

Đường cong phân ly

Taqman Probe

• Hai mồi + đầu dò huỳnh quang xác định độ đặc hiệu

• Không phát hiện được sản phẩm cụ thể

• Không cần đường cong nóng chảy (nhanh hơn)

• Có thể được sử dụng để phân biệt allelic

• Multiplex

• Tổng hợp các đầu dò khác nhau cần thiết cho các trình tự khác nhau

Taqman Probe

• Lai với bộ khuếch đại mục tiêu

• Đầu 3’ bị chặn ở giai đoạn cuối (không thể mở rộng bằng thepolymerase)

• Có hai thuốc nhuộm huỳnh quang được đính kèm:

1 Reporter (R)

2 Quenher (Q)

Taqman Probe

qRT-PCR hiển thị bốn giai đoạn

1 Pha nền tuyến tính

2 Pha hàm mũ sớm (pha bắt đầu)

3 Pha hàm mũ tuyến tính (pha log)

4 Pha ổn định

Pha nền tuyến tính (Linear ground phase): trong pha đầu tiên, PCR mới bắt đầu, tín hiệu

huỳnh quang chưa vượt lên trên nền

Pha hàm mũ sớm (Early exponential phase) : pha thứ hai là nơi tín hiệu huỳnh quang chỉ tăng

đáng kể so với nền, chu kỳ xảy ra được gọi là ngưỡng chu kỳ (Ct)

Pha hàm mũ tuyến tính (pha log): Pha hàm mũ tuyến tính, PCR đang ở giai đoạn khuếch đại

tối ưu với số lượng sản phẩm PCR nhân đôi trong mỗi chu kỳ

Pha ổn định (Plateau phase): Pha cuối cùng là khi cơ chất cạn kiệt và Taq DNA polymerase

hết tuổi thọ, tín hiệu huỳnh quang sẽ không còn tăng

Có hai loại phân tích qRT-PCR cơ bản:

- định lượng tuyệt đối

- định lượng tương đối

Sự lựa chọn dựa trên cả mục tiêu thử nghiệm và nguồn lực sẵn có

Định lượng tuyệt đối: nó xác định mức biểu hiện theo số lượng bản sao tuyệt đối, sử dụng đường cong hiệu

chuẩn

Định lượng tương đối: nó xác định sự thay đổi lần lượt trong biểu thức giữa hai mẫu

Định lượng biểu hiện gen bằng qRT-PCR

ĐỊNH LƯỢNG TUYỆT ĐỐI

Dữ liệu từ RT PCR là giá trị Ct hoặc ngưỡng chu kỳ

Ct: số chu kỳ tại đó đạt được tín hiệu có thể phát hiện được

Nồng độ ban đầu lớn hơn, giá trị Ct ít hơn

ĐỊNH LƯỢNG TƯƠNG ĐỐI

Nó so sánh biểu hiện liên quan đến gen giữ nhà và/hoặc với mẫu tham chiếu khác

Phương pháp so sánh Ct là so sánh mức độ biểu hiện giữa hai mẫu, đối với mẫu Gene quan tâm (GOI) trong mẫu A so với mẫu B

ƯU ĐIỂM CỦA REALTIME PCR

Thu thập dữ liệu trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân

THỜI GIAN THỰC: có thê ghi nhận khuếch đại trong thời gian thực

CẦN ÍT RNA HƠN: Yêu cầu RNA ít hơn 1000 lần so với các xét nghiệm thông thường

NHANH CHÓNG: không xử lý hậu PCR như chạy điện di, chụp ảnh gel

HỢP LÝ: Phát hiện có khả năng thay đổi gấp 2 lần

ỨNG DỤNG CỦA REALTIME PCR

Phân tích biểu hiện gen

Phát hiện gen đột biến

Đo được số copy gene

Phát hiện tác nhân gây bệnh và định lượng

Phân tích đa hình dựa trên NSP

Độ chuyên biệt cao

Thân thiện với người sử dụng

Mạnh và nhanh

Không sử dụng thiết bị nhiều

Có thể cung cấp cho người dùng cuối sử dụng

Loop-mediated isothermal amplification

(LAMP) và ứng dụng trong phát hiện các tác nhân gây bệnh

• Kết quả trong vòng 10-30 phút

● Sản phẩm có thể phát hiện trên agararose gel

Introduction

● Tiết kiệm thời gian, công sưc và chi phí

• Phát hiện nhanh tại đồng ruộng

Procedure

THIÊT KẾ MỒI LAMP

4 loại mồi dựa trên 6 vùng riêng biệt của gen mục tiêu: Vùng F3c, F2c và F1c ở phía

3' và các vùng B1, B2 và B3 ở phía 5‘

FIP: Forward Inner Primer (FIP) bao gồm vùng F2 (ở đầu 3') bổ sung cho vùng F2c và trình tự tương tự như vùng F1c ở đầu 5'.

Mồi F3: Mồi ngoài phía trước bao gồm vùng F3 bổ sung cho vùng F3c

Các đoạn mồi bên trong ngược (BIP) bao gồm vùng B2 (ở đầu 3') bổ sung cho vùng B2c và trình tự tương tự như vùng B1c ở đầu 5‘

Mồi B3: Trình tự lót ngoài phía sau bao gồm vùng B3 bổ sung cho vùng B3c

hai đoạn mồi vòng - đoạn mồi vòng tiến (FLP) và đoạn mồi vòng lùi (BLP) đẩy nhanh phản ứng khuếch đại bằng cách liên kết với các vị trí bổ sung mà các đoạn mồi bên trong không thể truy cập được

NGUYÊN LÝ CỦA LAMP

(A) Các bước không theo chu kỳ: tạo ra DNA vòng gốc có cấu trúc hình quả tạ ở cả hai đầu

• Một trong những đoạn mồi LAMP gắn vào chuỗi bổ sung của DNA mục tiêu

• Bắt đầu quá trình tổng hợp DNA bằng cách sử dụng DNA polymerase với hoạt động dịch chuyển, thay thế và giải phóng một chuỗi DNA đơn

• Không giống như PCR, dsDNA không cần biến tính nhiệt

• Thông qua hoạt động của DNA polymerase với hoạt động dịch chuyển sợi, một chuỗi DNA bổ sung cho DNA mẫu được tổng hợp, bắt đầu từ đầu 3' của vùng F2 của FIP.