ứng dụng kỹ thuật rt pcr trong xét nghiệm chuẩn đoán covid 19 nhóm 9

Sự cần thiết của việc chuẩn đoán chính xác COVID-19Xác định bệnh nhân nhiễm COVID-19, điều trị kịp thời, giúp giảm nguy cơ bệnh trở nặng và tăng cơ hội phục hồi nhanh chóng.Xác định cá

Chủ đề: ỨNG DỤNG KĨ THUẬT REALTIME PCR TRONG XÉT NGHIỆM CHUẨN ĐOÁN

COVID 19

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH Khoa Khoa Học Sinh Học

Môn học: Thiết bị và kĩ thuật CNSH GVHD: TS Huỳnh Văn Biết

Ks Trương Quang Toản

Nội Dung

Giới thiệu chung

01

Tình hình dịch COVID-19

COVID-19 là một đại dịch toàn cầu gây ra bởi một loại vi rút gọi là SARS-CoV-2 Đây là bệnh viêm đường hô hấp lây truyền qua tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với dịch tiết hô hấp của người nhiễm bệnh

Theo WHO, tại Việt Nam đã có tới 11,612,608 trường hợp; 10,638,168 (92,1%) người hồi phục và 43,206 (0,5%) người tử vong.

Sự cần thiết của việc chuẩn đoán chính xác COVID-19

Xác định bệnh nhân nhiễm COVID-19, điều trị kịp thời, giúp giảm nguy cơ bệnh trở nặng và tăng cơ hội phục hồi nhanh chóng.

Xác định các nguồn lây COVID-19, người nhiễm bệnh và cách ly, ngăn chặn sự lây lan của COVID-19 trong cộng đồng.

Chuẩn đoán chính xác giúp quản lý tài nguyên y tế, đảm bảo rằng các bệnh viện và cơ sở y tế có đủ trang thiết bị và nguồn nhân lực để điều trị.

Kỹ thuật Realtime RT-PCR đã trở thành một công cụ quan trọng trong xét nghiệm chuẩn đoán COVID-19, cho phép xác định gen của vi rút SARS-CoV-2 trong mẫu thông qua quá trình nhân bản mẫu ADN.

Vật liệu và phương pháp 02

Realtime RT-PCR

• Là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA được theo dõi trực tiếp theo từng chu kỳ nhiệt

• Đo tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ phản ứng tỉ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành

Realtime RT-PCR

•Là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA được theo dõi trực

tiếp theo từng chu kỳ nhiệt

•Đo tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ phản ứng tỉ lệ

thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành

Khái niệm realtime RT-PCR

Nguyên tắc hoạt động realtime RT-PCR

Các thành phần trong một phản ứng realtime RT-PCR: DNA mẫu, đoạn mồi,

nucleotide (dNTPs) và DNA polymerase chịu nhiệt Diễn ra qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn biến tính: Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt đến 94-95°C, thời gian biến tính có thể tăng lên nếu thành phần khuôn có nhiều GC.

Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-65°C trong 20-40 giây Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ phản ứng tăng lên 72°C, đây là nhiệt độ tối ưu cho

hoạt động tổng hợp mạch mới của DNA polymerase

Cấu trúc bộ gen của SARS-CoV-2

Đặc điểm cấu trúc gen của vi rút SARS-CoV-2

Vi rút hình cầu, đường kính ~ 125 nm Các protein bề mặt nổi lên hình gai Bộ gen SARS-CoV-2 gồm có: vùng

5’UTR, khung đọc mở (ORF), phức hợp sao chép (ORF1a và ORF1b), gen gai (S), gen vỏ (E), gen màng (M), gen bao nhân (N), vùng 3’UTR, một số gen phi cấu trúc và một đuôi poly (A)

Các biến thể của vi rút SARS-CoV-2

 Được WHO phân thành 2 loại: biến thể đáng lo ngại (VOC) và biến thể đáng quan tâm (VOI)  VOC là một biến thể có khả năng lây truyền cao hơn, tăng độc lực, khả năng kháng vắc-xin hoặc

miễn dịch, có khả năng trốn việc phát hiện, chẳng hạn như Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2) và Omicron (B.1.1.529)

 VOI là một biến thể chứa các đặc điểm di truyền làm vi rút có khả năng lây lan cao hơn, tránh được hệ miễn dịch, khó phát hiện,làm cho bệnh nặng hơn Hiện tại không có biến thể virus corona được xác định thuộc trên

Thời gian ủ bệnh và triệu chứng lâm sàng

 Các triệu chứng thường bắt đầu 5–6 ngày sau khi tiếp xúc và kéo dài 1–14 ngày.

 Các triệu chứng phổ biến: sốt, ớn lạnh, đau họng.

 Các triệu chứng ít phổ biến hơn: đau cơ, nặng tay chân, mệt mỏi, chảy nước mũi, nghẹt mũi, hắt hơi, đau đầu, chóng mặt, tức ngực, hụt hơi, giọng khàn, chán ăn, buồn nôn, nôn, đau bụng hoặc tiêu chảy, khó ngủ.

Thu thập mẫu

Quy trình realtime RT-PCR phát hiện Sars-Cov-2

Mẫu bệnh phẩm lấy từ đường hô hấp trên (dịch tỵ hầu, dịch họng, dịch mũi, dịch rửa mũi/tỵ hầu, súc họng.

Mẫu bệnh phẩm đường hô hấp dưới (dịch đờm, dịch phế nang, dịch nội khí quản, dịch màng phổi, dịch tiết đường tiêu hóa qua hậu môn)

Mồi và đầu dò trong realtime RT-PCR cho vi rút Sars-Cov-2

Thực hiện phản ứng realtime RT-PCR

Quy trình realtime RT-PCR phát hiện Sars-Cov-2

Hình 1 2 Mồi và đầu dò trong realtime RT-PCR cho vi rút SARS-CoV-2

Xét nghiệm sàng lọc đầu tiên: Xét nghiệm trên gen E.

Xét nghiệm khẳng định: Xét nghiệm trên gen

 Xét nghiệm sàng lọc Sars-Cov-2 bằng gene E

Quy trình Real-time PCR phát hiện Sars-Cov-2

Bảng 1 Thể tích mastermix (20μl) + mẫu RNA (5μl)l) + mẫu RNA (5μl) + mẫu RNA (5μl)l)Thành phần mastermixThể tích

Nước (RNAse free)3.6 μl) + mẫu RNA (5μl)l2x Reaction mix12.5 μl) + mẫu RNA (5μl)lMgSO4 (50mM)0.4 μl) + mẫu RNA (5μl)lPrimer E_Sarbeco_F1 (10µM)1 μl) + mẫu RNA (5μl)lPrimer E_Sarbeco_R2 (10µM)1 μl) + mẫu RNA (5μl)lProbe E_Sarbeco_P1 (10µM)0.5 μl) + mẫu RNA (5μl)lSSIII/Taq EnzymeMix1 μl) + mẫu RNA (5μl)l

 Xét nghiệm khẳng định Sars-Cov-2 bằng RdRp

Quy trình Real-time PCR phát hiện Sars-Cov-2

Bảng 3 Thể tích mastermix (20 μl) + mẫu RNA (5μl)l) + mẫu RNA (5 μl) + mẫu RNA (5μl)l)Thành phần mastermixThể

Nước (RNAse free)2.1 μl) + mẫu RNA (5μl)l2x Reaction mix12.5 μl) + mẫu RNA (5μl)lMgSO4 (50mM)0.4 μl) + mẫu RNA (5μl)lPrimer RdRp_SARSr_F2 (10µM)1.5 μl) + mẫu RNA (5μl)lPrimer RdRp_SARSr_R1 (10µM)2 μl) + mẫu RNA (5μl)lProbe RdRp_SARSr_P2 (10µM)0.5 μl) + mẫu RNA (5μl)lSSIII/Taq EnzymeMix1 μl) + mẫu RNA (5μl)l

Kết quả

Trình tự gen SARS-CoV-2 so với SARS-CoV

Trình tự gen SARS-CoV-2

Sáu trình tự có sẵn của SARS-CoV-2, được căn chỉnh có thể được sử dụng làm đối chứng dương tính cho cả ba xét nghiệm RT-PCR.

Kết quả

Giới hạn phát hiện dựa trên RNA bộ gen của vi rút SARS-CoV

1 CI: khoảng tin cậy.

2 c/r: bản sao cho mỗi phản ứng.3 A: Xét nghiệm gen E, được đánh giá

bằng RNA gen của SARS-CoV.

4 B: Xét nghiệm gen RdRp được đánh giá bằng RNA gen của SARS-CoV

5 Trục x hiển thị các bản sao RNA đầu vào.

6 Trục y cho thấy kết quả dương tính.7 Hình vuông là các điểm dữ liệu thực

nghiệm thu được từ lần lặp lại.(tám phản ứng lặp lại cho mỗi điểm) 8.Đường bên trong là đường cong probit (quy tắc liều lượng đáp ứng)

9.Các đường chấm bên ngoài là 95% CI

Kết luận

oPhụ thuộc vào tín hiệu huỳnh quang của đầu dò được sử dụng để phát hiện và định lượng nhiều gen cùng một lúc.

oMang lại độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

oĐược áp dụng trong các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau cho nhiều loại phân tích mẫu sinh học

oTrong bối cảnh đại dịch COVID-19, Real-time PCR được coi là tiêu chuẩn vàng để xác nhận nhiễm SARS-CoV-2

Tài liệu tham khảo

1 Corman, V M., Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, D K., & Drosten, C (2020) Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR Eurosurveillance, 25(3), 2000045

2 Artika, I M., Dewi, Y P., Nainggolan, I M., Siregar, J E., & Antonjaya, U

(2022) Real-time polymerase chain reaction: current techniques, applications, and role in COVID-19 diagnosis Genes, 13(12), 2387.

3 Waller, J V., Kaur, P., Tucker, A., Lin, K K., Diaz, M J., Henry, T S., & Hope, M (2020) Diagnostic Tools for Coronavirus Disease (COVID-19): Comparing CT and RT-PCR Viral Nucleic Acid Testing AJR American journal of

roentgenology, 215(4), 834–838 https://doi.org/10.2214/AJR.20.23418

4 Nguyễn Nghiêm Luật, Tạp chí Y học Việt Nam 12/ 2021; Tập 509: 5-11 5 https://www.benhvien108.vn/cau-truc-bo-gen-cua-vi-rut-sar-cov-2.htm

CREDITS: This presentation template was created by

Slidesgo, and includes icons by Flaticon, and infographics & images by Freepik

Cảm ơn thầy và các bạn đã lắng nghe!