Chẩn đoán bệnh dịch tả lợn cổ điển bằng phương pháp elisa nhóm 1

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHẨN ĐỐN BỆNH DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN BẰNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN BẰNG

PHƯƠNG PHÁP ELISA

TP Thủ Đức, 10/2023

MÔN HỌC

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

NHÓM SINH VIÊN THỰC HIỆN

NIÊN KHÓA

: THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CNSH : TS HUỲNH VĂN BIẾT

: NHÓM 3 : 2021-2025

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN BẰNG

PHƯƠNG PHÁP ELISA

TP Thủ Đức, 10/2023

Nhóm sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Ngọc Tuyền Nguyễn Phan Bảo Vy Nguyễn Lương Thảo Nhi

21126230

21126245

21126441

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH HÌNH ẢNH ii

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU VỀ DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN VÀ PHƯƠNG PHÁP ELISA 1

1.1 Giới thiệu về dịch tả lợn cổ điển 1

1.2 Giới thiệu về phương pháp Elisa 3

CHƯƠNG II NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BỘ KIT TEST (DỤNG CỤ XÉT NGHIỆM ĐƠN GIẢN) VÀ QUY TRÌNH THỰC HIỆN XÉT NGHIỆM 4

2.1 Nguyên lý hoạt động của bộ Kit Test (dụng cụ xét nghiệm đơn giản) 4

2.2 Mô tả quá trình hoạt động của Kit Test 4

2.3 Nguyên vật liệu 5

2.4 Quy trình thực hiện 6

2.5 Đọc và xử lý kết quả 6

TÀI LIỆU THAM KHẢO 7

DANH SÁCH HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc của Pestivirus 1

Hình 1.2 Hình ảnh của Pestivirus 1

Hình 1.3 Hình ảnh lợn lười vận động 1

Hình 1.4 Hình ảnh hậu môn lợn chảy máu 1

Hình 1.5 Hình ảnh lợn bị xuất huyết 2

Hình 1.6 Hình ảnh da lợn từ trắng chuyển sang màu đỏ 2

Hình 1.7 Hình ảnh lợn được kiểm tra tại chuồng 2

Hình 1.8 Hình ảnh minh họa 4 phương pháp Elisa 3

Hình 2.1 Hình minh họa phương pháp Elisa Sandwich 4

Hình 2.2 Hình ảnh mô tả hoạt động của bộ Kit Test 5

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU VỀ DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN

VÀ PHƯƠNG PHÁP ELISA

1.1 Giới thiệu về dịch tả lợn cổ điển

CSF ( Classical swine fever ) – dịch tả lợn cổ điển gây ra bởi 1 loại virus RNA sợi đơn

thuộc chi Pestivirus, thuộc họ Flaviviridea và bệnh được xếp vào nguy hiểm bậc nhất

cho tới nay.Bệnh dễ lây lan và thường xuyên gây tử vong cho lợn với đặc điểm là sốt,

xuất huyết và có thể diễn biến thứ cấp hoặc mãn tính Pestivirus được bao bọc mã hóa

cho một polyprotein duy nhất Ba glycoprotein liên kết với vỏ E0, E1, E2 (gp 55) theo

sự sắp xếp của chúng trong glycoprotein Bệnh có 5 thể biểu hiện phụ thuộc vào độ độc lực của căn nguyên, giống và lứa tuổi lợn, sức đề kháng của lợn và hình thức chăn nuôi lợn

Triệu chứng: nôn mửa, tiêu chảy, thiếu phối hợp vận động, viêm kết mạc, sốt cao, đột

tử, dị dạng, heo con mới sinh rất yếu

Hình 1.2 Hình ảnh của Pestivirus Hình 1.1 Cấu trúc của Pestivirus

Hình 1.3 Hình ảnh lợn lười vận động Hình 1.4 Hình ảnh hậu môn lợn chảy máu

Nguyên nhân lây bệnh: nguồn lây chính của bệnh thông qua đường tiêu hóa hay đường

hô hấp của lợn nhiễm bệnh còn khỏe mạnh, cụ thể thông qua nước tiểu, nước mắt, rơm rác, qua nước rửa thịt và long lợn ốm ở ao hồ hoặc chim, chuột, chó, mèo, Có thể xâm nhập vào đàn qua thịt bị vấy nhiễm (lây qua thịt heo chưa nấu hoặc thịt đã qua xử lý) Lây truyền cơ học phổ biến qua ủng, quần áo,

Hình 1.7 Hình ảnh lợn được kiểm tra tại chuồng Hình 1.5 Hình ảnh lợn bị xuất huyết Hình 1.6 Hình ảnh da lợn từ trắng chuyển sang màu đỏ

1.2 Giới thiệu về phương pháp Elisa

Phương pháp Elisa có 4 loại chính : trực tiếp, gián tiếp, sandwich, cạnh tranh

Dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể - kháng nguyên, phát hiện bằng kháng thể đánh dấu Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Phương pháp này được thiết

kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies, hormone, Kĩ thuật này nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml)

Hình 1.8 Hình ảnh minh họa 4 phương pháp Elisa

CHƯƠNG II NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BỘ KIT TEST (DỤNG CỤ XÉT NGHIỆM ĐƠN GIẢN) VÀ QUY TRÌNH THỰC HIỆN XÉT NGHIỆM

2.1 Nguyên lý hoạt động của bộ Kit Test (dụng cụ xét nghiệm đơn giản)

Bộ Elisa Ag VDPro CSFV được thiết kế để phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên trong các mẫu từ tế bào, bạch cầu và dịch chiết mô của lợn bị nhiễm CSFV Bộ kit test cung cấp một phương pháp nhanh chóng, đơn giản và cụ thể để phát hiện kháng nguyên

CSFV Không bao gồm phản ứng chéo với các loại Pestivirus khác như virus tiêu chảy

ở bò và virus bệnh biên giới

Bộ kit test sử dụng hoạt động dựa trên nguyên lý của Elisa Sandwich Elisa sandwich định lượng kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể (kháng thể bắt-capture và phát hiện-detetion) Các kháng nguyên được định lượng phải chứa ít nhất hai epitop kháng nguyên

có khả năng liên kết với các kháng thể, ít nhất là với hai kháng thể hoạt động trong kỹ thuật sandwich Các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng đều có thể sử dụng như các kháng thể bắt và kháng thể phát hiện trong hệ thống Elisa sandwich Kháng thể đơn dòng có 1 epitop duy nhất cho phép phát hiện và định lượng tốt sự khác biệt nhỏ trong kháng nguyên Một kháng thể đa dòng thường được sử dụng như các kháng thể bắt giữ càng nhiều kháng nguyên càng tốt

2.2 Mô tả quá trình hoạt động của Kit Test

Trên đáy đĩa được phủ một lớp kháng thể đơn dòng kháng E2

Mẫu được chiết và pha loãng từ bạch cầu, mô chất đồng nhất hoặc nuối cấy mô sau đó cho vào đĩa

Nếu có kháng nguyên trong mẫu, đĩa sẽ chuyển màu sau khi cho peroxidase

So sánh kết quả OD để xác định có bị nhiễm bệnh hay không

Hình 2.1 Hình minh họa phương pháp Elisa Sandwich trực tiếp

2.3 Nguyên vật liệu

Mẫu : huyết thanh có thể chứa kháng nguyên

Lấy 1-2g từ các vị trí phổi, gan , não, lá lách, thận, thêm 3-5 ml 1X STB (sample treatment buffer), nghiền nhỏ để 1 giờ trong nhiệt độ phòng Sau đó ly tâm 12000xg/1 phút, lấy phần dịch nổi

Anti-CSFV E2 antibody coated plate

10X sample treatment buffer

10X washing buffer

Dilution buffer

20X whole blood treatment buffer

HRPO anti-CSFV conjugate

Strong positive control

Weak positive control

Negative control

TMB (tetrathylbenzidine) subtrate

Stop solution

Hình 2.2 Hình ảnh mô tả hoạt động của bộ Kit Test

2.4 Quy trình thực hiện

2.5 Đọc và xử lý kết quả

% SP = 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 𝑂𝐷−𝑁𝐶 𝑚𝑒𝑎𝑛 𝑂𝐷

% SP ≥ 20% -> dương tính

% SP 15~20% -> nghi ngờ

% SP ≤ 15% -> âm tính

Đáy giếng gắn kháng thể gắn kháng nguyên E2

50 µl dilution buffer để pha loãng mẫu

50 µl mẫu, đối chứng âm, đối chứng dương

(tỉ lệ pha loãng 1 :2)

100 µl HRPO anti-CSFV conjugate

ủ 90 phút, 370C rửa 3-5 lần

100 µl TMB substrate (cơ chất)

ủ 60 phút, 370C rửa 3-5 lần

50µl stop solution

ủ tối, 10 phút

Đọc kết quả

OD 450 nm

↓

↓

↓

↓

↓

↓

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bệnh Dịch TẢ lợn cổ điển (CSF) Available

at:https://thuoctrangtrai.com/benh-dich-ta-lon-co-dien-csf-nd83603.html (Accessed: 25 October 2023)

2.file:///C:/Users/nguye/Documents/Zalo%20Received%20Files/A%CC%89nh%20ma

% CC%80n%20hi%CC%80nh%202023-03-23%20lu%CC%81c%2016.44.41%20(1).pdf

3.Tổng Quan VỀ Bệnh dịch TẢ lợn cổ điển (CSF - classical swine fever) HappyVet

Available at: https://happyvet.vn/tin-tuc/benh-dich-ta-lon-co-dien-csf.html (Accessed:

25 October 2023)

4 MEDLATEC, B viện đa khoa (2020) Đối tượng và Cách thức thực

hiện xét nghiệm Elisa, Bệnh viện đa khoa MEDLATEC Available at:

https://medlatec.vn/tin-tuc/doi-tuong-va-cach-thuc-thuc-hien-xet-nghiem-elisa-s58-n16722 (Accessed: 25 October 2023)

5 Những điều cơ bản về kỹ Thuật Elisa (no date) Những điều cơ bản về kỹ thuật ELISA

Available at: https://biomedia.vn/review/nhung-dieu-co-ban-ve-ky-thuat-elisa.html (Accessed: 25 October 2023)