Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHẨN ĐỐN BỆNH DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN BẰNG
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA MÔN HỌC : THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CNSH GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN : TS HUỲNH VĂN BIẾT NHÓM SINH VIÊN THỰC HIỆN : NHÓM 3 NIÊN KHÓA : 2021-2025 TP Thủ Đức, 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA Nhóm sinh viên thực hiện 21126230 Nguyễn Thị Ngọc Tuyền 21126245 Nguyễn Phan Bảo Vy 21126441 Nguyễn Lương Thảo Nhi TP Thủ Đức, 10/2023 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH SÁCH HÌNH ẢNH ii CHƯƠNG I GIỚI THIỆU VỀ DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN VÀ PHƯƠNG PHÁP ELISA .1 1.1 Giới thiệu về dịch tả lợn cổ điển .1 1.2 Giới thiệu về phương pháp Elisa 3 CHƯƠNG II NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BỘ KIT TEST (DỤNG CỤ XÉT NGHIỆM ĐƠN GIẢN) VÀ QUY TRÌNH THỰC HIỆN XÉT NGHIỆM 4 2.1 Nguyên lý hoạt động của bộ Kit Test (dụng cụ xét nghiệm đơn giản) 4 2.2 Mô tả quá trình hoạt động của Kit Test 4 2.3 Nguyên vật liệu .5 2.4 Quy trình thực hiện 6 2.5 Đọc và xử lý kết quả 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 7 i DANH SÁCH HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc của Pestivirus 1 Hình 1.2 Hình ảnh của Pestivirus 1 Hình 1.3 Hình ảnh lợn lười vận động .1 Hình 1.4 Hình ảnh hậu môn lợn chảy máu .1 Hình 1.5 Hình ảnh lợn bị xuất huyết .2 Hình 1.6 Hình ảnh da lợn từ trắng chuyển sang màu đỏ 2 Hình 1.7 Hình ảnh lợn được kiểm tra tại chuồng 2 Hình 1.8 Hình ảnh minh họa 4 phương pháp Elisa .3 Hình 2.1 Hình minh họa phương pháp Elisa Sandwich 4 Hình 2.2 Hình ảnh mô tả hoạt động của bộ Kit Test 5 ii CHƯƠNG I GIỚI THIỆU VỀ DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN VÀ PHƯƠNG PHÁP ELISA 1.1 Giới thiệu về dịch tả lợn cổ điển CSF ( Classical swine fever ) – dịch tả lợn cổ điển gây ra bởi 1 loại virus RNA sợi đơn thuộc chi Pestivirus, thuộc họ Flaviviridea và bệnh được xếp vào nguy hiểm bậc nhất cho tới nay.Bệnh dễ lây lan và thường xuyên gây tử vong cho lợn với đặc điểm là sốt, xuất huyết và có thể diễn biến thứ cấp hoặc mãn tính Pestivirus được bao bọc mã hóa cho một polyprotein duy nhất Ba glycoprotein liên kết với vỏ E0, E1, E2 (gp 55) theo sự sắp xếp của chúng trong glycoprotein Bệnh có 5 thể biểu hiện phụ thuộc vào độ độc lực của căn nguyên, giống và lứa tuổi lợn, sức đề kháng của lợn và hình thức chăn nuôi lợn Hình 1.1 Cấu trúc của Pestivirus Hình 1.2 Hình ảnh của Pestivirus Triệu chứng: nôn mửa, tiêu chảy, thiếu phối hợp vận động, viêm kết mạc, sốt cao, đột tử, dị dạng, heo con mới sinh rất yếu Hình 1.3 Hình ảnh lợn lười vận động Hình 1.4 Hình ảnh hậu môn lợn chảy máu 1 Nguyên nhân lây bệnh: nguồn lây chính của bệnh thông qua đường tiêu hóa hay đường hô hấp của lợn nhiễm bệnh còn khỏe mạnh, cụ thể thông qua nước tiểu, nước mắt, rơm rác, qua nước rửa thịt và long lợn ốm ở ao hồ hoặc chim, chuột, chó, mèo, Có thể xâm nhập vào đàn qua thịt bị vấy nhiễm (lây qua thịt heo chưa nấu hoặc thịt đã qua xử lý) Lây truyền cơ học phổ biến qua ủng, quần áo, Hình 1.5 Hình ảnh lợn bị xuất huyết Hình 1.6 Hình ảnh da lợn từ trắng chuyển sang màu đỏ Hình 1.7 Hình ảnh lợn được kiểm tra tại chuồng 2 1.2 Giới thiệu về phương pháp Elisa Phương pháp Elisa có 4 loại chính : trực tiếp, gián tiếp, sandwich, cạnh tranh Hình 1.8 Hình ảnh minh họa 4 phương pháp Elisa Dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể - kháng nguyên, phát hiện bằng kháng thể đánh dấu Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies, hormone, Kĩ thuật này nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) 3 CHƯƠNG II NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BỘ KIT TEST (DỤNG CỤ XÉT NGHIỆM ĐƠN GIẢN) VÀ QUY TRÌNH THỰC HIỆN XÉT NGHIỆM 2.1 Nguyên lý hoạt động của bộ Kit Test (dụng cụ xét nghiệm đơn giản) Bộ Elisa Ag VDPro CSFV được thiết kế để phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên trong các mẫu từ tế bào, bạch cầu và dịch chiết mô của lợn bị nhiễm CSFV Bộ kit test cung cấp một phương pháp nhanh chóng, đơn giản và cụ thể để phát hiện kháng nguyên CSFV Không bao gồm phản ứng chéo với các loại Pestivirus khác như virus tiêu chảy ở bò và virus bệnh biên giới Bộ kit test sử dụng hoạt động dựa trên nguyên lý của Elisa Sandwich Elisa sandwich định lượng kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể (kháng thể bắt-capture và phát hiện- detetion) Các kháng nguyên được định lượng phải chứa ít nhất hai epitop kháng nguyên có khả năng liên kết với các kháng thể, ít nhất là với hai kháng thể hoạt động trong kỹ thuật sandwich Các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng đều có thể sử dụng như các kháng thể bắt và kháng thể phát hiện trong hệ thống Elisa sandwich Kháng thể đơn dòng có 1 epitop duy nhất cho phép phát hiện và định lượng tốt sự khác biệt nhỏ trong kháng nguyên Một kháng thể đa dòng thường được sử dụng như các kháng thể bắt giữ càng nhiều kháng nguyên càng tốt Hình 2.1 Hình minh họa phương pháp Elisa Sandwich trực tiếp 2.2 Mô tả quá trình hoạt động của Kit Test Trên đáy đĩa được phủ một lớp kháng thể đơn dòng kháng E2 Mẫu được chiết và pha loãng từ bạch cầu, mô chất đồng nhất hoặc nuối cấy mô sau đó cho vào đĩa Nếu có kháng nguyên trong mẫu, đĩa sẽ chuyển màu sau khi cho peroxidase So sánh kết quả OD để xác định có bị nhiễm bệnh hay không 4 Hình 2.2 Hình ảnh mô tả hoạt động của bộ Kit Test 2.3 Nguyên vật liệu Mẫu : huyết thanh có thể chứa kháng nguyên Lấy 1-2g từ các vị trí phổi, gan , não, lá lách, thận, thêm 3-5 ml 1X STB (sample treatment buffer), nghiền nhỏ để 1 giờ trong nhiệt độ phòng Sau đó ly tâm 12000xg/1 phút, lấy phần dịch nổi Anti-CSFV E2 antibody coated plate 10X sample treatment buffer 10X washing buffer Dilution buffer 20X whole blood treatment buffer HRPO anti-CSFV conjugate Strong positive control Weak positive control Negative control TMB (tetrathylbenzidine) subtrate Stop solution 5 2.4 Quy trình thực hiện Đáy giếng gắn kháng thể gắn kháng nguyên E2 ↓ 50 µl dilution buffer để pha loãng mẫu ↓ 50 µl mẫu, đối chứng âm, đối chứng dương (tỉ lệ pha loãng 1 :2) ủ 90 phút, 370C ↓ rửa 3-5 lần 100 µl HRPO anti-CSFV conjugate ủ 60 phút, 370C ↓ rửa 3-5 lần ủ tối, 10 phút 100 µl TMB substrate (cơ chất) ↓ 50µl stop solution ↓ Đọc kết quả OD 450 nm 2.5 Đọc và xử lý kết quả % SP = 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 𝑂𝐷−𝑁𝐶 𝑚𝑒𝑎𝑛 𝑂𝐷 𝑋 100 𝑆𝑃𝐶 𝑚𝑒𝑎𝑛 𝑂𝐷−𝑁𝐶 𝑚𝑒𝑎𝑛 𝑂𝐷 % SP ≥ 20% -> dương tính % SP 15~20% -> nghi ngờ % SP ≤ 15% -> âm tính 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Bệnh Dịch TẢ lợn cổ điển (CSF) Available at:https://thuoctrangtrai.com/benh-dich- ta-lon-co-dien-csf-nd83603.html (Accessed: 25 October 2023) 2.file:///C:/Users/nguye/Documents/Zalo%20Received%20Files/A%CC%89nh%20ma % CC%80n%20hi%CC%80nh%202023-03- 23%20lu%CC%81c%2016.44.41%20(1).pdf 3.Tổng Quan VỀ Bệnh dịch TẢ lợn cổ điển (CSF - classical swine fever) HappyVet Available at: https://happyvet.vn/tin-tuc/benh-dich-ta-lon-co-dien-csf.html (Accessed: 25 October 2023) 4 MEDLATEC, B viện đa khoa (2020) Đối tượng và Cách thức thực hiện xét nghiệm Elisa, Bệnh viện đa khoa MEDLATEC Available at: https://medlatec.vn/tin-tuc/doi-tuong-va-cach-thuc-thuc-hien-xet-nghiem-elisa-s58- n16722 (Accessed: 25 October 2023) 5 Những điều cơ bản về kỹ Thuật Elisa (no date) Những điều cơ bản về kỹ thuật ELISA Available at: https://biomedia.vn/review/nhung-dieu-co-ban-ve-ky-thuat-elisa.html (Accessed: 25 October 2023) 7