Sự cần thiết của việc chuẩn đoán chính xác COVID-19Xác định bệnh nhân nhiễm COVID-19, điều trị kịp thời, giúp giảm nguy cơ bệnh trở nặng và tăng cơ hội phục hồi nhanh chóng.Xác định cá
Trang 1Chủ đề: ỨNG DỤNG KĨ THUẬT REALTIME PCR TRONG XÉT NGHIỆM CHUẨN ĐOÁN
COVID 19
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH
Khoa Khoa Học Sinh Học
Môn học: Thiết bị và kĩ thuật CNSH
GVHD: TS Huỳnh Văn Biết
Ks Trương Quang Toản
1
Thành viên nhóm 3 Phạm Thành Công 21126294 Nguyễn Thị Kiều Duyên 21126316 Nguyễn Minh Hà 21126045
Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2023
Trang 2Nội Dung
Trang 3Giới thiệu chung
01
Trang 4Tình hình dịch COVID-19
COVID-19 là một đại dịch toàn cầu gây ra bởi một loại vi rút gọi là SARS-CoV-2 Đây là bệnh viêm đường hô hấp lây truyền qua tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với dịch tiết hô hấp của người nhiễm bệnh
Theo WHO, tại Việt Nam đã có tới 11,612,608 trường hợp; 10,638,168 (92,1%) người hồi phục và 43,206 (0,5%) người tử vong.
Trang 5Sự cần thiết của việc chuẩn đoán chính xác COVID-19
Xác định bệnh nhân nhiễm COVID-19, điều trị kịp thời, giúp giảm nguy cơ bệnh trở nặng và tăng cơ hội phục hồi nhanh chóng.
Xác định các nguồn lây COVID-19, người nhiễm bệnh và cách ly, ngăn chặn sự lây lan của COVID-19 trong cộng đồng.
Chuẩn đoán chính xác giúp quản lý tài nguyên y tế, đảm bảo rằng các bệnh viện và
cơ sở y tế có đủ trang thiết bị và nguồn nhân lực để điều trị.
Kỹ thuật Realtime RT-PCR đã trở thành một công cụ quan trọng trong xét nghiệm chuẩn đoán COVID-19, cho phép xác định gen của vi rút SARS-CoV-2 trong mẫu thông qua quá trình nhân bản mẫu ADN.
Trang 6Vật liệu và phương pháp
02
Trang 7 Realtime RT-PCR
• Là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA được theo dõi trực tiếp theo từng chu kỳ nhiệt
• Đo tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ phản ứng tỉ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành
Realtime RT-PCR
• Là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA được theo dõi trực
tiếp theo từng chu kỳ nhiệt
• Đo tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ phản ứng tỉ lệ
thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành
Khái niệm realtime RT-PCR
Trang 8Nguyên tắc hoạt động realtime RT-PCR
Các thành phần trong một phản ứng realtime RT-PCR: DNA mẫu, đoạn mồi,
nucleotide (dNTPs) và DNA polymerase chịu nhiệt.
Diễn ra qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn biến tính: Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt đến 94-95°C, thời gian biến tính có thể tăng lên nếu thành phần khuôn có nhiều GC.
Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-65°C trong 20-40 giây.
Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ phản ứng tăng lên 72°C, đây là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động tổng hợp mạch mới của DNA polymerase
Trang 9Cấu trúc bộ gen của SARS-CoV-2
Đặc điểm cấu trúc gen của vi rút SARS-CoV-2
Vi rút hình cầu, đường kính ~ 125 nm.
Các protein bề mặt nổi lên hình gai.
Bộ gen SARS-CoV-2 gồm có: vùng
5’UTR, khung đọc mở (ORF), phức hợp
sao chép (ORF1a và ORF1b), gen gai (S),
gen vỏ (E), gen màng (M), gen bao nhân
(N), vùng 3’UTR, một số gen phi cấu trúc
và một đuôi poly (A)
Trang 10Các biến thể của vi rút SARS-CoV-2
Được WHO phân thành 2 loại: biến thể đáng lo ngại (VOC) và biến thể đáng quan tâm (VOI)
VOC là một biến thể có khả năng lây truyền cao hơn, tăng độc lực, khả năng kháng vắc-xin hoặc miễn dịch, có khả năng trốn việc phát hiện, chẳng hạn như Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2) và Omicron (B.1.1.529)
VOI là một biến thể chứa các đặc điểm di truyền làm vi rút có khả năng lây lan cao hơn, tránh được hệ miễn dịch, khó phát hiện,làm cho bệnh nặng hơn Hiện tại không có biến thể virus corona được xác định thuộc trên
Trang 11Thời gian ủ bệnh và triệu chứng lâm sàng
Các triệu chứng thường bắt đầu 5–6 ngày
sau khi tiếp xúc và kéo dài 1–14 ngày
Các triệu chứng phổ biến: sốt, ớn lạnh, đau
họng
Các triệu chứng ít phổ biến hơn: đau cơ,
nặng tay chân, mệt mỏi, chảy nước mũi,
nghẹt mũi, hắt hơi, đau đầu, chóng mặt, tức
ngực, hụt hơi, giọng khàn, chán ăn, buồn
nôn, nôn, đau bụng hoặc tiêu chảy, khó ngủ
Trang 12Thu thập mẫu
Quy trình realtime RT-PCR phát hiện Sars-Cov-2
Mẫu bệnh phẩm lấy từ đường hô hấp trên
(dịch tỵ hầu, dịch họng, dịch mũi, dịch rửa
mũi/tỵ hầu, súc họng
Mẫu bệnh phẩm đường hô hấp dưới (dịch đờm, dịch phế nang, dịch nội khí quản, dịch màng phổi, dịch tiết đường tiêu hóa qua hậu môn)
Trang 13Mồi và đầu dò trong realtime RT-PCR cho vi rút Sars-Cov-2
Thực hiện phản ứng realtime RT-PCR
Quy trình realtime RT-PCR phát hiện Sars-Cov-2
Hình 1 2 Mồi và đầu dò trong realtime RT-PCR cho vi rút SARS-CoV-2
Xét nghiệm sàng lọc đầu tiên: Xét nghiệm trên
gen E
Xét nghiệm khẳng định: Xét nghiệm trên gen
Trang 14 Xét nghiệm sàng lọc Sars-Cov-2 bằng gene E
Quy trình Real-time PCR phát hiện Sars-Cov-2
Bảng 1 Thể tích mastermix (20μl) + mẫu RNA (5μl)l) + mẫu RNA (5μl) + mẫu RNA (5μl)l)
Thành phần mastermix Thể tích
Nước (RNAse free) 3.6 μl) + mẫu RNA (5μl)l
2x Reaction mix 12.5 μl) + mẫu RNA (5μl)l
MgSO4 (50mM) 0.4 μl) + mẫu RNA (5μl)l
Primer E_Sarbeco_F1 (10µM) 1 μl) + mẫu RNA (5μl)l
Primer E_Sarbeco_R2 (10µM) 1 μl) + mẫu RNA (5μl)l
Probe E_Sarbeco_P1 (10µM) 0.5 μl) + mẫu RNA (5μl)l
SSIII/Taq EnzymeMix 1 μl) + mẫu RNA (5μl)l
Tổng thể tích 20 μll
Bước Nhiệt
độ gian Thời Số chu kỳ
Tiền biến
Bảng 2 Chu trình nhiệt
Trang 15 Xét nghiệm khẳng định Sars-Cov-2 bằng RdRp
Quy trình Real-time PCR phát hiện Sars-Cov-2
Bảng 3 Thể tích mastermix (20 μl) + mẫu RNA (5μl)l) + mẫu RNA (5 μl) + mẫu RNA (5μl)l)
Thành phần mastermix Thể
tích
Nước (RNAse free) 2.1 μl) + mẫu RNA (5μl)l
2x Reaction mix 12.5 μl) + mẫu RNA (5μl)l
MgSO4 (50mM) 0.4 μl) + mẫu RNA (5μl)l
Primer RdRp_SARSr_F2 (10µM) 1.5 μl) + mẫu RNA (5μl)l
Primer RdRp_SARSr_R1 (10µM) 2 μl) + mẫu RNA (5μl)l
Probe RdRp_SARSr_P2 (10µM) 0.5 μl) + mẫu RNA (5μl)l
SSIII/Taq EnzymeMix 1 μl) + mẫu RNA (5μl)l
Tổng thể tích 20 μll
Bước Nhiệt độ Thời gian Số chu
kỳ
Tiền biến
kỳ
Bảng 4 Chu trình nhiệt
Trang 16Kết quả
03
Trình tự gen SARS-CoV-2 so với SARS-CoV
Trình tự gen SARS-CoV-2
Sáu trình tự có sẵn của SARS-CoV-2,
được căn chỉnh có thể được sử dụng
làm đối chứng dương tính cho cả ba
xét nghiệm RT-PCR.
Trang 17Kết quả
03
Giới hạn phát hiện dựa trên RNA bộ gen của vi rút SARS-CoV
1 CI: khoảng tin cậy.
2 c/r: bản sao cho mỗi phản ứng.
3 A: Xét nghiệm gen E, được đánh giá
bằng RNA gen của SARS-CoV.
4 B: Xét nghiệm gen RdRp được đánh giá
bằng RNA gen của SARS-CoV
5 Trục x hiển thị các bản sao RNA đầu
vào.
6 Trục y cho thấy kết quả dương tính.
7 Hình vuông là các điểm dữ liệu thực
nghiệm thu được từ lần lặp lại.
(tám phản ứng lặp lại cho mỗi điểm)
8.Đường bên trong là đường cong probit
(quy tắc liều lượng đáp ứng)
9.Các đường chấm bên ngoài là 95% CI
Trang 18Kết luận
04
o Phụ thuộc vào tín hiệu huỳnh quang của đầu dò được
sử dụng để phát hiện và định lượng nhiều gen cùng một lúc.
o Mang lại độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
o Được áp dụng trong các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau cho nhiều loại phân tích mẫu sinh học
o Trong bối cảnh đại dịch COVID-19, Real-time PCR được coi là tiêu chuẩn vàng để xác nhận nhiễm SARS-CoV-2
Trang 19Tài liệu tham khảo
1 Corman, V M., Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, D K.,
& Drosten, C (2020) Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR Eurosurveillance, 25(3), 2000045
2 Artika, I M., Dewi, Y P., Nainggolan, I M., Siregar, J E., & Antonjaya, U
(2022) Real-time polymerase chain reaction: current techniques, applications, and role in COVID-19 diagnosis Genes, 13(12), 2387
3 Waller, J V., Kaur, P., Tucker, A., Lin, K K., Diaz, M J., Henry, T S., & Hope,
M (2020) Diagnostic Tools for Coronavirus Disease (COVID-19): Comparing
CT and RT-PCR Viral Nucleic Acid Testing AJR American journal of
roentgenology, 215(4), 834–838 https://doi.org/10.2214/AJR.20.23418
4 Nguyễn Nghiêm Luật, Tạp chí Y học Việt Nam 12/ 2021; Tập 509: 5-11
5 https://www.benhvien108.vn/cau-truc-bo-gen-cua-vi-rut-sar-cov-2.htm
Trang 20CREDITS: This presentation template was created by
Slidesgo , and includes icons by Flaticon, and infographics & images by Freepik
Cảm ơn thầy và các bạn đã lắng nghe!