Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCBÁO CÁO SEMINAR Trang 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ M
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
BÁO CÁO SEMINAR
THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Nhóm sinh viên thực hiện : NHÓM SÁNG THỨ NĂM – CA 2
TP Thủ Đức, 10/2023
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
BÁO CÁO SEMINAR
THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Đề tài: Thiết bị và kỹ thuật trong chuẩn đoán bệnh dịch tả heo cổ điển.
LÊ THỊ NGỌC THI
VÕ HUỲNH THẢO VY
TP Thủ Đức, 10/2023
Trang 4DANH SÁCH SINH VIÊN
Huỳnh Thị Kim Tuyến 21126567
Trang 5MỤC LỤC
Trang
DANH SÁCH SINH VIÊN i
MỤC LỤC ii
1 Giới thiệu 1
2 Kỹ thuật RT-PCR 2
3 Kỹ thuật điện di 3
4 Tài liệu tham khảo 6
ii
Trang 61 Giới thiệu
Hiện nay, ngành chăn nuôi heo ở Việt Nam phát triển với quy mô công nghiệp rộng
lớn Theo hội nghị “ Triển khai giải pháp thúc đẩy phát triển chăn nuôi heo trong tình hình mới” do Bộ NN-PTNT tổ chức đã công bố Việt Nam hiện đang là quốc gia có
ngành chăn nuôi heo đứng thứ 5 thế giới về số lượng đầu con, đứng thứ 6 về sản lượng thịt (năm 2022) Vì vậy việc kiểm soát và chuẩn đoán nhanh về tình hình dịch bệnh
trên heo là vấn đề rất cấp thiết đối với tất cả các trang trại ở nước ta Bệnh dịch tả heo
cổ điển (Classical swine fever disease) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy
hiểm và gây ra thiệt hại về kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi heo trên toàn thế giới CSFV thuộc chi Pestivirus trong họ Flaviviridae (Simmonds và cộng sự, 2017) Đây là virus RNA chuỗi đơn sợi dương, có độ dài 12 Kb mã hóa cho 4 protein cấu trúc và
protein phi cấu trúc (Moormann và Hulst, 1988) Gen E2 của CSFV có độ dài
1119bp mã hóa cho protein E2 có 373 amino acid, 51-55 kDa, là glycoprotein vỏ
chính và là kháng, nguyên đặc trưng của CSFV và có tính sinh miễn dịch cao nhất
trong số các protein của virus Trong bài này chúng tôi chỉ lựa chọn vùng gen
noncoding E2 thuộc một đoạn của gen E2 vì đây là vùng gen đặc hiệu của CSFV
Triệu chứng đặc trưng của bệnh dịch tả heo cổ điển có thể quan sát được là heo bỏ ăn cám, sốt cao trên 400C Đồng thời có các triệu chứng mệt mỏi, lờ đờ và có thể nôn
Vùng da mỏng ở mang tai, nách và bẹn có chấm nhỏ màu đỏ Sau đó chuyển dần sang màu tím Heo có triệu chứng khó thở, mạch đập nhanh và chết sau 1 đến 2 ngày mắc
bệnh (Theo Hướng dẫn phương pháp phòng chống bệnh dịch tả heo cổ điển)
Hình 1 Triệu chứng của bệnh dịch tả heo cổ điển
Trang 72 Kỹ thuật RT-PCR
B1 Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm: Mẫu huyết thanh và mô được thu thập từ một số trại
heo có biểu hiện bệnh CSF
B2 Ly trích, tinh sạch RNA của mẫu bệnh phẩm: Mẫu huyết thanh và mô bị nghi
ngờ nhiễm CSFV được ly trích RNA bằng kit GeneJET Viral DNA/ RNA
Purification Kit (Thermo, Mỹ)
B3 Tổng hợp cDNA: Sợi cDNA được tổng hợp bằng bộ kit RevertAid First Strand
cDNA Synthesis Kit (Thermo, Mỹ)
B4 Thiết kế mồi đặc hiệu cho vùng gen noncoding E2 của virus dịch tả heo cổ điển
Xác định gen mục tiêu: vùng gen noncoding E2 của virus dịch tả lợn cổ điển được giải trình với độ dài 284bp, mã hóa 93 axít amin, độ tương đồng 99% so với chủng đã công bố trên ngân hàng gen NCBI Trình tự ở 2 đầu 5’ và 3’ của gen đích được sử dụng để thiết kế mồi đặc hiệu cho vùng gen noncoding E2 virus CSF với các thông
số được thể hiện qua Bảng 1 Có thể sử dụng cặp mồi CSF324/326 dùng để phân tích di truyền virus dịch tả heo cổ điển lưu hành tại Việt Nam
Bảng 1 Trình tự cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT - PCR gen noncoding E2
(Trần Đức Hoàn và cộng sự, 2021)
B5 Khuếch đại mẫu bằng phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR)
Thành phần từng phản ứng RT- PCR gồm:
12,5 µl GoTaq G2 Green Master Mix
1,0 µl mỗi mồi (nồng độ cuối là 0,4 µM)
5 µl DNA mẫu và thêm nước Nuclease free water để đạt tổng thể tích 25 µl cho mỗi phản ứng
2
Trang 8Hình 2 Máy luân nhiệt
Chu trình luân nhiệt bao gồm:
Tiền biến tính: 1 chu kỳ 95°C trong 5 phút
Biến tính: 95°C trong 30 giây
Bắt cặp: 55°C trong 30 giây 35 chu kỳ
Kéo dài: 72°C trong 75 giây
Hậu kéo dài: 1 chu kỳ kết thúc tại 72°C trong 7 phút
Hình 3 Chu trình phản ứng PCR
Trang 93 Kỹ thuật điện di
Nguyên lý: Điện di DNA trên gel agarose là một kỹ thuật được sử dụng để phân tách
và phát hiện các đoạn DNA (hoặc các đại phân tử khác, chẳng hạn như RNA và protein) dựa trên kích thước và điện tích của chúng
Vật liệu và thiết bị:
➢ Máy điện di ngang
➢ Gel agarose
➢ Dung dịch đệm TAE
➢ Micropipette
➢ 5μL mẫu DNAL mẫu DNA
➢ 10μL mẫu DNAL hỗn hợp Loading Dye và GelRed
➢ Đèn UV
Hình 4 Thiết bị điện di
Phương pháp tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị gel agarose (nồng độ gel 2%) đã tạo giếng bằng lược
Bước 2: Đặt gel vào khay cùng dung dịch đệm TAE (50ml)
Bước 3: Trộn 5μL mẫu DNAL DNA với 10μL mẫu DNAL hỗn hợp Loading Dye và GelRed
Bước 4: Cho từ từ hỗn hợp đã trộn vào giếng bằng mỉcropipette
Bước 5: Điện di 100V trong 30 phút
4
Trang 10Bước 6: Soi gel dưới đèn UV và đọc kết quả
Hình 5: Điện di trên gel agarose
Sau khi mẫu được nhân lên bằng kỹ thuật RT – PCR và được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2% chỉ thấy trên một vạch duy nhất tương ứng khoảng 284bp
Hình 6: Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR khuếch đại được
đoạn gene noncoding E2 (Trần Đức Hoàn và cộng sự, 2021) Kết luận: Cặp mồi CSF324/326 đã hoạt động tốt, không có hiện tượng dimer, nhiệt độ bắt cặp khoảng 50-630C (Rios và ctv, 2017; Elina và ctv, 2017) và khuếch đại thành công đoạn gen noncoding E2 của virus CSF Điều này chứng tỏ mẫu bệnh phẩm thu thập từ trang trại đã bị nhiễm bệnh dịch tả heo cổ điển Kiến nghị trang trại cần phải có
Trang 11biện pháp kiểm soát dịch bệnh để hạn chế lây lan, nên cách ly đàn heo bệnh và tiêm vắc xin để giảm thiểu thiệt hại về kinh tế
4 Tài liệu tham khảo
Tài liệu tiếng Việt
1 Nguyễn Minh Nam, Nguyễn Thị Phương Bình, Lại Công Danh, Nguyễn Ngọc Hải (2022) Tạo dòng và giải trình tự toàn bộ gene E2 của virus dịch tả heo cổ điển ở một số trại heo tại miền nam Việt Nam Tạp chí khoa học và công nghệ Đại học Thái Nguyên 227(10): 319 – 326
https://doi.org/10.34238/tnu-jst.6139
2 Trần Đức Hoàn, Đoàn Thị Thảo, Nguyễn Thị Hương Giang và Nguyễn Đình Nguyên (2021) Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để phát hiện virus dịch tả lợn dựa trên đoạn gen NCE Hội chăn nuôi Việt Nam https://hoichannuoi.vn/ung-dung-ky-thuat-rt-pcr-de-phat-hien-virus-dich-ta-lon-dua-tren-doan-gen-nce.html Tài liệu tiếng nước ngoài
1 Ganges, L., Crooke, H R., Bohórquez, J A., Postel, A., Sakoda, Y., Becher, P., & Ruggli, N (2020) Classical swine fever virus: the past, present and future Virus research, 289, 198151 https://doi.org/10.1016/j.virusres.2020.198151
2 Moormann, R J., & Hulst, M M (1988) Hog cholera virus:
identification and characterization of the viral RNA and the virus-specific RNA synthesized in infected swine kidney
cells Virus research, 11(4), 281–291
https://doi.org/10.1016/0168-1702(88)90002-0
3 Khatoon, E., Barman, N N., Deka, M., Rajbongshi, G., Baruah, K., Deka, N., Bora, D P., & Kumar, S (2017) Molecular
characterization of classical swine fever virus isolates from
India during 2012-14 Acta tropica, 170, 184–189
https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2017.03.004
6
Trang 124 Rios, L., Coronado, L., Naranjo-Feliciano, D et al Deciphering
the emergence, genetic diversity and evolution of classical
swine fever virus Sci Rep 7, 17887 (2017)
https://doi.org/10.1038/s41598-017-18196-y
Tài liệu nguồn internet
1 Báo điện tử Đảng cộng sản Việt Nam (2023) Thúc đẩy phát triển chăn nuôi lợn trong tình hình mới
https://dangcongsan.vn/kinh-te/thuc-day-phat-trien-chan-nuoi-lon-trong-tinh-hinh-moi-642817.html
2 Hướng dẫn phương pháp phòng chống bệnh dịch tả lợn cổ điển https://vietanhviavet.com/phong-chong-benh-dich-ta-lon-co-dien/
3 Nguyễn Hằng (2019) Bệnh dịch tả lợn cổ điển (CSF), Bệnh trên gia súc - gia cầm - thú cưng - thủy sản
https://thuoctrangtrai.com/benh-dich-ta-lon-co-dien-csf-nd83603.html
4 https://genesmart.vn/ky-thuat-dien-di-ngang-tren-gel-agarose
5 https://genesmart.vn/ky-thuat-dien-di-ngang-tren-gel-agarose