ÁP DỤNG kỹ THUẬT QF PCR để CHẨN đoán CHO NHỮNG THAI có NGUY cơ CAO mắc hội CHỨNG DOWN

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Dị tật bẩm sinh vấn đề quan trọng ngày thu hút quan tâm ý toàn xã hội nói chung ngành y tế nói riêng Dị tật bẩm sinh không để lại hậu nặng nề, thiệt thòi lớn cho trẻ mà để lại gánh nặng lớn, ảnh hưởng tâm lý sâu sắc người mẹ lần mang thai Hội chứng Down (DS) bệnh lý có tần suất cao bệnh rối loạn NST Theo Who (1972) tần số hội chứng Down 120 – 150/100000 trẻ sơ sinh đẻ sống, có biểu đặc trưng hình thái chậm phát triển trí tuệ Tỷ lệ tử vong DS cao, khoảng 20% trẻ DS sinh chết trước tuổi 44% số trẻ DS lại sống tới tuổi 60, khơng có khả học tập làm việc [10, 26] Cho đến chưa có biện pháp điều trị bệnh di truyền nói chung hội chứng DS nói riêng, phòng hạn chế bệnh di truyền việc cấp thiết để giảm bớt bệnh tật di truyền, giảm bớt gánh nặng kinh tế tâm lý cho gia đình xã hội Việc chẩn đoán phát sớm bệnh di truyền thời kỳ phơi thai vơ cấp thiết để có biện pháp phòng xử lý kịp thời Hiện có nhiều kỹ thuật sàng lọc chẩn đốn trước sinh hội chứng DS như: siêu âm, dùng ba triple test (AFP, βHCG, uE3 ),FISH, nuôi cấy tế bào ối… Đối với phụ nữ có nguy cao mắc hội chứng DS thời kỳ mang thai đề nghị chọc ối để xét nghiệm di truyền tế bào thai theo phương pháp kinh điển đòi hỏi thời gian dài (14 – 18 ngày), với thể tích mẫu lớn (10 – 15 ml) mặt khác cặp vợ chồng đồng ý nên việc chẩn đốn gặp nhiều khó khăn Vấn đề đặt chẩn đoán trước sinh thời gian thực kỹ thuật để có câu trả lời sớm cho bà mẹ mang thai biết tình trạng Gần người ta phát trình tự lặp lại ngắn STR có tính đa hình cao số locus định NST số 21 Nhờ tiến hành phản ứng nhân gen PCR locus này, xác định số lượng alen hình ảnh điện di Do bất thường số lượng alen tương ứng với bất thường NST nên phương pháp ứng dụng để chẩn đoán hội chứng bất thường NST cách nhanh chóng xác mà khơng phải qua ni cấy tế bào Kỹ thuật QF – PCR gọi phản ứng chuỗi polymer hóa huỳnh quang định lượng dùng để khuếch đại STR Đây phương pháp xác định dị tật gen NST hiệu nhanh chóng phương pháp khác Với ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật trước đây, kỹ thuật QF – PCR có độ đặc hiệu cao, thời gian trả kết nhanh (1 – ngày), với thể tích mẫu nhỏ (0,5 – ml) giá thành thấp so với kỹ thuật FISH, nhân lực sử dụng khả áp dụng với quy mơ lớn, đáp ứng nhu cầu chẩn đốn cao Kỹ thuật ứng dụng phổ biến giới, Việt Nam kỹ thuật QF – PCR chúng tơi tiến hành đề tài “ Áp dụng kỹ thuật QF – PCR để chẩn đốn cho thai có nguy cao bị mắc hội chứng Down” với hai mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật QF – PCR để chẩn đoán trước sinh hội chứng Down Đánh giá giá trị kỹ thuật QF – PCR chẩn đoán trước sinh hội chứng Down Chương TỔNG QUAN 1.1 Lược sử nghiên cứu hội chứng Down Năm 1846 Seguin lần đầu mô tả hội chứng lâm sàng tên “Furfuraceous Idiocy” [2] Năm 1866 John Langdon Down mô tả kỹ tên gọi “Mongolia – Idiocy” sau nhà lâm sàng gọi hội chứng Down với đặc điểm chính: đặc điểm mặt (trong có mặt tròn, trán thấp, mắt xếch, gáy phẳng, giảm sản xương sống mũi), dị tật tim, chậm phát triển trí tuệ, thay đổi nếp vân da bàn tay [2, 49] Năm 1959 lần Lejeune J cộng phát nhân tế bào sinh dưỡng có 47 NST, thừa NST NST thừa có kích thước nhỏ, tâm đầu sau xác định NST thứ 21 nên hội chứng DS có tên gọi “Trisomy 21” [50] Năm 1960 Polani cộng báo cáo trường hợp rối loạn cấu trúc chuyển đoạn NST 21 gây hội chứng Down Fraccaco, Raijer Lindsten (1960) mô tả trường hợp Down chuyển đoạn NST nhóm G với (G/G) [37] Năm 1961 Clacke cộng tìm hội chứng Down thể khảm gồm dòng tế bào: dòng tế bào bình thường 46 NST, dòng tế bào bệnh lý có 47 NST (46,XX(XY)/47,XX(XY), +21 [38] 1.2 Tần suất hội chứng Down Hội chứng Down bệnh có tần suất cao bệnh rối loạn NST Theo Who (1972) tần suất 120 – 150/100000 trẻ sơ sinh, Anh tần suất 1,67/1000 trẻ sơ sinh [26] Hội chứng Down rối loạn số lượng, cấu trúc NST 21 dạng hay dạng khảm Theo Zoltán Papp 95% Down trisomy 21; 4% chuyển đoạn; 1% thể khảm [49] 1.3 Các bất thường NST gây nên hội chứng Down Bất thường NST hội chứng Down bao gồm bất thường số lượng cấu trúc NST, dạng dạng khảm [22, 43] Dạng tế bào thể có cấu trúc di truyền giống nhau, có dòng tế bào có bất thường số lượng cấu trúc NST 21 Dạng khảm cấu trúc di truyền tế bào thể khác nhau, tồn ≥ dòng tế bào, hội chứng Down hay gặp: dòng tế bào bình thường dòng tế bào bất thường số lượng cấu trúc NST 21 Trong năm gần kết hợp kỹ thuật di truyền phân tử lai chỗ, nhà di truyền học xác định gen có liên quan đến dấu hiệu lâm sàng hội chứng Down định vị vùng nhánh dài (q) NST 21 [29] Các gen liên quan đến hội chứng Down bao gồm: gen mã hóa protein superoxide dismutase (SOD – 1) alpha – A – Cristallin vị trí 21q22.1 21q22.3 Gen Gart ets – vị trí 21q21.1 21q22.2 Gen mã hóa Phosphofructokinase (pfkl) vị trí 21q22.3 Vùng 21q22.3 gây biểu kiểu hình Down điển hình như: chậm phát triển trí tuệ, đặc điểm đặc trưng mặt, bất thường tay dị tật bẩm sinh tim Phân tích mức phân tử vùng 21q22.1 – q22.3 thấy có chứa gen liên quan đến dị tật bẩm sinh tim Một gen DSCR1 phát vùng 21q21.1 – q22.2 biểu não, tim coi tác nhân gây dị tật tim chậm phát triển tâm thần hội chứng Down [47] Việc tìm gen mở hướng chẩn đoán hội chứng Down mức di truyền tế bào – phân tử mức phân tử 1.4 Nghiên cứu kiểu hình hội chứng Down Penrose L S Smith G.F (1966), Levine H (1971) [30, 35, 38] có nhận xét chung dấu hiệu triệu chứng đặc trưng đứa trẻ mắc hội chứng Down: mặt phẳng, khe mắt xếch, nếp quạt, miệng nửa mở, lưỡi dày thè Tai nhỏ thấp, hình thù biến dạng, cổ ngắn rộng, bàn tay ngắn rộng, ngón tay ngắn, nếp ngang lòng bàn tay, bàn chân ngắn, tật đa ngón, dính ngón, giảm trương lực Hình 1.1: Hình ảnh trẻ mắc hội chứng Down Dựa vào đặc điểm kiểu hình điển hình hội chứng Down, lâm sàng chẩn đốn 90% trẻ mắc hội chứng Down Tuy nhiên có số trường hợp trẻ có số dấu hiệu lâm sàng hội chứng Down như: mặt tròn phẳng, hai mắt xa nhau, tai nhỏ, chậm phát triển tâm thần…nhưng kết xét nghiệm di truyền tế bào lại bình thường, có lẽ đột biến chuyển đoạn nhỏ nhân đoạn vùng gen liên quan đến hội chứng Down Vì cần phải có nghiên cứu sâu kỹ thuật di truyền tế bào – phân tử di truyền phân tử 1.5 Xét nghiệm sàng lọc trước sinh hội chứng Down Sàng lọc trước sinh áp dụng cho phụ mang thai, biện pháp giúp ngăn ngừa không cho đứa trẻ bất thường bẩm sinh Xét nghiệm sàng lọc để phát chẩn đoán sớm bệnh di truyền nhằm tìm phương pháp phòng ngừa điều trị thích hợp Song xét nghiệm sàng lọc bước đầu, tiếp sau cần có xét nghiệm khẳng định để nâng cao giá trị tin cậy xét nghiệm sàng lọc Nhìn chung test sàng lọc dễ dàng thực quy trình lấy mẫu đơn giản, an tồn cho thai cho mẹ, phân tích mẫu nhanh, thơng tin sàng lọc có giá trị, giá phù hợp cộng đồng chấp nhận Sau chúng tơi xin trình bày số phương pháp sử dụng cho sàng lọc trước sinh thai DS: - Test sàng lọc theo tuổi mẹ - Test sàng lọc siêu âm - Test sàng lọc định lượng số chất huyết mẹ 1.5.1 Test sàng lọc theo tuổi mẹ: Qua nhiều cơng trình nghiên cứu người ta thấy tần số sinh sản bị dị tật bẩm sinh có liên quan nhiều tới tuổi mẹ Như hội chứng Down Bảng 1.1: Mối liên quan tuổi mẹ tần suất sinh rối loạn NST Trong 1000 bà mẹ (Jeffuy A, 1977) [25] Tuổi mẹ 47, +21 33 2,4 34 3,1 35 4,0 36 5,2 37 6,7 38 39 40 8,7 11,2 14,5 41 18,7 42 24,1 43 31,1 44 40,1 45 51,8 46 68,8 47 88,2 48 111,2 49 143,5 Các nguy bất thường NST thai tăng lên theo tuổi mẹ Ở bà mẹ tuổi cao > 35 tuổi nguy không phân ly NST xảy trứng ngày tăng Tuổi mẹ cao nguy sinh dị tật cao Theo số tác giả, điều giải thích q trình phát sinh trứng; nỗn bào I hình thành giai đoạn phôi muộn (khoảng tháng thứ sau hợp tử hình thành) tế bào giam hãm giai đoạn nhiều năm, sau tuổi dậy số noãn bào phát triển tiếp tục phân bào giảm nhiễm để tạo thành trứng Khi trình thụ tinh xảy trình giảm nhiễm kết thúc Như tuổi mẹ cao, trứng chịu nhiều tác động với yếu tố phơi nhiễm làm tăng nguy không phân chia NST trình phân bào Người ta nhận thấy bà mẹ trẻ (dưới 20 tuổi) nguy sinh bị DS lớn bà mẹ 20 – 29 [28] Ở số nước, người ta tiến hành chọc hút dịch ối tất thai phụ ≥ 35 Tuổi bố cao > 55 tuổi yếu tố tăng nguy sinh dị tật Do qua điều tra bố mẹ ta phát nhóm nguy cao sinh dị tật 1.5.2 Test sàng lọc siêu âm Qua nhiều cơng trình nghiên cứu nhiều tác giả tới kết luận siêu âm sử dụng chẩn đốn khơng có hại cho người, nhiên nên siêu âm cần thiết Khác với chụp X quang, sàng lọc siêu âm hại cho mẹ, cho thai, cho người thực kiểm tra [5, 33] Vì với siêu âm thường quy thường áp dụng tuần 12, 22 32 Siêu âm kiểm tra khả sống thai, số lượng thai, tuổi thai phát bất thường hình thái thai nhi Việc phát thai bị dị tật thường tiến hành ba tháng giữa, sau số hình ảnh điển hình liên quan tới thai có hội chứng DS [3] - Thai phát triển bình thường - Khoảng mờ sau gáy (độ dày da gáy) > 3mm tháng đầu, ≥ mm ba tháng - Ngắn xương cánh tay xương đùi (< 0,91 chiều dài mong đợi, tỷ lệ chiều dài xương đùi/ dài vòng bụng thấp mong đợi) - Những dị tật tim bẩm sinh (dị tật vách ngăn tâm thất, vách ngăn tâm nhĩ thường hay gặp nhất) - Hẹp tá tràng (dấu hiệu bong bong đôi tháng thai cuối) - Giãn bể thận - Đa ối - Giảm sản đốt ngón tay út - Thốt vị rốn - Thốt vị não 1.5.3 Test sàng lọc định lượng số chất huyết mẹ Những chất huyết thai phụ dùng để phát thai dị tật bẩm sinh phổ biến là: AFP (alpha fetoprotein), HCG (human chorionic gonodotropin), uE3 (unconjugated estriol), Inhibin A, PAPA-A (prenancy Associated plasma protein - A) [6] 1.5.3.1 AFP (alpha fetoprotein) *Nguồn gốc: AFP sản xuất từ túi noãn hồng gan bào thai, đến cuối thời kì phơi túi nỗn hồng teo gan sản xuất chủ yếu AFP glucoprotein có trọng lượng phân tử 69 Kdalton chứa 4% carbon, với thành phần protein alphaglobulin Thời gian bán huỷ dịch ối huyết AFP 3-5 ngày *Nồng độ AFP Trong huyết thai thấy vào tuần thứ 6, tiếp tục tăng lên đến tuần thứ 12 trì đến tuần thứ 30 mức - mg/ml; sau giảm dần sinh 10 - 150µg/ml tiếp tục giảm tháng tuổi nồng độ AFP trở gần giống người trưởng thành < 10ng/ml Trong dịch ối phát vào tuần thứ thai nhi, khuếch tán từ thai vào dịch ối qua bánh rau sau tuần thứ 10 có nước tiểu thai nhi cung cấp, tăng cao vào tuần 12 - 14 thai giảm xuống khoảng 1000 ng/ml tuần 20, thời điểm có tăng đột ngột thể tích dịch ối Nồng độ AFP tăng ổn định từ tuần tuần thai 15 – 20 [49] Nồng độ AFP dịch ối 1/200 - 1/100 nồng độ AFP huyết thai nhi Trong máu mẹ thấy vào tuần thứ - 11 UI/ml sau tăng dần đến tuần thứ 30 với nồng độ thấp bẳng 1/50000 nồng độ AFP huyết thai 1/500 dịch ối [49] AFP chủ yếu khuếch tán từ huyết thai vào dịch ối qua bánh rau tới tuần hoàn mẹ Trên sở nồng độ AFP ổn định tuần thai kể từ tuần 11 trở đi, đặc biệt từ tuần 15 trở đi, số nghiên cứu nghiên cứu xác định AFP huyết mẹ giảm số bất thường NST: hội chứng Down, hội chứng Turner, Trisomi 18 Nồng độ AFP huyết mẹ giảm < 0,7 MoM (MoM bội số giá trị trung vị: Multiple of median) 1.5 3.2 βHCG (Human chorionic gonodotropin) *Nguồn gốc: βHCG chất glucoprotein tế bào nuôi tiết, thấy HCG nước tiểu vào ngày thứ sau thụ thai *Nồng độ βHCG: βHCG tăng nhanh đạt tối đa vào tuần - sau giảm dần vào tuần thứ 12 trì đẻ Có thể định lượng lương βHCG dịch ối, huyết nước tiểu mẹ Nồng độ HCG cao chửa trứng, đặc biệt ung thư rau thai Người ta thường định lượng βHCG tự giai đoạn tháng thai đầu, βHCG tồn phần thường sử dụng từ tháng thai Ở thai DS nồng độ βHCG huyết mẹ cao so với thai bình thường [14, 25, 49] 1.5 3.3 uE3 (Unconjugated estriol) estriol không liên hợp *Nguồn gốc: uE3 hoàng thể tiết, từ tháng thứ trở có thêm rau tiết 10 *Nồng độ uE3 : tăng dần máu mẹ suốt thời kì mang thai, cao vào tháng thứ đến ngày đẻ giảm dần uE qua bánh rau vào tuần hồn mẹ nên định lượng máu mẹ Do có dao động lớn nồng độ, đánh giá giá trị uE3 việc so sánh với nồng độ bình thường người ta thường xét nghiệm hai lần để đánh giá trình phát triển thai Nồng độ uE3 giảm chứng tỏ tình trạng suy yếu bánh rau thai nhi uE có dao động lớn nồng độ thời gian bán huỷ máu mẹ 20 - 30 phút nên cần ý khâu bảo quản mẫu Trong hội chứng Down nồng độ uE3 giảm [18, 25] 1.5.3.4 Inhibin A Là protein có nguồn gốc thai nhi bánh rau màng thai nguồn tiết chủ yếu Inhibin glycoprotein gồm chuỗi α, β (gồm loại βA, βB ) Nếu chuỗi α liên kết với βA gọi Inhibin A, chuỗi α liên kết với βB gọi Inhibin B Qua nhiều nghiên cứu phát mức Inhibin A tăng thai có hội chứng Down với mức sàng trung bình 1,63 MoM [15, 42] 1.5.3.5 PAPP-A (pregnancy associated plasma protein A) Là glycoprotein có nguồn gốc từ bánh rau [31], thường dùng tháng đầu thai kỳ Đối với thai Down nồng độ PAPP-A thường giảm với mức sàng trung bình 0,97 MoM [9, 16, 45, 46] 1.5.3.6 Phối hợp phương pháp định lượng test sàng lọc Test sàng lọc thực ba tháng phổ biến, nhiên tháng đầu test sàng lọc đem lại giá trị cao Các test sử dụng [41]: * Trong tháng đầu, test thực thường quy như: - Douple test: PAPP-A + βHCG Hoặc phối hợp thêm đo độ dày da gáy để tăng hiệu sàng lọc 32 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ Nên triển khai nhiều sở nghiên cứu Tiếp tục nghiên cứu để đáp ứng tình hình chẩn đốn trước sinh Việt Nam 33 KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI: “Áp dụng kỹ thuật QF – PCR để chẩn đốn cho thai có nguy cao bị mắc hội chứng Down” Thời gian Nhân lực/ người chịu trách nhiệm Từ 1/1 đến 30/1/2012 Nhóm nghiên cứu Từ 30/1 đến 8/2/2012 Chủ trì Nhóm nghiên cứu Chủ trì Nhóm nghiên cứu Phân tích số liệu xử lý, viết nháp báo cáo Từ 09/2 đến 10/2/2012 Từ 10/2 đến 30/08/2012 Từ 30/08 đến 02/09/2012 Từ 02 /09 đến 09/09/2012 Từ 09/09 đến 20/09/2012 Thảo luận hoàn thiện báo cáo khoa học Từ 20/09 đến 25/09/2012 Báo cáo nghiệm thu đề tài Từ 25/09 đến 30/09/2012 Cơng việc Hồn thiện đề cương nghiên cứu Hồn thiện thủ tục hành với BM (xin phép triển khai nghiên cứu) Tập huấn cán nghiên cứu Thu thập số liệu Lám xử lý số liệu Làm Slide Nhóm nghiên cứu Nhóm nghiên cứu Nhóm nghiên cứu Nhóm nghiên cứu Chun gia Chủ trì Nhóm nghiên cứu Chủ trì Nhóm nghiên cứu Ngày cơng 34 DỰ TRÙ KINH PHÍ STT 10 11 Công việc Tham khảo tài liệu Xây dựng đề cương Chuẩn bị công cụ NC Thu thập số liệu Nhập xử lý số liệu Viết sửa đề tài Phơ tơ - Văn phòng phẩm Hóa chất vật tư Điện thoại Đi lại Chi phí phát sinh Tổng Đơn giá x nhân công 300.000đ x 1công 300.000đ x công 100.000đ x công 200.000đ x 3công 500.000đ x công 300.000đ x công 2.200.000 x 30 mẫu Thành tiền 300.000đ 300.000đ 100.000đ 600.000đ 500.000đ 600.000đ 1.400.000đ 66.000.000đ 500.000đ 500000đ 500.000đ 71.300.000 đ TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Duy Bắc (2011), "Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QF - PCR chẩn đoán trước sinh số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể thường gặp." Báo cáo tổng kết năm 2010 Trịnh Văn Bảo Trần Thị Thanh Hương, Di truyền y học 2011: Nhà xuất giáo dục Việt Nam Trần Danh Cường (2006), "Một số nhận xét dấu hiệu gợi ý siêu âm trường hợp thai nhi có bất thường NST." Hội nghị khoa học chuyên đề chẩn đoán trước sinh, Sở Y tế Hà Nội Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002), "Sinh học phân tử." Nhà xuất giáo dục 2002 tr 153 - 159 Phan Trường Duyệt (1999), "Kỹ thuật siêu âm ứng dụng sản phụ khoa." tr 12, 24 - 25, 31 - 32 Hoàng Thị Ngọc Lan., Trịnh Văn Bảo., ADN Trần Thị Thanh Hương (2007), "Sàng lọc thai hội chứng Down định lượng AFP, βHCG huyết mẹ." Tạp chí nghiên cứu y học vol 47 Hồng Thu Lan (2004), "Hoàn chỉnh kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang bước đầu ứng dụng chẩn đoán trước sinh hội chứng Down." Luận văn thạc sĩ y học, Trường đại học Y Hà Nội II TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Bennett P ADN Nicolini U (1977), "Fetal infections In Moise KJ, Fisk NM, eds, " Fetal Therapy New York: Cambridge University Presspp 92 - 116 Bersinger N A ADN et al (2003), "First trimester maternal serum PAPP - A, SP1 ADN M - CSF levels in normal ADN trisomic twin pregnancies." Prenat Diagn 23, pp 157 - 162 10 Brard P.A ADN Sadovnick A.D (1998), "Life expectancy in Down syndrome adults." Lancetpp 1354 - 1356 11 Cartolano R., Guerneri S., Fogliani R., ADN et al (1993), "Prenatal confirmation of trisomy 12 mosaicism by fetal skin biopsy." Prenat Diagn 13, pp 1057 - 1059 12 Cemat G (1998), "RADNomized trial to assess safety ADN fetal outcome of early ADN midtrimester amniocentesis." Lancet 351, pp 1435 13 Christiano AM ADN Uitto J (1993), "ADN - based prenatal diagnisis of heritable skin diseases." Arch Dermatol 129, pp 1455 - 1459 14 Cuckle H S., Canick J A., ADN Kellner L H (1999), "On behaf of the Collaborative Study group Collaborative study of maternal urine beta core hCG screening for Down's syndrome." Prenatal diagnosis 19, pp 911 - 917 15 Cuckle H S., Holding S., Jone R., ADN et al (1996), "Combining inhibin A with existing second trimester markers in maternal serum screening for Down's syndrome, Prenatal Diagnosis." 16, pp 1095 - 1100 16 Cuckle H S., K Spencer., ADN K H Nicllaides (2005), "Down syndrome screening marker level in women with a previous aneuploidy pregnancy." Prenat Diagn 25, pp 47 - 50 17 Donner c., Rypens F., Paque V., ADN et al (1995), "Cordocentesis for rapid karyotype 421 consecutive cases." Fetal Diagn Ther 10, pp 192 - 199 18 DRG instruments GmbH Germany "Estriol ELISA test for the Quantitative determination of free estriol in human serum of plasma." Cat No 55044 19 Dunk L K ADN Godmilow L (1990), "A comparison of loss rates for first trimester chorionic villus sampling early amniocentesis ADN midtrimester amniocentesis in a population of women of advanced age." am J Hum Genet 47, pp A237 20 Eady R A J., Holbrook K A., Blanchet - Bardon C., ADN et al (1993), "Chair's summary: prenatal diagnosis of skin diseases In Burgdorf WHC Katz SI, eds Dermatology, Progress ADN perspectives New York." Parthenon Publishinpp 1159 - 1165 21 Elisabeth S B (1994), "Characterization of extra structurally abnormal chromosome by in situ hybridization." Stockholm 1994 22 German J (1998), "Cytogenetics aspects of human disease in the Harrison's principles of internal medicine 14ed " pp 395 - 403 23 Henderson K G., Shaw T E., Barrett I J., ADN et al (1996), "Distribution of mosaicism in human placenta." Hum Genet 97, (pp 650 - 654.) 24 Ileana B B., Maya R R., OrlADNo Z R., ADN Bertha R E (2005), "Biochemical serum markers for Down syndrome screening." Rev Biomed 16, pp 259 - 271 25 Jeffrey A., et al (1996), "Prenatal diagnosis ADN Reproductive genetics." Chapter 4, 11, 12, 15, 18, 19 26 Joan Noble (1998), "Natural history of down's syndrome: a brief review for those involvel in antenatal screening." J Med Screen 5pp 172 - 177 27 Jockson L., Zachary J., ADN Fowler S (1992), "RADNomized comparison of trancervical ADN transabdominal chorionic villus sampling." New EnglADN Journal of Medicine 327, pp 594 - 598 28 Khuong Truong ADN et al (2003), "Rapid prenatal diagnosis of Down syndrome using quantitative fluorescence in situ hybridization on interphase nucleic." Prenat Diagn 23, pp 146 - 151 29 Korenberg J R., Erickson J D., Cordero J F., ADN et al (1990), "Congenital malformations ADN intrauterine growth retardation: A population study." Pediatries Vol 82 N01, pp 83 - 90 30 Levin H (1971), "Group G (21, 22) chromosomal anomalies." Clinical cytogenetics, pp 369 - 434 31 Lin T M., Halbert S P., Kiefer D., ADN et al (1974), "Characrerisation of four human prenancy - associated plasma proteins." Am Jobstet gynecol 118, pp 223 - 226 32 Lowe C., AlexADNer D., ADN Bryla D (1978), "WICHD Amniocentesis Registry The safety ADN accuracy of midtrimester amniocentesis." Washington, DC: US Departmenr of Health, Education ADN Welfare 33 Nancy C ADN Chescheir (1997), "Sonographic Identification of Fetal Aneuploidy." Prenatal diagnosis ADN reproductive genetics 15, pp 108 - 114 34 National Institute of Child Health ADN Human Development ADN National Registry for Amniocentesis study Group (1976), "Mid Trimester amniocentesis for prenatal diagnosis: safety ADN accuracy " J Am Med Assoc 236, pp 1471 - 1476 35 Penrose L S (1963), "Finger print, palms ADN chromosome." Nature pp 933 36 Penso C A ADN et al (1990), "Early amniocentesis: report of 407 cases with new born follow up." Obstet Gynecol 81, pp 1032 37 Robson E.B (1981), "Gene mapping chromosome 21 history methology." Vol 21pp 147 - 153 38 Smith G.F ADN Berg J (1974), "The biological significance of mongolism." Brisr - J - Psychiat Vol 125pp 537 - 541 39 Steele M W ADN Breg W R (1966), "Chromosome analysis of amniotic - fluid cells." Lancet 1, pp 383 - 385 40 T abor A ADN et al (1986), "RADNomised controlled trial of genetic amniocentesis in 4606 low - risk women." Lancet 1, pp 1287 - 1293 41 T Stojilkovic Mikic ADN C H Rodeck (2003), "Screening for Chromosomal Anomalies: First or Second Trimester, Biochemical or Ultrasound." Annal Academy of Medicine vol 32 No 42 Thirunavukarasu P., Lambert., Messerlian G., ADN et al (2002), "Molecular weight forms of inhibin A, inhibin B ADN protein C in maternal serum, amniotic fluid ADN placental extracts of nomal ADN Down syndrome prenancies." Prenat Diagn 22, pp 1086 - 1092 43 Thompson J.S ADN Thompson M.W (1980), "Chromosomal aberration." Genetic in medicine third editition,WB saunders company, pp 142 - 165; 320 - 330 44 User's Manual (2011), "Multiplex QF - PCR kit for rapid detection of trisomy 13, 18, 21 ADN sex chromosomes aneuploidies." 45 Wald N J., Cuckle H S., Densem J W., ADN et al (1988), "Maternal serum screening for Down's syndrome in early pregnancy." BMJ 297, pp 883 - 887 46 Wald N J., George L., Smith D., ADN et al (1996), "Serum screening for Down's syndrome between ADN 14 weeks of pregnancy." British Journal of Obstetrics ADN Gynecology 103, pp 407 - 412 47 Wang S ADN et al (2003), "Molecular diagnosis of Down's syndrome." Chin Med J 2003, 116 (11), pp 1773 - 1775 48 Wilson R D., Farquharson D F., Wittmann B K., ADN et al (1994), "Cordocentesis: overall pregnancy loss rate as important as procedure loss rate." Fetal Diagn Ther 9, pp 142 - 148 49 Zoltán Papp (1990), "Obstetric Genetics." Akademiai kiado Budpest Chapter 20, 21,60 50 ZzLejeune J., Gauthier M., ADN T R (1959), "Étude des chrosomes somatiques de neuf enfants mongolients." Comptes rendus hebdomadaires des seesances de l'accade'mie des sciences vol 284pp 602 - 603 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic AFP Alfa feto – protein ARN Acid Ribonucleic DS Hội chứng Down FISH Fluorescent in situ hybridization NST Nhiễm sắc thể PAPP – A Pregnancy – associated plasma protein A PCR Polymerase chain reaction QF – PCR Quantitative fluorescence – polymerase chain reaction STR Short tandem repeat uE3 Unconjugate Estriol – Estriol không liên hợp βhCG Beta – human chronic gonadotropin PHỤ LỤC Kỹ thuật chọc hút nước ối - Quy trình chọc hút nước ối - Chỉ định chọc hút nước ối - Tuổi thai thực chọc hút nước ối - Chuẩn bị dụng cụ người thực chọc hút nước ối - Kỹ thuật tiến hành chọc hút nước ối MẪU BỆNH ÁN Họ tên: Mã bệnh nhân: Tuổi mẹ Tuổi thai: < 35 tuổi > 35 tuổi Từ 14 - < 21 tuần Tuổi bố > 21 tuần Tiền sử sản khoa: Para (sinh, sớm, sảy, sống): Tiền sử: 5.1 Sảy thai, thai chết lưu: lần Hai lần 5.2 Đã có bị Down: Một > Hai > Ba lần 5.3 Con bị dị tật khác: 5.4 Bố mẹ mang NST chuyển đoạn: 5.5 Tiền sử khác: Siêu âm: 0: khơng có SA 1: Có siêu âm 6.1 Kết SA: KSSG < mm KSSG > 3mm 6.2 Kết khác: Tripble douple test: 0: khơng có 1: có 7.1 Kết cho HC Down nguy thấp nguy cao 7.2 Kết HC Down tuổi mẹ: nguy thấp nguy cao 7.3 Kết cho HC Edwards nguy thấp nguy cao 7.4 Kết cho trisomy 13 nguy thấp nguy cao 7.5 Kết cho dị tật ống TK nguy thấp nguy cao Kết QF – PCR: Ngày làm xét nghiệm: Ngày đọc kết quả: Tổng thời gian làm xét nghiệm: 8.1 Bình thường hội chứng Down HC khác Down 8.2 Phân bố tỷ lệ: D21S1414: 1.Tỷ lệ 1:1 hay 2.Tỷ lệ 2:1 Tỷ lệ 1:1:1 D21S1446: 1.Tỷ lệ 1:1 hay 2.Tỷ lệ 2:1 Tỷ lệ 1:1:1 D21S1411: 1.Tỷ lệ 1:1 hay 2.Tỷ lệ 2:1 Tỷ lệ 1:1:1 D21S1435: 1.Tỷ lệ 1:1 hay 2.Tỷ lệ 2:1 Tỷ lệ 1:1:1 Kỹ thuật di truyền tế bào: 9.1 Kết quả: Bình thường HC Down 9.2 Công thức: 46, XX 46, XY 47,XX,+21 47,XY,+21 HC khác Khác: MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN 1.1 Lược sử nghiên cứu hội chứng Down .3 1.2 Tần suất hội chứng Down 1.3 Các bất thường NST gây nên hội chứng Down 1.4 Nghiên cứu kiểu hình hội chứng Down 1.5 Xét nghiệm sàng lọc trước sinh hội chứng Down 1.5.1 Test sàng lọc theo tuổi mẹ: 1.5.2 Test sàng lọc siêu âm 1.5.3 Test sàng lọc định lượng số chất huyết mẹ 1.6 Các phương pháp lấy mẫu dùng chẩn đoán trước sinh thai Down .11 1.6.1.Phương pháp lấy tế bào trực tiếp 11 1.6.2 Phương pháp lấy tế bào thai gián tiếp từ máu mẹ .14 1.7 Kỹ thuật di truyền áp dụng để chẩn đoán trước sinh thai bị Down .14 1.7.1 Chẩn đoán phương pháp di truyền tế bào 14 1.7.2 Chẩn đoán trước sinh phương pháp di truyền tế bào – Phân tử kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang (FISH) 15 1.7.3 Chẩn đoán phương pháp di truyền phân tử - Kỹ thuật QF 16 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Địa điểm lấy mẫu địa điểm phân tích mẫu 18 2.2.1 Địa điểm lấy mẫu 18 2.2.2 Địa điểm phân tích mẫu 18 2.3 Thời gian .18 2.4 Phương tiện nghiên cứu 18 2.4.1 Dụng cụ .18 2.4.2 Hóa chất .19 2.5 Phương pháp nghiên cứu 19 2.5.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm mô tả 19 2.5.2 Cỡ mẫu: N = 70 19 2.6 Kỹ thuật sử dụng 19 2.6.1 Tách chiết ADN 20 2.6.2 Phương pháp định lượng ADN 21 2.6.3 Khuếch đại trình tự STR kỹ thuật QF – PCR .22 2.6.4 Điện di máy ABI 3130 XL 23 2.6.5 Phân tích kết 24 2.7 Xử lý phân tích số liệu 26 DỰ KIẾN KẾT QUẢ 27 3.1 Một số đặc điểm sinh học nhóm đối tượng nghiên cứu .27 3.1.1 Các đối tượng làm xét nghiệm 27 3.1.2 Đặc điểm người mẹ mang thai 27 3.1.3 Tiền sử sản khoa 27 3.2 Kết QF - PCR 27 3.2.1 Nhận xét kết làm QF – PCR với tuần thai 27 3.2.2 Số lượng thai phát kỹ thuật QF – PCR 28 3.2.3 Độ xác phân bố theo tỷ lệ alen NST 21 29 3.3 Đánh giá giá trị kỹ thuật QF - PCR 29 DỰ KIẾN BÀN LUẬN 30 4.1 Đặc điểm nhóm đối tượng nghiên cứu 30 4.2 Kết QF – PCR 30 4.3 Đánh giá giá trị kỹ thuật QF – PCR với kỹ thuật di truyền tế bào.30 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 31 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO .35 ... QF – PCR để chẩn đoán cho thai có nguy cao bị mắc hội chứng Down với hai mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật QF – PCR để chẩn đoán trước sinh hội chứng Down Đánh giá giá trị kỹ thuật QF – PCR chẩn đoán. .. với kỹ thuật FISH, nhân lực sử dụng khả áp dụng với quy mô lớn, áp ứng nhu cầu chẩn đoán cao Kỹ thuật ứng dụng phổ biến giới, Việt Nam kỹ thuật QF – PCR tiến hành đề tài “ Áp dụng kỹ thuật QF. .. trẻ mắc hội chứng Down Dựa vào đặc điểm kiểu hình điển hình hội chứng Down, lâm sàng chẩn đốn 90% trẻ mắc hội chứng Down Tuy nhiên có số trường hợp trẻ có số dấu hiệu lâm sàng hội chứng Down