Áp dụng kỹ thuật rt pcr để xác định virus dịch tả lợn cổ điển

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCBÁO CÁO SEMINAR Trang 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ M

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO SEMINAR THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Môn học : THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CNSH Mã mơn học : 211402 Nhóm sinh viên thực : NHÓM SÁNG THỨ NĂM – CA TP Thủ Đức, 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO SEMINAR THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: Thiết bị kỹ thuật chuẩn đoán bệnh dịch tả heo cổ điển Hướng dẫn khoa học Nhóm sinh viên thực TS HUỲNH VĂN BIẾT HUỲNH THỊ KIM TUYẾN LÊ THỊ NGỌC THI VÕ HUỲNH THẢO VY TP Thủ Đức, 10/2023 DANH SÁCH SINH VIÊN HỌ VÀ TÊN MÃ SỐ SINH VIÊN Huỳnh Thị Kim Tuyến 21126567 Lê Thị Ngọc Thi 21126194 Võ Huỳnh Thảo Vy 20126176 i MỤC LỤC Trang DANH SÁCH SINH VIÊN i MỤC LỤC ii Giới thiệu Kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật điện di Tài liệu tham khảo ii Giới thiệu Hiện nay, ngành chăn nuôi heo Việt Nam phát triển với quy mô công nghiệp rộng lớn Theo hội nghị “ Triển khai giải pháp thúc đẩy phát triển chăn ni heo tình hình mới” Bộ NN-PTNT tổ chức công bố Việt Nam quốc gia có ngành chăn ni heo đứng thứ giới số lượng đầu con, đứng thứ sản lượng thịt (năm 2022) Vì việc kiểm sốt chuẩn đốn nhanh tình hình dịch bệnh heo vấn đề cấp thiết tất trang trại nước ta Bệnh dịch tả heo cổ điển (Classical swine fever disease) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi heo toàn giới CSFV thuộc chi Pestivirus họ Flaviviridae (Simmonds cộng sự, 2017) Đây virus RNA chuỗi đơn sợi dương, có độ dài 12 Kb mã hóa cho protein cấu trúc protein phi cấu trúc (Moormann Hulst, 1988) Gen E2 CSFV có độ dài 1119bp mã hóa cho protein E2 có 373 amino acid, 51-55 kDa, glycoprotein vỏ kháng, ngun đặc trưng CSFV có tính sinh miễn dịch cao số protein virus Trong lựa chọn vùng gen noncoding E2 thuộc đoạn gen E2 vùng gen đặc hiệu CSFV Triệu chứng đặc trưng bệnh dịch tả heo cổ điển quan sát heo bỏ ăn cám, sốt cao 400C Đồng thời có triệu chứng mệt mỏi, lờ đờ nơn Vùng da mỏng mang tai, nách bẹn có chấm nhỏ màu đỏ Sau chuyển dần sang màu tím Heo có triệu chứng khó thở, mạch đập nhanh chết sau đến ngày mắc bệnh (Theo Hướng dẫn phương pháp phịng chống bệnh dịch tả heo cổ điển) Hình Triệu chứng bệnh dịch tả heo cổ điển Kỹ thuật RT-PCR B1 Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm: Mẫu huyết mô thu thập từ số trại heo có biểu bệnh CSF B2 Ly trích, tinh RNA mẫu bệnh phẩm: Mẫu huyết mô bị nghi ngờ nhiễm CSFV ly trích RNA kit GeneJET Viral DNA/ RNA Purification Kit (Thermo, Mỹ) B3 Tổng hợp cDNA: Sợi cDNA tổng hợp kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo, Mỹ) B4 Thiết kế mồi đặc hiệu cho vùng gen noncoding E2 virus dịch tả heo cổ điển Xác định gen mục tiêu: vùng gen noncoding E2 virus dịch tả lợn cổ điển giải trình với độ dài 284bp, mã hóa 93 axít amin, độ tương đồng 99% so với chủng công bố ngân hàng gen NCBI Trình tự đầu 5’ 3’ gen đích sử dụng để thiết kế mồi đặc hiệu cho vùng gen noncoding E2 virus CSF với thông số thể qua Bảng Có thể sử dụng cặp mồi CSF324/326 dùng để phân tích di truyền virus dịch tả heo cổ điển lưu hành Việt Nam Bảng Trình tự cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT - PCR gen noncoding E2 (Trần Đức Hoàn cộng sự, 2021) B5 Khuếch đại mẫu phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RTPCR) Thành phần phản ứng RT- PCR gồm:  12,5 µl GoTaq G2 Green Master Mix  1,0 µl mồi (nồng độ cuối 0,4 µM)  µl DNA mẫu thêm nước Nuclease free water để đạt tổng thể tích 25 µl cho phản ứng Hình Máy luân nhiệt Chu trình luân nhiệt bao gồm: Tiền biến tính: chu kỳ 95°C phút Biến tính: 95°C 30 giây Bắt cặp: 55°C 30 giây 35 chu kỳ Kéo dài: 72°C 75 giây Hậu kéo dài: chu kỳ kết thúc 72°C phút Hình Chu trình phản ứng PCR 3 Kỹ thuật điện di Nguyên lý: Điện di DNA gel agarose kỹ thuật sử dụng để phân tách phát đoạn DNA (hoặc đại phân tử khác, chẳng hạn RNA protein) dựa kích thước điện tích chúng Vật liệu thiết bị: ➢ Máy điện di ngang ➢ Gel agarose ➢ Dung dịch đệm TAE ➢ Micropipette ➢ 5μL mẫu DNAL mẫu DNA ➢ 10μL mẫu DNAL hỗn hợp Loading Dye GelRed ➢ Đèn UV Hình Thiết bị điện di Phương pháp tiến hành: Bước 1: Chuẩn bị gel agarose (nồng độ gel 2%) tạo giếng lược Bước 2: Đặt gel vào khay dung dịch đệm TAE (50ml) Bước 3: Trộn 5μL mẫu DNAL DNA với 10μL mẫu DNAL hỗn hợp Loading Dye GelRed Bước 4: Cho từ từ hỗn hợp trộn vào giếng mỉcropipette Bước 5: Điện di 100V 30 phút Bước 6: Soi gel đèn UV đọc kết Hình 5: Điện di gel agarose Sau mẫu nhân lên kỹ thuật RT – PCR kiểm tra điện di gel agarose 2% thấy vạch tương ứng khoảng 284bp Hình 6: Kết điện di sản phẩm RT - PCR khuếch đại đoạn gene noncoding E2 (Trần Đức Hoàn cộng sự, 2021) Kết luận: Cặp mồi CSF324/326 hoạt động tốt, khơng có tượng dimer, nhiệt độ bắt cặp khoảng 50-630C (Rios ctv, 2017; Elina ctv, 2017) khuếch đại thành công đoạn gen noncoding E2 virus CSF Điều chứng tỏ mẫu bệnh phẩm thu thập từ trang trại bị nhiễm bệnh dịch tả heo cổ điển Kiến nghị trang trại cần phải có biện pháp kiểm soát dịch bệnh để hạn chế lây lan, nên cách ly đàn heo bệnh tiêm vắc xin để giảm thiểu thiệt hại kinh tế Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Minh Nam, Nguyễn Thị Phương Bình, Lại Cơng Danh, Nguyễn Ngọc Hải (2022) Tạo dịng giải trình tự tồn gene E2 virus dịch tả heo cổ điển số trại heo miền nam Việt Nam Tạp chí khoa học công nghệ Đại học Thái Nguyên 227(10): 319 – 326 https://doi.org/10.34238/tnujst.6139 Trần Đức Hoàn, Đoàn Thị Thảo, Nguyễn Thị Hương Giang Nguyễn Đình Nguyên (2021) Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để phát virus dịch tả lợn dựa đoạn gen NCE Hội chăn nuôi Việt Nam https://hoichannuoi.vn/ung-dung-ky-thuat-rtpcr-de-phat-hien-virus-dich-ta-lon-dua-tren-doan-gen-nce.html Tài liệu tiếng nước Ganges, L., Crooke, H R., Bohórquez, J A., Postel, A., Sakoda, Y., Becher, P., & Ruggli, N (2020) Classical swine fever virus: the past, present and future Virus research, 289, 198151 https://doi.org/10.1016/j.virusres.2020.198151 Moormann, R J., & Hulst, M M (1988) Hog cholera virus: identification and characterization of the viral RNA and the virus-specific RNA synthesized in infected swine kidney cells Virus research, 11(4), 281–291 https://doi.org/10.1016/0168-1702(88)90002-0 Khatoon, E., Barman, N N., Deka, M., Rajbongshi, G., Baruah, K., Deka, N., Bora, D P., & Kumar, S (2017) Molecular characterization of classical swine fever virus isolates from India during 2012-14 Acta tropica, 170, 184–189 https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2017.03.004 Rios, L., Coronado, L., Naranjo-Feliciano, D et al Deciphering the emergence, genetic diversity and evolution of classical swine fever virus Sci Rep 7, 17887 (2017) https://doi.org/10.1038/s41598-017-18196-y Tài liệu nguồn internet Báo điện tử Đảng cộng sản Việt Nam (2023) Thúc đẩy phát triển chăn nuôi lợn tình hình https://dangcongsan.vn/kinh-te/thuc-day-phat-trien-chan-nuoilon-trong-tinh-hinh-moi-642817.html Hướng dẫn phương pháp phòng chống bệnh dịch tả lợn cổ điển https://vietanhviavet.com/phong-chong-benh-dich-ta-lon-codien/ Nguyễn Hằng (2019) Bệnh dịch tả lợn cổ điển (CSF), Bệnh gia súc - gia cầm - thú cưng - thủy sản https://thuoctrangtrai.com/benh-dich-ta-lon-co-dien-csfnd83603.html https://genesmart.vn/ky-thuat-dien-di-ngang-tren-gel-agarose https://genesmart.vn/ky-thuat-dien-di-ngang-tren-gel-agarose