Luận văn thạc sĩ VNUA giám sát sự lưu hành các chủng virus cúm AH5N1, h5n6, h7n9 tại một số chợ buôn bán gia cầm sống trên địa bàn các tỉnh nghệ an, thừa thiên huế và ứng dụng kỹ thuật realtime RT PCR trong chẩn đoán bệnh

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐẶNG VĂN HẠNH GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH CÁC CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1, H5N6, H7N9 TẠI MỘT SỐ CHỢ BUÔN BÁN GIA CẦM SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN CÁC TỈNH NGHỆ AN, THỪA THIÊN HUẾ VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Hồng Ngân NHÀ XUẤT BÁN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Đặng Văn Hạnh i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc PGS TS Phạm Hồng Ngân tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Thú y cộng đồng, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán công chức, viên chức Cơ quan Thú y vùng III giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Đặng Văn Hạnh ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích Yếu Luận Văn ix Thesis Abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Khái niệm bệnh cúm gia cầm 2.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 2.3.1 Tình hình bệnh cúm gia cầm giới 2.3.2 Tình hình bệnh cúm gia cầm Việt Nam 2.4 VIRUS học bệnh cúm gia cầm 11 2.4.1 cấu trúc virus cúm gia cầm 11 2.4.2 Đặc điểm cấu trúc hệ gen cúm gia cầm 13 2.4.3 Đặc điểm kháng nguyên - miễn dịch 16 2.4.4 Độc lực virus 18 2.4.5 Cơ chế xâm nhập, nhân lên gây bệnh virus 19 2.4.6 Sức đề kháng virus 21 2.5 Truyền nhiễm học 21 2.5.1 Động vật cảm nhiễm 21 2.5.2 Con đường truyền lây 22 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.6 Triệu chứng bệnh tích 22 2.6.1 Triệu chứng 22 2.6.2 Bệnh tích 23 2.7 Các phương pháp chẩn đoán 23 2.7.1 Chẩn đoán dịch tễ học 23 2.7.2 Chẩn đoán lâm sàng 23 2.7.3 Chẩn đoán virus học 23 2.7.4 Chẩn đoán huyết học 24 2.8 Phòng bệnh 24 2.8.1 Phòng bệnh vệ sinh 24 2.8.2 Phòng bệnh vắc xin 24 2.9 Hiểu biết kỹ thuật REALTIME RT-PCR 25 2.9.1 Thế phản ứng Realtime RT-PCR 25 2.9.2 Cơ chế hoạt động Real time PCR sử dụng Taqman probe làm chất phát huỳnh quang 26 Phần Nội dung vàphương pháp nghiên cứu 28 3.1 Nội dung, địa điểm nghiên cứu 28 3.1.1 Nội dung 28 3.1.2 Địa điểm 28 3.2 Vật liệu nghiên cứu 28 3.2.1 Đối tượng 28 3.2.2 Các loại dụng cụ, hóa chất 28 3.3 Phương pháp nghiên cứu 30 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu 30 3.3.2 Phương pháp tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR 32 3.3.3 Phương pháp thu thập số liệu 34 3.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 34 Phần Kết nghiên cứu thảo luận 35 4.1 Tình hình chăn ni gia cầm tỉnh nghệ an thừa thiên huế từ năm 2012 - 2016 35 4.1.1 Tình hình chăn nuôi gia cầm Nghệ An từ năm 2012 - 2016 35 4.1.2 Tình hình chăn nuôi gia cầm Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016 36 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.2 Kết tiêm phòng Vaccine cúm gia cầm nghệ an thừa thiên huế từ năm 2012 - 2016 38 4.3 Tình hình dịch cúm gia cầm địa bàn tỉnh nghệ an thừa thiên huế từ năm 2012 - 2016 41 4.3.1 Tình hình dịch cúm gia cầm địa bàn tỉnh Nghệ An từ năm 2012 2016 41 4.3.2 Tình hình dịch cúm gia cầm địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016 43 4.3.3 Đăc điểm dịch tễ cúm gia cầm tỉnh Nghệ An từ năm 2012 - 2016 44 4.4 Kết giám sát cúm gia cầm chợ vinh tỉnh nghệ an chợ thừa thiên huế năm 2016 48 4.4.1 Kết xét nghiệm chợ giám sát năm 2016 48 4.4.2 Tỷ lệ lưu hành virus cúm gia cầm theo thời gian giám sát chợ Vinh chợ Nọ năm 2016 51 4.4.3 Tỷ lệ nhiễm chủng cúm A/H5N1 H5N6 theo loại mẫu chợ Vinh Nghệ An chợ Nọ Thừa Thiên Huế năm 2016 53 4.4.4 Diễn biến lưu hành gen M, H5, N1, N6 năm giám sát 54 4.5 Ứng dụng kỹ thuật realtime rt-pcr chẩn đoán bệnh 56 Phần Kết luận kiến nghị 59 5.1 Kết luận 59 5.2 Kiến nghị 59 Tài liệu tham khảo 60 Phụ lục 64 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BNN PTNT Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn Ct Chu kì ngưỡng (Cycle of threshold) DA Dalton DNA Axit deoxiribonucleic FAO Tổ chức Lương thựcvà Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) HA Hemagglutinin HI Phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination – Inhibition) HPAI Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza) LPAI Cúm gia cầm thể độc lực thấp (Low Pathogenic Avian Influenza) MA Matrix NA Neuraminidase NP Nucleoprotein OIE Tổ chức Thú Y giới (World Organnisation for Animal Health) RNA Axit ribonucleic RNP Ribonucleoprotein RT - PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Cúm gia cầm H5N1 người giới Bảng 3.1 Cặp mồi phát virus Cúm gia cầm 30 Bảng 3.2 Công thức tổ hợp phản ứng Realtime RT-PCR 33 Bảng 4.1 Tổng đàn gia cầm tỉnh Nghệ An từ năm 2012 - 2016 35 Bảng 4.2 Tổng đàn gia cầm tỉnh Thừa thiên Huế từ năm 2012 - 2016 37 Bảng 4.3 Kết tiêm phòng vaccine tỉnh Nghệ An Thừa Thiên Huế từ 2012 đến vụ xuân 2016 38 Bảng 4.4 Dịch cúm gia cầm tỉnh Nghệ An từ năm 2012 đến tháng 6/2016 41 Bảng 4.5 Dịch cúm gia cầm Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 6/2016 43 Bảng 4.6 Dịch cúm gia cầm theo tháng Nghệ An từ năm 2012 - 2016 44 Bảng 4.7 Dịch cúm gia cầm theo loài địa bàn tỉnh Nghệ An từ 2012 - 2016 47 Bảng 4.8 Kết giám sát chợ Vinh chợ Nọ năm 2016 49 Bảng 4.9 Tỷ lệ lưu hành virus cúm gia cầm theo thời gian chợ giám sát năm 2016 52 Bảng 4.10 Tỷ lệ nhiễm H5N1 H5N6 theo loại mẫu chợ giám sát 53 Bảng 4.11 Tỷ lệ dương tính gen M, H5, N1, N6 năm giám sát 55 Bảng 4.12 Số lượng mẫu xét nghiệm kỹ thuật Realtime RT-PCR Trạm chẩn đoán xét nghiệm - Cơ quan Thú y vùng III 57 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Khu vực có trường hợp nhiễm cúm gia cầm Hình 2.2 Cúm gia cầm năm 2015 Việt Nam 11 Hình 2.3 Hình thái cấu trúc virus cúm gia cầm 12 Hình 2.4 Các hệ gen virus cúm 13 Hình 2.5 Mơ hình chế xâm nhiễm nhân lên virus cúm A tế bào chủ 20 Hình 2.6 Mối quan hệ lây nhiễm thích ứng lồi vật chủ virus cúm A 21 Hình 2.7 Cơ chế phát huỳnh quang Taqman probe 26 Hình 4.1 Tỷ lệ tiêm phịng vaccine Nghệ An Thừa Thiên Huế 39 Hình 4.2 Diễn biến cúm gia cầm Nghệ An từ năm 2012 - 6/2016 42 Hình 4.3 Diễn biến cúm gia cầm theo thời gian Nghệ An 45 Hình 4.4 Sự phân bố ổ dịch địa bàn tỉnh Nghệ Antừ năm 2012 - 2016 46 Hình 4.5 Biến động tỷ lệ lồi mắc bệnh 48 Hình 4.6 Tỷ lệ nhiễm cúm chợ qua đợt giám sát 51 Hình4.7 Tỷ lệ nhiễm H5N1 H5N6 chợ theo thời gian 52 Hình 4.8 Tỷ lệ lưu hành chủng virus H5N1 H5N6 theo loại mẫu 54 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com chủng vaccine phù hợp, đạt hiệu cao cơng tác tiêm phịng, phịng chống dịch bệnh Với hỗ trợ dự án FAO giám sát lưu hành virus cúm chợ buôn bán gia cầm sống năm qua, mục tiêu dự án giám sát thay đổi tỷ lệ lưu hành chủng virus cúm gia cầm, biến đổi đặc tính di truyền đặc tính kháng nguyên nhằm cảnh báo sớm đưa biện pháp phòng bệnh phù hợp Do vậy, khảo sát lưu hành qua năm nhằm đưa nhìn tổng quan thay đổi Kết trình bày Bảng4.11 Bảng 4.11 Tỷ lệ dương tính gen M, H5, N1, N6 năm giám sát Số mẫu Tỉnh Năm xét M nghiệm Tỷ lệ (%) H5 Tỷ lệ (%) Tỷ N1 lệ N6 (%) Tỷ lệ (%) 2013 216 38 17,59 17 7,87 17 7,87 0,00 Nghệ 2014 144 17 11,81 4,86 3,47 0,00 An 2015 54 32 59,26 14 25,93 0,00 10 18,52 2016 72 17 23,61 11,11 6,94 2,78 2013 216 19 8,80 0,46 0,00 0,00 2014 144 2,78 0,00 0,00 0,00 2015 54 15 27,78 16,67 0,00 11,11 2016 72 15 20,83 1,39 1,39 0,00 Thừa Thiên Huế Nguồn: Cơ quan Thú y vùng III (2016) Qua bảng số liệu trên, ta có nhận xét:Tại Nghệ An năm giám sát, tỷ lệ lưu hành virus cúm A cao vào năm 2015, 54 mẫu xét nghiệm có tới 32 mẫu dương tính với cúm A (tỷ lệ 59,26%), tiếp đến năm 2016 số mẫu dương tính cúm A 17/72 mẫu giám sát (tỷ lệ 23,61%), thấp năm 2013 tỷ lệ lưu hành 11,81%.Với chủng virus cúm A/H5N1, năm 2013 tỷ lệ lưu hành 7,87%, tỷ lệ giảm dần năm khơng có lưu hành chủng virus cúm năm 2015 Tuy nhiên, chủng virus Cúm A/H5N1 tăng trở lại vào năm 2016 có tỷ lệ lưu hành 6,94%.Với chủng virus cúm A/H5N6, khơng có lưu hành năm 2013 2014, chủng tăng mạnh vào năm 2015 với tỷ lệ 18,52% giảm trở lại vào năm 2016 với tỷ lệ 2,78% Từ kết cho thấy có lưu hành virus cúm A tất năm giám sát, nhiên tỷ lệ lưu hành khác qua năm, có biến động khơng theo quy luật hàng năm Có năm có lưu hành chủng virus 55 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cúm A/H5N1 (năm 2013, 2014) khơng có lưu hành chủng cúm A/H5N6.Ngược lại, có năm có lưu hành chủng virus cúm A/H5N6 (năm 2015), lại có năm tồn song song hai chủng virus cúm (năm 2016) Tại Thừa Thiên Huế: Trong năm nghiên cứu, có lưu hành virus cúm A mức độ khác Năm 2013 216 mẫu giám sát 19 mẫu dương tính với M (tỷ lệ 8,80%), năm 2014 với 144 mẫu giám sát có mẫu dương tính với M (tỷ lệ 2,78%), năm khơng có lưu hành chủng virus cúm H5N1 H5N6 Trong năm tiếp theo, tỷ lệ lưu hành virus cúm A tương đối cao so với năm đầu Năm 2015, có 15 mẫu dương tính với M xét nghiệm 54 mẫu (tỷ lệ lưu hành 27,78%), khơng có lưu hành chủng H5N1, có mẫu dương tính H5N6 (tỷ lệ 11,11%) Tương tự vậy, có 15 mẫu dương tính với M xét nghiệm 72 mẫu năm 2016 (tỷ lệ 20,83%), có mẫu dương tính với chủng H5N1 (tỷ lệ 1,39%), khơng có lưu hành chủng H5N6 Từkết cho thấy Thừa Thiên Huế có lưu hành virus cúm A năm giám sát, năm 2013 2014, tỷ lệ lưu hành virus cúm A thấp so với năm Đối với chủng H5N1, có năm 2016 có lưu hành chủng virus với tỷ lệ 1,39% Tương tự với chủng H5N6, có lưu hành chủng vào năm 2015 với tỷ lệ 11,11% Trong năm giám sát khơng có lưu hành chủng virus cúm A/H7N9 địa bàn hai tỉnh 4.5 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH Real Time PCR kĩ thuật dùng để định lượng tích lũy DNA phản ứng khuếch đại xảy ra.Kỹ thuật sử dụng rộng rãi nghiên cứu y học sinh học nhằm phục vụ nhiều mục đích khác nhau, phát bệnh di truyền, chẩn đoán bệnh nhiễm trùng, bệnh virus, vi khuẩn, tách dòng gen hay xác định huyết thống Các áp dụng vào nhiều lĩnh vực tạo nhũng kết diệu kỳ, làm cho cơng trình nghiên cứu sinh học phân tử trở nên nhẹ nhàng dễ dàng gấp nhiều lần trước đây.Chính nhờ Realtime RT-PCR mà ngày nay, sinh học phân tử làm bước tiến nhảy vọt lĩnh vực Hiện nay, thành tựu PCR mở nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều ứng dụng sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh: thực phẩm, 56 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com bệnh phẩm, mỹ phẩm, nước, phát pháp y.Ứng dụng chẩn đoán: Được sử dụng việc phát nhanh axit nuleic có ý nghĩa chẩn đốn, bệnh truyền nhiễm, ung thư bất thường di truyền Việc xuất phương pháp phịng thí nhiệm vi sinh vật học lâm sàng thúc đẩy mạnh mẽ việc chẩn đoán bệnh truyền nhiễm Kỹ thuật mở rộng công cụ phát bệnh chủng cúm kiểm tra với mục đích chẩn đoán Ứng dụng lĩnh vực vi sinh vật học: Được sử dụng nhà vi sinh vật học làm lĩnh vực an toàn thực phẩm, hư hỏng thực phẩm lên men, việc đánh giá nguy ô nhiễm nguồn nước hay việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng Tại Cơ quan Thú y vùng III trực thuộc Cục Thú y, để đáp ứng nhu cầu cơng tác chẩn đốn bệnh động vật địa bàn phụ trách, nhiều phương pháp chẩn đoán tiên tiến giới áp dụng Với phương pháp Realtime RT-PCR, Cơ quan Thú y vùng III ứng dụng để chẩn đoán nhiều bệnh nhưCúm gia cầm (M, H5N1, H5N6, H5N8, H7N9), Newcastle, Gumboro, dịch tả vịt; Các bệnh lợn Tai xanh, Dịch tả lợn, Suyễn, Tiêu chảy PED, Viêm ruột TGE, Xạ khuẩn, Giả dại, Lepto, Bệnh còi PCV2; bệnh tôm Đốm trắng, Taura, Hoại tử gan tụy cấp, Hoại tử quan tạo máu, Đầu vàng, Vi bào tử trùng; bệnh cá VNN, virus cá chép mùa xuân; Xác định AND lồi (bị, cừu) Hàng năm,Trạm chẩn đốn xét nghiệm - Cơ quan Thú y vùng III chẩn đoán số lượng lớn mẫu động vật từ địa phương địa bàn phụ trách, phục vụ tốt cho công tác thú y Kết thể Bảng 4.12 Bảng 4.12.Số lượng mẫu xét nghiệm kỹ thuật Realtime RT-PCR Trạm chẩn đoán xét nghiệm - Cơ quan Thú y vùng III Năm Số lượng mẫu Tổng Mẫu giám sát Mẫu chẩn đoán 2013 3.037 314 3.351 2014 4.132 517 4.649 2015 2.878 426 3.304 2016 1.464 312 1.776 Như vậy, với kỹ thuật Realtime RT-PCR Trạm chẩn đoán xét nghiệm – Cơ 57 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com quan Thú y vùng III áp dụng để xét nghiệm hàng ngàn mẫu năm, giải yêu cầu chẩn đoán bệnh vùng nhanh chóng, xác hiệu Ngoài ra, hàng năm Cơ quan Thú y vùng III tổ chức tập huấn cho Chi cục Thú y vùng cơng tác xét nghiệm, có kỹ thuật Realtime RTPCR đáp ứng nhu cầu thú y địa bàn tỉnh Phương pháp Realtime RT-PCR có nhiều ưu điểm độ xác độ nhạy cao Phương pháp cho phép theo dõi tiến trình phản ứng biết lượng DNA tạo thành thời điểm, không cần điện di,tiến hành nhiều mẫu cho kết nhanh phục vụ tốt cho cơng tác phịng chống dịch bệnh Tuy nhiên, Phương pháp cịn có số mặt hạn chế không phân biệt tác nhân gây bệnh cịn sống hay chết; chi phí xét nghiệm lớn, địi hỏi có cán thực có kỹ cao.Ngồi ra, phương pháp cịn gặp phải vấn đề probe bắt cặp không đặc hiệu, gây sai lệch số xét nghiệm Tuy nhiên tỉ lệ rấtthấp (dưới 0,8%) 58 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, chúng tơi có số kết luận sau: - Tổng đàn gia cầm nuôi địa bàn tỉnh trì hàng năm, đạt khoảng18 triệu tỉnh Nghệ An triệu tỉnh Thừa thiên Huế - Tỷ lệ tiêm phòng vaccine cúm gia cầm thấp, chưa đạt yêu cầu theo quy định - Dịch cúm gia cầm năm 2012 xảy mức độ “bùng phát mạnh, lây lan rộng Nghệ An, lại dịch xảy mang tính chất địa phương, nhỏ lẻ rải rác địa bàn tỉnh năm điều tra - Có lưu hành H5N1 chợ Vinh, tỉnh Nghệ An chợ Nọ, tỉnh Thừa Thiên Huế,chủng H5N6 lưu hành chợ Vinh thời gian giám sát.Ngoài lưu hành chủng H5N1, H5N6 cịn có lưu hành chủng cúm khác chủng HxNx H5Nx mà chưa xác định - Kỹ thuật Realtime RT-PCR ứng dụng để chẩn đoán nhiều bệnh động vật cạn thủy sản Cơ quan Thú y vùng III 5.2 KIẾN NGHỊ - Việc giám sát lưu hành chủng virus cúm gia cầm chợ gia cầm sống quan trọng Vì vậy, Cục Thú y Ủy ban nhân dân tỉnh Nghệ An Thừa Thiên Huế cần có phối hợp chặt chẽ giám sát lưu hành chủng virus cúm H5N1, H5N6, H7N9 nhằm dự báo sớm tình hình dịch bệnh, đặc biệt tháng cuối đầu năm tết Nguyên Đán - Cần trì tiêm phịng định kỳ cho tất gia cầm diện tiêm để đạt tỷ lệ bảo hộ cao, giảm khả nhiễm virus từ môi trường xung quanh - Kiểm soát chặt chẽ nguồn gia cầm chợ kinh doanh gia cầm sống, tăng cường công tác kiểm dịch, định kỳ phun tiêu độc khử trùng, vệ sinh môi trường khu vực xung quanh địa diểm buôn bán gia cầm, sản phẩm gia cầm - Qua kết xét nghiệm ta thấy tỷ lệ dương tính với virus cúm typ A tỉnh cao Do ngồi lưu hành chủng cúm A/H5N1 H5N6 cịn có nhiều subtype H N virus cúm typ A mà chưa xác định Vì cần có thêm nhiều đề tài nghiên cứu virus cúm gia cầm nhằm xác định subtyp khác virus cúm gia cầm 59 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bùi Quang Anh (2005) Báo cáo dịch Cúm gia cầm hội nghị kiểm soát dịch Cúm gia cầm khu vực Châu Á FAO, OIE tổ chức Thành phố Hồ Chí Minh từ 23 -25/02/2005 Bùi Quang Anh Văn Đăng Kỳ (2004) Bệnh cúm gia cầm: Lưu hành bệnh, chẩn đốn kiểm sốt dịch bệnh.Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 11 (3) tr 69 Cục Thú y (2004) Tài liệu tập huấn phương pháp chẩn đoán Cúm gia cầm Cục Thú y (2007) Sổ tay chẩn đoán Cúm gia cầm Cục Thú y (2015) Báo cáo tổng kết tình hình dịch bệnh năm 2015 Cục Thú y (2016) Báo cáo tổng kết tình hình dịch bệnh sáu tháng đầu năm 2016 Cục Thú y, phòng dịch tễ (2010) Báo cáo tổng kết cơng tác phịng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm năm 2009 phương hướng năm 2010, tr - Cục y tế dự phòng (2015) Khuyến cáo phòng bệnh cúm A/H7N9 Bộ Y tế, truy cập ngày 15/11/2015 tạihttp://vncdc.gov.vn/vi/khuyen-cao-phong-chong-dichbenh/276/khuyen-cao-phong-benh-cum-a-h7n9 Đào Yến Khanh Tô Long Thành (2009) Khảo nghiệm thực địa vaccine Cúm gia cầm H5N2 từ Hà Lan Trung Quốc Phần 1: Độ an toàn vaccine đáp ứng miễn dịch gà sau tiêm phịng Tạp chí KHKT Thú y tập XVI, số 10 Lê Văn Năm (2004) Bệnh Cúm gia cầm Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 11(3) tr 81 – 86 11 Nguyễn Bá Hiên (2014) Bệnh cúm người động vật NXB Nông nghiệp 12 Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ cs (2012) Giáo trình Bệnh truyền nhiễm Thú y, NXB Đại học Nông nghiệp 13 Nguyễn Lan Anh (2005) Hội nghị quốc tế lần thứ hai Cúm gia cầm Châu Á.http://www.hochiminhcity.gov.vn/left 2/24-02-2005.1 14 Nguyễn Ngọc Tiến (2013) Tình hình dịch cúm gia cầm giai đoạn 2008 - 2012 biện pháp phịng chống Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 20(01) tr 82 - 90 15 Nguyễn Tiến Dũng (2008) Vài nét Cúm gia cầm H5N1 Tạp chí Khoa học Thú Y, 14 16 Nguyễn Tiến Dũng, M Peiris, R Webter, K Inui, Đào Thanh Vân, Bùi Ngọc 60 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Anh, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Thế Vinh, Nguyễn Viết Không Ngô Thanh Long (2004) Nguồn gốc virus Cúm gia cầm H5N1 Việt Nam năm 2003/2004”, tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 11(3) tr – 14 17 Nguyễn Tuấn Anh (2006) Dịch Cúm gia cầm hai năm qua – nguyên nhân, tính chất dịch tồn Truy cập ngày 13/3/2016 http://www.cucchannuoi.gov.vn.vn/Web ID=1&NewsID=86 18 Phạm Sỹ Lăng (2004) Diễn biến Cúm gia cầm Châu Á hoạt động phịng chống bệnh Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y 11(3) tr 87 - 93 19 Phạm thành Long (2015) Tóm tắt kết cúm gia cầm Việt Nam giai đoạn 2011 – 2015 FAO hỗ trợ Buôn Mê Thuột ngày 06/5/2015 20 Phạm thành Long (2016) Kết giám sát lưu hành virus cúm gia cầm chợ giai đoạn 2015 – 2016, Hà Nội 21 Real time PCR- Kỹ thuật ứng dụng, Bio-Rad Laboratories, Inc 22 Tiêu Chuẩn Việt Nam (2006) Tiêu chuẩn ngành 10TCN: Quy trình chẩn đốn bệnh cúm gia cầm, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn 23 Tổ chức y tế giới (2004) Hướng dẫn phòng chống lây nhiễm bệnh Cúm gà Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội 24 Tô Long Thành (2004) Thông tin cập nhập tái xuất bệnh Cúm gia cầm nước Châu Á Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y 11(4) tr.87 – 93 25 Trần Hữu Cổn Bùi Quang Anh (2004) Bệnh cúm gia cầm biện pháp phịng chống Nhà xuất nơng nghiệp Hà Nội 26 Triệu Nguyên Trung Lê Thạnh (2014) Những hiểu biết cần thiết cúm A (H7N9) Viện sốt rét, ký sinh trùng côn trùng Quy Nhơn, truy cập ngày 06/9/2015 http://www.impe-qn.org.vn/impe-n/vn/portal/InfoDetail.jsp? area=58&cat=944 &ID=7834 Tiếng Anh: 27 Alexander D J (2007) An overview of the epidemiology of avian influenza Vaccine 25 (30) 5637 – 5639 28 Alexander D.J (1993) Orthomyxovirus Infections In Viral Infections of ertebrates, volume 3: Viral Infections of birds Mc Ferran J.B.& McNulty M.S., eds Horzinek M.C., Series editor Elserviers, Amsterdam, the Netherlands 287316 61 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 29 Avian influenza – Highly Pathogenic (HPAI) Fowl Plague http://www.thepoultrysite.com/diseas ai-fowl-plague 30 Baigent S J and J W Mc Cauley (2001) Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture Virus Res., 79 (1 - 2) 177 - 185 31 Basler C F (2007) Influenza viruses: basic biology and potential drug targets Infect Disord Drug Targets (4) pp 282 - 293 32 Beard C W (1998) Avian Influenza In Foreign Animal Diseases.United States Animal Health Association Pp 71-80 33 Bender et al (1999) Positive selection on the H3 hemagglutinin gen of human influenza virus A Mobio Evol 16 (11) pp 1457-1465 34 Bosch et al (1981) Proteolytic activation of the influenza virus hemagglutinin: The structure of the cleavage site and the enzymes involved in cleavage 35 Centanni E and E Savonuzzi (1901) La peste aviaria I & II Communicazione fatta all'accademia delle scienze mediche e naturali de Ferrara (in The history of avian influenza, Lupiani, B and Reddy S.M 1999) 36 Conenello G M., D Zamarin, L A.Perrone, T Tumpey and P Palese (2007) A single mutation in the PB1 – F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence PloS Pathog., 3(10) pp 1414-1421 37 Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO.http://www.who.int/csr/disease/avian 0/en/index.htm 38 De Wit E and RAM Fouchier (2008) Emerging Infuenza J Clin Virol Vol 41 pp 1-6 39 Gambotto A., S M.Barratt – Boyes, M D.de jong, G Neumann and Y Kawaoka (2008) Human infection with highly pathogenic H5N1 influenza virus Lancet., 371 (9622) pp 1464-1475 40 Ian R T (1982) An Introduction to Veterinary Immonology W B Saunders Co 41 Ito T., Y Kawaoka and K.G Nicholson (1998) Avian influenza K G Nicholson, R G Webster and A J Hay, eds., Texbook of influenza Blackwell Sciences, Exford, UK Pp 126-135 42 Kawaoka Y (1991) Diffrence in receptor specificity among influenza A virus from diffirent species of animals J Vet Med Sci pp 357-358 62 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 43 Kishida N., Y Sakoda, N Isoda, K Matsuda, M Eto, Y Sunaga, T Umemura andH Kida (2005) Pathogensis of H5 influenza viruses for ducks Arch Virol Jul, 150 (7) 1383 - 1392 44 Klenk H D., R Geyer and R T Schwarz (1983) The characterization of influenza virus by carbohydrate analysis Curr top Microbiol Immuno pp 247257 45 Luong and Palese (1992) Gentic analysis of influenza virus Curr Opin Gent Dev pp.77–81 46 Murphy and R G Webster (1996) Orthomyxoviruses In B N Fields, D M Knipe, P M Howley et al (ed) Fields Virology, 3rd ed Lippincott - Raven pblishers, Philadenphia, Pa, 1397 - 1445 47 Nayak D., E Hui and S Barman (2004) Assembly and budding of influenza virus Virus Res., 106(2) pp 147-165 48 Nicholson K G., J M.Wood, M Zambon (2003) Influenza Lancet., 362 (9397) pp 1733-1745 49 Webster R G (1998) Influenza: an emerging disease Emerg Infect Dis., 4, pp 436-441 50 WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group (2008) Toward a unified nomenclature system for highly pathogenic avian influenza virus (H5N1) Emerg Infect Dis., 14(7): el 51 Zhao Z M., K F.Shortridge, M.Garcia, Y Guan and X F.Wan (2008) Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses J Gen Virol., 89 (9) pp 2185-2193 63 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Một số hình ảnh bệnh tích cúm gia cầm Da chân xuất huyết Mào, tích tím tái Ruột xuất huyết Tim, tinh hồn xuất huyết Xuất huyết niêm mạc khí quản Gà mắc cúm 64 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Một số hình ảnh phản ứng Realtime RT – PCR Bộ kit chiết tách RNA Mẫu bảo quản thùng bảo ôn Mẫu xét nghiệmXử lý mẫu Ly tâm mẫu Phân tích kết 65 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết xét nghiệm máy BIO RAD PCR Quantification Detailed Report PCR Base Line Subtracted Curve FitData (FAM) Contains All Available Data Genral Data Data File Name Data 2016-2-21-AI(M).opd Data File Path C:\Program Files\Bio-Rad\iQ5\Users\admin\Result Collected Data Collected Data Current Date 2/21/2016 10:26:13 AM Run Date 2/21/2016 2:26:13 AM User aborted the run No Active RMEs Original Active Well Factors Persistent Background Readings Valid Yes RME Valid Yes Well Factors Valid Yes Plate Setyp File Name 210216-AI(M).pts Plate Setyp File Path C:\Program Files\Bio-Rad\iQ5\Users\admin\Template Protocol File Name (M, H5, N1) Invitrogen.tmo Protocol File Path C:\Program Files\Bio-Rad\iQ5\Users\admin\Protocol Computer name FAO Created by app iQ5.exe (v2.0.148.60623 (OS-Microsoft Windows NT 5.1.2600.0.Service Pack 2, CLR-1.1.4322.2463, Cultureen-US).) Created by user BioRad\admin Creation Date 21/02/2016 2:26:13 AM Created in Security Edition No Last Creation GUID 4b15a331-e9a3-408a-b563-46cdc45d44a1 Modified by user BioRad\admin Last modified date 21/02/2016 2:26:13 AM OS Build and Service Pack 2600 (Service Pack 2) Report differs from last save Yes 66 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Notes: Protocol: Cycle 1: (1X) Step 1: 50.0 °C for 15:00 Step 2: 95.0 °C for 02:00 Step 1: 95.0 °C for 00:10 Step 2: 58.0 °C for 00:50 Cycle 2: (40X) Data collection and real-time analysis enabled Modified Protocol: Protocol unchanged PCR Quantification Data PCR Amp/Cycle Chart 67 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Standard Curve Data Standard Curve Chart Not available Fluor PCR R Slope y-Intercept 0.000 Efficiency(%) Squared FAM 100.0 0.000 0.000 Units Quantity Original Units Units Fluor Changed? FAM No copy number Number of valid standard wells: copy number None Standard Curve Spreadsheet Data Fluor Well Typ Ident Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct Set SQ Mean SD Mean SD Point FAM B01 Unkn - 34.96 N/A 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 34.96 0.000 N/A FAM B02 Unkn - 32.84 N/A 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 32.84 0.000 N/A FAM B03 Unkn - 33.51 N/A 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 33.51 0.000 N/A FAM B04 Unkn - 34.04 N/A 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 34.04 0.000 N/A FAM B05 Unkn - 37.24 N/A 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 37.24 0.000 N/A FAM B06 Unkn - N/A N/A 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 00 0.000 N/A FAM B07 Unkn - N/A N/A 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 00 0.000 N/A FAM B08 Unkn - N/A N/A 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 00 0.000 N/A FAM C01 Unkn - N/A N/A 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 00 0.000 N/A FAM C02 Unkn - 10 20.70 N/A 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 20.70 0.000 N/A FAM C03 Unkn - 11 31.05 N/A 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 31.05 0.000 N/A FAM C04 Unkn - 12 28.58 N/A 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 28.58 0.000 N/A FAM C05 Pos Ctrl - 25.90 N/A 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 25.90 0.000 N/A FAM C06 Neg Ctrl - N/A 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 00 N/A 0.000 N/A 68 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Run Parameters Hot Start? Temperature Control Mode: Volume: Data Analysis Parameters No Algorithmic 25 ul Display Controls Fluor FAM Display Mode SinglePoint Data Selection Fluor Size FAM Data Window Center 99% End Global Filter Filter Typ Off PCR Digital Digital Filtering Fluor Enabled? FAM Smoothing Filter Desired Width Weighted Mean PCR Data Analysis Method Fluor FAM Data Analysis Method PCR Base Line Subtracted Curve Fit PCR Baseline Data Analysis Parameters Baseline Calculation Fluor Cycles Method FAM Baseline Auto Baseline Cycle Calculation? Start Data Window Yes Overriden Baseline Cycles Threshold Calculation Baseline End N/A N/A None Fluor Use Auto Threshold? Threshold Value FAM No Excluded Wells Excluded Well Count: Global Auto Calculated Threshold Value 64.68 User Defined 177.87 Modified WellsModified Well Count: End Kết xét nghiệm mẫu chợ Vinh – Nghệ An ngày 21/2/2016 69 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... sát lưu hành chủng virus cúm A/H5N1, H5N6, H7N9 số chợ buôn bán gia cầm sống địa bàn tỉnh Nghệ An, Thừa Thiên Huế ứng dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR chẩn đoán bệnh Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01... phịng bệnh có hiệu Nhằm giải vấn đề đây, thực đề tài: Giám sát lưu hành chủng virus cúm A/H5N1, H5N6, H7N9 số chợ buôn bán gia cầm sống địa bàn tỉnh Nghệ An, Thừa Thiên Huế ứng dụng kỹ thuật Realtime. .. vaccine cúm gia cầm tỉnh Nghệ An Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016 -Diễn biến cúm gia cầm tỉnh Nghệ An Thừa Thiên Huế từ 2012 - 2016 -Giám sát lưu hành virus cúm A/H5N1, H5N6 H7N9 chợ Vinh, tỉnh Nghệ