ứng dụng kĩ thuật realtime rt pcr trong xét nghiệm chuẩn đoán covid 19

Thông qua cách thức hoạt động, realtime RT-PCR cho phép xác định gen của vi rút SARS-CoV-2 trong mẫu thông qua quá trình nhân bản mẫu ADN.. Sự phát triển và ứng dụng của kỹ thuật này đã

i

BÁO CÁO MÔN HỌC

i Mục lục

Danh mục hình ii

Danh mục bảng ii

Danh mục từ viết tắt iii

I GIỚI THIỆU CHUNG 5

1.1 Tình hình đại dịch COVID-19 5

1.2 Sự cần thiết của việc chuẩn đoán chính xác COVID-19 5

II Nguyên tắc hoạt động của realtime RT-PCR 6

2.1 Khái niệm realtime RT-PCR 6

2.2 Nguyên tắc hoạt động realtime RT-PCR 6

III Đặc điểm của virus SARS-CoV-2 7

3.1 Cấu trúc bộ gen SARS-CoV-2 7

3.2 Các biến thể SARS-CoV-2 8

3.3 Thời gian ủ bệnh và triệu chứng lâm sàng 9

3.4 Quy trình realtime RT-PCR phát hiện SARS-CoV-2 10

IV Ưu điểm, hạn chế và ứng dụng realtime RT-PCR 15

ii

Danh mục hình

Hình 1 1 Cấu trúc bộ gen của SARS-CoV-2 8

Hình 1 2 Mồi và đầu dò trong realtime RT-PCR cho vi rút SARS-CoV-2 10

Hình 1 3 Trình tự gen SARS-CoV-2 so với SARS-CoV 13

Hình 1 4 Trình tự gen SARS-CoV-2 13

Hình 1 5 Giới hạn phát hiện dựa trên RNA bộ gen của vi rút SARS-CoV 14

Danh mục bảng Bảng 1 Thể tích mastermix sàng lọc SARS-CoV-2 bằng gen E 11

Bảng 2 Thể tích mastermix sàng lọc SARS-CoV-2 bằng gen RdRp 12

Bảng 3 Chu trình nhiệt phản ứng 12

iii

Danh mục từ viết tắt

1 COVID-19 Corona Virus Disease 19 Bệnh viêm đường hô hấp cấp 2

SARS-CoV-2

Severe Acute Respiratory Syndrome Corona Virus 2

Virus corona gây bệnh ở người

3 WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới 4 Realtime

RT-PCR

Realtime reverse transcription polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực 5 DNA Axit deoxyribonucleic

6 RNA Acid ribonucleic

7 CDC Centers for Disease Control and Prevention

Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ

10 Gen RdRp RNA dependent RNA polymerase gene

RNA phụ thuộc RNA polymerase

11 Gen E Envelope protein gene Gen vỏ

13 Gen M Membrane protein gene Gen màng 14 Gen N Nucleocapsid protein gene Gen bao nhân

15 VOC Variant of concern Biến thể đáng lo ngại 16 VOI Variant of interest Biến thể đáng quan tâm

5

I GIỚI THIỆU CHUNG

1.1 Tình hình đại dịch COVID-19

COVID-19, hay còn gọi là bệnh viêm đường hô hấp cấp, là một đại dịch toàn cầu gây ra bởi một loại vi rút có tên gọi SARS-CoV-2 Đây là một căn bệnh nhiễm trùng hô hấp lây truyền qua tiếp xúc gần, tiếp xúc qua dịch tiết hô hấp của người nhiễm bệnh hoặc

qua tiếp xúc với các bề mặt mà người nhiễm bệnh đã tiếp xúc

Đại dịch COVID-19 bắt đầu tại thành phố Vũ Hán, tỉnh Hồ Bắc, Trung Quốc vào cuối năm 2019 và sau đó nhanh chóng lan truyền khắp thế giới Bệnh này có thể gây ra các triệu chứng từ nhẹ đến nặng, bao gồm sốt, ho khan, đau họng, khó thở, mệt mỏi và các triệu chứng khác

Theo số liệu cung cấp mới nhất của tổ chức y tế thế giới (WHO), đã có 771.407.825 trường hợp được xác nhận nhiễm Covid-19, với 6.972.152 trường hợp tử vong Tính đến tháng 10/2023, tổng cộng 13.516.282.548 liều vắc xin đã được tiêm

Tại Việt Nam, đã có 11.623.987 trường hợp được xác nhận nhiễm COVID-19 với 43.206 trường hợp tử vong Tính đến tháng 6/2023, tổng cộng đã có 266.492.149 liều vắc xin đã được tiêm

1.2 Sự cần thiết của việc chuẩn đoán chính xác COVID-19

Chuẩn đoán chính xác COVID-19 là một yếu tố quan trọng trong việc kiểm soát và ngăn chặn sự lây lan một cách nghiêm trọng hơn của đại dịch COVID-19 Một số điểm quang trọng và cần thiết là:

• Xác định bệnh nhân nhiễm COVID-19 và bắt đầu điều trị kịp thời, giúp giảm nguy cơ bệnh trở nặng và tăng cơ hội phục hồi nhanh chóng

• Xác định những người nhiễm bệnh và cách ly họ, từ đó ngăn chặn sự lây lan của COVID-19 trong cộng đồng

• Xác định các nguồn lây COVID-19 một cách chính xác giúp quan sát và theo dõi dịch tễ học để đánh giá nguy cơ lây lan, xác định nguồn gốc của bệnh, và áp dụng biện pháp kiểm soát

• Chuẩn đoán chính xác giúp quản lý tài nguyên y tế, đảm bảo rằng các bệnh viện và cơ sở y tế có đủ trang thiết bị và nguồn nhân lực để điều trị

6

Trong việc đối phó với đại dịch COVID-19, việc chuẩn đoán chính xác là một phần quan trọng để bảo vệ sức khỏe cộng đồng và ngăn chặn sự lây lan của vi rút

Kỹ thuật realtime RT-PCR đã trở thành một công cụ quan trọng trong xét nghiệm chuẩn đoán COVID-19 Thông qua cách thức hoạt động, realtime RT-PCR cho phép xác định gen của vi rút SARS-CoV-2 trong mẫu thông qua quá trình nhân bản mẫu ADN Sự phát triển và ứng dụng của kỹ thuật này đã đem lại nhiều cải tiến quan trọng trong việc xác định chính xác và nhanh chóng sự hiện diện của vi rút, giúp đẩy nhanh tiến trình xác định và xác minh các trường hợp nhiễm SARS-CoV-2, giúp ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh và đảm bảo quá trình điều trị và chăm sóc sức khỏe hiệu quả hơn

II Nguyên tắc hoạt động của realtime RT-PCR 2.1 Khái niệm realtime RT-PCR

PCR là viết tắt của Polymerase Chain Reaction, tạm dịch là "Phản ứng chuỗi trùng hợp" Đây là một kỹ thuật sinh học phân tử mạnh mẽ cho phép nhân bản một đoạn DNA cụ thể từ gen của một sinh vật, tạo ra hàng triệu bản sao của đoạn gen này

Kỹ thuật này được phát minh vào năm 1985 bởi nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis và đội ngũ nghiên cứu tại công ty Cetus, đã tạo ra một cuộc cách mạng trong nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới, cho phép các nhà khoa học nhân bản và nghiên cứu các đoạn gen cụ thể, xác định chuỗi gen, chuẩn đoán các bệnh truyền nhiễm, nghiên cứu di truyền học, phát triển thuốc, và nhiều ứng dụng khác

Realtime RT-PCR là một biến thể của kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng

2.2 Nguyên tắc hoạt động realtime RT-PCR

Các thành phần cần thiết trong một phản ứng realtime RT-PCR bao gồm DNA mẫu, đoạn mồi, nucleotide (dNTPs) và DNA polymerase chịu nhiệt

Kỹ thuật realtime RT-PCR sử dụng chất phát huỳnh quang để máy có thể phát hiện và đo được cường độ tín hiệu từ chất này Khi phản ứng nhân bản xảy ra tới một chu kỳ nhất định, cường độ tín hiệu huỳnh quang sẽ bắt đầu có sự gia tăng rõ rệt và tương quan với số lượng bản sao DNA được tạo ra Kết quả được thể hiện dưới dạng biểu đồ quan sát được qua mỗi chu kỳ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về hiệu quả khuếch đại DNA mục tiêu

7

Realtime RT-PCR yêu cầu có thiết bị đo cường độ phát huỳnh quang từ ống mẫu và cài chương trình phần mềm cho phép xử lý kết quả về sự biến đổi cường độ huỳnh quang

Chu trình nhiệt diễn ra qua 3 giai đoạn:

• Giai đoạn biến tính: Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt đến 94-95°C, lúc này liên kết hydro giữa các bazơ trong sợi DNA mạch đôi bị phá vỡ, dẫn đến tạo thành 2 sợi đơn DNA Mỗi sợi đơn này trở thành khuôn để tổng hợp mạch mới Thời gian biến tính có thể tăng lên nếu thành phần khuôn có nhiều GC

• Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-65°C trong 20-40 giây để probe và mồi gắn lần lượt vào sợi DNA khuôn và bắt đầu quá trình tổng hợp mạch mới nhờ vào sự hoạt động của DNA polymerase

• Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ phản ứng tăng lên 72°C, đây là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động tổng hợp mạch mới của DNA polymerase Giai đoạn này không bắt buộc ở một số chu trình qPCR, do kỹ thuật này thường dùng khuếch đại các đoạn có trình tự ngắn hơn PCR, vào khoảng <200bp, do vậy chỉ cần hai bước biến tính

và bắt cặp là đủ để khuếch đại đoạn gen mục tiêu trong phản ứng III Đặc điểm của virus SARS-CoV-2

3.1 Cấu trúc bộ gen SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 là một vi rút loại RNA, có bộ gen là một RNA sợi đơn, dương, có kích thước khoảng 29,9 kB Đây là vi rút có bộ gen lớn nhất trong số các virus RNA

Bộ gen SARS-CoV-2 gồm có: vùng 5’UTR, khung đọc mở (ORF), phức hợp sao chép (ORF1a và ORF1b), gen gai (S), gen vỏ (E), gen màng (M), gen bao nhân (N), vùng 3’UTR, một số gen phi cấu trúc và một đuôi poly (A)

Protein S chịu trách nhiệm liên kết với tế bào vật chủ và là thụ thể để virus xâm nhập vào tế bào vật chủ Các protein M, E và N là một phần của nucleocapsid của các hạt virus Trong bộ gen của SARS-CoV-2 có một gen thiết yếu là gen RdRp, gen này có độ bảo tồn cao, điều này làm cho gen này rất hữu ích để đo lường khoảng cách sự tiến hóa và sự liên quan của chúng với virus khác Mặt khác gen này cùng dùng để phát hiện chẩn đoán SARS-CoV-2

8

Khi phân tích trình tự của các mẫu vi rút phân lập được ở những bệnh nhân đầu tiên, các nhà khoa học cho thấy rằng SARS-CoV-2 cùng loài với SARS-CoV gây bệnh SARS

đầu năm 2003 Hai chủng loại vi rút trên có bộ gen giống nhau tới 94,6% các chuỗi axit

amin và có tới 80% sự tương tự trình tự nucleotide ở cả 2 chủng vi rút

Ủy ban quốc tế về phân loại vi rút chính thức đặt tên cho chủng mới của vi rút corona là SARS-CoV-2

3.2 Các biến thể SARS-CoV-2

Kể từ khi bắt đầu đợt dịch COVID-19, SARS-CoV-2 đã tiến hóa và biến đổi liên tục, tạo ra các biến thể có khả năng lây truyền và độc lực khác nhau Các biến thể của SARS-CoV-2 được WHO phân thành 2 loại: biến thể đáng lo ngại (VOC) và biến thể đáng quan tâm (VOI)

Theo Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC), VOC là một biến thể có khả năng lây truyền cao hơn, tăng độc lực, khả năng kháng vắc-xin hoặc miễn dịch có được từ lần nhiễm trùng trước đó và có khả năng trốn tránh việc phát hiện chẩn đoán Một số VOC đã xuất hiện từ chủng vi khuẩn hoang dã ban đầu được phân lập ở Vũ Hán kể từ khi đợt bùng phát đầu tiên chẳng hạn như Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2) và Omicron (B.1.1.529)

Hình 1 1 Cấu trúc bộ gen của SARS-CoV-2

9

Biến thể Alpha được phát hiện lần đầu tiên ở Anh vào tháng 9 năm 2020; biến thể Beta ở Nam Phi vào tháng 5 năm 2020 và biến thể Gamma ở Brazil vào tháng 9 năm 2020 Cả 3 nhanh chóng trở thành chủng vi rút chính trên toàn thế giới

VOI là một biến thể chứa các đặc điểm di truyền làm virus có khả năng lây lan cao hơn, né tránh được hệ miễn dịch của cơ thể, khó phát hiện khi xét nghiệm hoặc làm cho bệnh nặng hơn Hiện tại không có biến thể virus corona được xác định thuộc trên

Các vi rút RNA có tỷ lệ đột biến cao hơn các vi rút DNA, dẫn đến trong quá trình bộ gen của vi rút sao chép có một số các sai khác của bộ gen vi rút được tạo ra Điều này sẽ tạo ra một quần thể virus có bộ gen đa dạng Với mỗi chu kỳ nhân lên của vi rút, sự khác biệt tích lũy giữa bộ gen vi rút ban đầu và bộ gen vi rút con cháu Điều này có thể đóng góp vào sự khác biệt trong các triệu chứng, diễn biến lâm sàng giữa các bệnh nhân mắc bệnh

3.3 Thời gian ủ bệnh và triệu chứng lâm sàng

❖ Thời gian ủ bệnh

Một người có thể gặp các triệu chứng khác nhau từ COVID-19 Các triệu chứng thường bắt đầu 5–6 ngày sau khi tiếp xúc và kéo dài 1–14 ngày

Là một trong những thông số dịch tễ học quan trọng nhất của bệnh truyền nhiễm Kiến thức về thời gian ủ bệnh có ý nghĩa rất lớn trong việc xác định ca bệnh, quản lý các mối đe dọa mới nổi, ước tính thời gian theo dõi để truy dấu tiếp xúc và phát hiện ca bệnh thứ cấp cũng như thiết lập các chương trình y tế công cộng nhằm giảm lây truyền

Ngoài ra, với sự lây lan của các biến thể như Delta và Omicron, thời gian ủ bệnh hiện tại của COVID-19 khác với thời gian bùng phát dịch ban đầu, nhằm giúp điều chỉnh các chiến lược phòng ngừa và kiểm soát cũng như ngăn chặn tốt hơn sự lây lan của vi rút, là yếu tố then chốt quyết định thời gian cách ly của người nhiễm bệnh

❖ Triệu chứng lâm sàng

Các triệu chứng phổ biến hơn là: sốt, ớn lạnh, đau họng

Các triệu chứng ít phổ biến hơn là: đau cơ, nặng tay chân, mệt mỏi, chảy nước mũi, nghẹt mũi, hắt hơi, đau đầu, chóng mặt, tức ngực, hụt hơi, giọng khàn, chán ăn, buồn nôn, nôn, đau bụng hoặc tiêu chảy, khó ngủ

10

Những người có vấn đề sức khỏe từ trước có nguy cơ cao hơn khi mắc COVID-19, bao gồm những người đang dùng thuốc ức chế miễn dịch, người có vấn đề về tim, phổi, gan, tiểu đường, béo phì, ung thư, người nhiễm HIV

3.4 Quy trình real-time RT- PCR phát hiện SARS-CoV-2 ❖ Tổng quan

Xét nghiệm chẩn đoán bằng kĩ thuật realtime RT-PCR được thiết kế trước khi có trình tự SARS-CoV-2 đầu tiên Sau khi có trình tự chủng SARS-CoV-2, các thử nghiệm bắt đầu được chọn dựa trên sự phù hợp của chúng với SARS-CoV-2 theo sự kiểm tra của việc căn chỉnh trình tự và đánh giá ban đầu

Tất cả các xét nghiệm có thể sử dụng RNA của SARS-CoV làm chứng dương Chứng RNA được tổng hợp cho xét nghiệm SARS-CoV-2 ở vùng gen E có sẵn Tất cả các xét nghiệm được sử dụng cùng các điều kiện giống nhau, trình tự mồi và đầu dò, cũng như tối ưu hóa nồng độ

Xét nghiệm sàng lọc đầu tiên: Xét nghiệm trên gen E Xét nghiệm khẳng định: Xét nghiệm trên gen RdRp

❖ Thu thập mẫu

Xét nghiệm chẩn đoán bằng kĩ thuật realtime RT-PCR sẽ phát hiện các đoạn gen RNA từ virus SARS-CoV-2 trong các mẫu bệnh phẩm lấy từ đường hô hấp trên và hô hấp dưới bằng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm cả phết dịch tỵ hầu bằng tăm bông

Hình 1 2 Mồi và đầu dò trong realtime RT-PCR cho vi rút SARS-CoV-2

11

Mẫu bệnh phẩm lấy từ đường hô hấp trên gồm: • Mẫu ngoáy dịch tỵ hầu

• Mẫu ngoáy dịch họng • Mẫu ngoáy dịch mũi • Mẫu dịch rửa mũi/tỵ hầu • Mẫu dịch súc họng

Mẫu bệnh phẩm đường hô hấp dưới gồm: • Dịch đờm

• Dịch phế nang, dịch nội khí quản, dịch màng phổi • Tổ chức phổi, phế quản, phế nang

• Dịch tiết đường tiêu hóa qua hậu môn

❖ Thực hiện phản ứng realtime RT-PCR

Khả năng phản ứng chéo dự kiến của tất cả các xét nghiệm với RNA của vi rút SARS-CoV cho phép sử dụng các xét nghiệm mà không cần phải dựa vào các nguồn RNA cụ thể của SARS-CoV-2 bên ngoài

Đối với quy trình làm xét nghiệm SARS-CoV-2, nên xét nghiệm gen E làm công cụ sàng lọc đầu tiên, sau đó là xét nghiệm xác nhận bằng xét nghiệm gen RdRp Việc áp dụng xét nghiệm gen RdRp với công nghệ màu kép có thể phân biệt SARS-CoV-2 với RNA của SARS-CoV nếu loại sau được sử dụng làm đối chứng dương tính

12

Nếu các mẫu xét nghiệm với gen E cho kết quả dương tính thì tiếp tục thực hiện xét nghiệm xác nhận với gen RdRp

Quá trình luân nhiệt ở cả xét nghiệm sàng lọc gen E đầu tiên và sau đó là xét nghiệm xác nhận bằng xét nghiệm gen RdRp đều thực hiện cùng một nhiệt độ chung xác định

Bảng 3 Chu trình nhiệt phản ứng

❖ Kết quả

Trước khi công bố trình tự bộ gen vi rút từ các trường hợp SARS-CoV-2, đã có các báo cáo về việc phát hiện một loại vi rút giống SARS Do đó, có những giả định rằng một loại CoV liên quan đến SARS có liên quan đến đợt bùng phát dịch tại Vũ Hán

Trình tự bộ gen vi rút SARS được mang đi so sánh với trình tự bộ gen SARS-CoV-2 được phát hiện đầu tiên Sự sắp xếp của các vùng liên kết mồi với SARS-CoV-SARS-CoV-2có liên

quan đến SARS ở loài dơi

13

Sự liên kết được bổ sung bởi các trình tự xác nhận sự phù hợp tốt của các đoạn mồi được chọn với tất cả các trình tự Sự sắp xếp của các vùng liên kết mồi với SARS-CoV-2, cũng như SARS-CoV liên quan đến loài dơi

Độ nhạy của xét nghiệm dựa trên virion SARS coronavirus

Để có được đánh giá sơ bộ về độ nhạy phân tích, các nhà khoa học đã sử dụng chất nổi trên bề mặt nuôi cấy tế bào đã tinh chế có chứa virion chủng SARS-CoV được nuôi cấy trên tế bào Vero

Chất nổi phía trên được siêu lọc và do đó được cô đặc từ thể tích gấp khoảng 20 lần chất nổi phía trên nuôi cấy tế bào Bước cô đặc đồng thời làm giảm nồng độ tương đối của các axit nucleic nền chẳng hạn như RNA vi rút Tất cả các xét nghiệm đều phải trải qua thử nghiệm lặp lại để xác định tần số phát hiện ngẫu nhiên tại điểm cuối độ nhạy của mỗi xét nghiệm

Tất cả các xét nghiệm đều có độ nhạy cao, với kết quả tốt nhất thu được đối với xét nghiệm gen E và gen RdRp lần lượt là 5,2 và 3,8 bản sao cho mỗi phản ứng với xác suất phát hiện 95%

Hình 1 4 Trình tự gen SARS-CoV-2

Hình 1 3 Trình tự gen SARS-CoV-2 so với SARS-CoV