Nhóm 3 ứng dụng real time pcr trong chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh phong

Mục tiêu đề tài Trang 9 2 khác được chẩn đoán phân biệt với bệnh phong.. 2.4 Các phương pháp phát hiện bệnh phong Thông thường, bệnh phong có thể được chẩn đoán dựa trên các dấu hiệu l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

ỨNG DỤNG REAL TIME PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VI

KHUẨN GÂY BỆNH PHONG

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : NHÓM 3

Lớp : CHIỀU THỨ 6 Niên khóa : 2021 – 2025

TP Thủ Đức, 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

ỨNG DỤNG REAL TIME PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VI

KHUẨN GÂY BỆNH PHONG

Hướng dẫn khoá học Sinh viên thực hiện

TS Huỳnh Văn Biết Nguyễn Minh Khôi

Ths Trương Quang Toản Ngô Hoàng Mai

Lê Thị Ngọc Loan

DANH SÁCH THÀNH VIÊN

Họ và tên MSSV Ký tên Nguyễn Minh Khôi 20126271

Ngô Hoàng Mai 21126405

Lê Thị Ngọc Loan 21126394

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH ii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về bệnh phong 3

2.2 Tình hình bệnh phong và các nghiên cứu liên quan 3

2.3 Vi khuẩn phong 4

2.4 Các phương pháp phát hiện bệnh phong 4

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 5

3.1 Vật liệu nghiên cứu 5

3.1.1 Nguồn mẫu 5

3.1.2 Mẫu phân lập vi khuẩn và DNA tổng hợp 6

3.2 Phương pháp nghiên cứu 6

3.2.1 Đánh giá đường cong chuẩn và giới hạn phát hiện 95% 6

3.2.2 Phương pháp Real time PCR 6

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ 8

4.1.Hiệu suất phân tích 8

4.2 Sự ổn định 10

4.3 Hiệu suất chẩn đoán 11

4.4 Xác nhận xét nghiệm 13

4.5 Thảo luận 13

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 15

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1 Đặc điểm lâm sàng và nhân khẩu học của tất cả bệnh nhân 5

Hình 2 Đường cong tiêu chuẩn khuếch đại của các mục tiêu 16S rRNA và RLEP 8

Hình 3Giới hạn phát hiện phân tích 95% (LoD 95%) đối với 16S rRNA và RLEP 9

Hình 4 Độ đặc hiệu phân tích với các phản ứng ghép kênh 16S rRNA và RLEP 10

Hình 5 Độ ổn định của các phản ứng trong 5 tháng 11

Hình 6 Hiệu suất chẩn đoán của qPCR ghép kênh mới 12

Hình 7 Phân phối giá trị Cp thu được 12

ii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1 Trình tự primer và loại probe phát huỳnh quang 7

ODD: Other Dermatological diseases

PPV: Positive Predictive Value

NPV: Negative Predictive Value

iv

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bệnh phong là một bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn phong (Mycobacterium leprae) bị bỏ quên nhưng vẫn là một vấn đề sức khỏe cộng đồng với hơn 200.000 ca mắc bệnh mỗi năm trên toàn thế giới Chẩn đoán thường muộn và mặc dù đã có phương pháp điều trị cụ thể và hiệu quả nhưng có khả năng lây truyền xảy ra trước khi bệnh nhân được chẩn đoán và điều trị đầy đủ, do đó góp phần duy trì sự lây truyền

Số lượng lớn bệnh nhân trẻ tuổi (dưới 15 tuổi) và bệnh nhân khuyết tật do bệnh đã ở giai đoạn muộn càng khẳng định giả thuyết này Hơn nữa, các dạng lâm sàng rất khác nhau, từ dạng cục bộ (bệnh lao) đến dạng lan tỏa (bệnh phong), khiến việc chẩn đoán trở nên khó khăn Bằng chứng cho thấy chẩn đoán sớm có thể ngăn ngừa lây truyền

và giúp kiểm soát dịch tễ học

Các phương pháp như phát hiện chỉ số vi khuẩn bằng kính hiển vi và kiểm tra mô bệnh học là những công cụ bổ sung chính để chẩn đoán bệnh phong Các phương pháp

vi khuẩn học cổ điển không thể xác nhận bệnh phong vì M leprae không phát triển

in vitro Ngoài ra, không có dấu hiệu đáng tin cậy nào để ước tính nguy cơ tiến triển của bệnh Về vấn đề này, trình tự của M leprae Genome là một cột mốc quan trọng hướng tới sự cải thiện trực tiếp M leprae, không chỉ giúp mô tả đặc điểm tốt hơn các mục tiêu gen duy nhất của M leprae mà còn so sánh rộng rãi các loại vi khuẩn mycobacteria khác nhau

1.2 Mục tiêu đề tài

Trong vài năm qua, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện bằng kỹ thuật PCR để phát hiện M leprae DNA trong mẫu bệnh phẩm PCR đã được sử dụng đặc biệt trong các chẩn đoán khó khăn như bệnh ít vi khuẩn không rõ ràng hoặc theo dõi những người tiếp xúc trong gia đình Trong bối cảnh này, một số mục tiêu khác nhau đã được mô tả nhằm cố gắng thiết lập xét nghiệm nhạy cảm và cụ thể nhất Tuy nhiên, hầu hết các quy trình PCR đều được phát triển, đánh giá và xác nhận bằng cách sử dụng thuốc thử hoặc xét nghiệm được sản xuất không có quy trình thực hành sản xuất tốt (GMP) Ngoài ra, hầu hết các nghiên cứu chỉ tuyển chọn bệnh nhân phong và không tuyển chọn bệnh nhân mắc các bệnh da liễu thông thường

2

khác được chẩn đoán phân biệt với bệnh phong Vì vậy, việc phát triển và xác nhận một xét nghiệm ở các phòng thí nghiệm khác nhau đã trở nên cần thiết

1.3 Nội dung thực hiện

Ở đây, tác giả trình bày sự phát triển và xác nhận xét nghiệm Realtime PCR đa kênh nhằm mục đích chuẩn hóa xét nghiệm chẩn đoán phân tử bệnh phong Giao thức được thiết kế để phát hiện đồng thời hai gen mục tiêu của M leprae (gen 16S rRNA

và RLEP), trước đây được sử dụng trong một số nghiên cứu và một mục tiêu ở động vật có vú (gen 18S rRNA), đóng vai trò kiểm soát phản ứng Phản ứng chéo được đánh giá bằng cách sử dụng DNA từ 20 loài vi khuẩn mycobacteria và các loài gây bệnh da khác có liên quan và không tìm thấy kết quả trùng khớp Xét nghiệm mới đã được xác nhận bằng cách sử dụng 97 mẫu sinh thiết da và một hội đồng độc lập tuyển chọn 50 mẫu được lấy từ các bệnh nhân trước đây được đặc trưng bởi khám lâm sàng

và mô bệnh học, cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao PCR ghép kênh mới cũng được đánh giá theo các tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng và dữ liệu chỉ ra rằng xét nghiệm này ổn định và có thể tái sản xuất Các kết quả được trình bày ở đây là cơ sở của một công cụ mới và mạnh mẽ có khả năng tăng độ chính xác của chẩn đoán bệnh phong trong các phòng thí nghiệm thông thường

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về bệnh phong

Bệnh phong là một bệnh nhiễm trùng mãn tính thường do trực khuẩn ưa axit Mycobacterium leprae hoặc sinh vật có liên quan chặt chẽ M lepromatosis gây ra Những sinh vật này có hướng tính độc nhất đối với các dây thần kinh ngoại vi, da và màng nhầy của đường hô hấp trên Triệu chứng là rất đa dạng và bao gồm nhiều loại hình tổn thương da và bệnh lý thần kinh ngoại vi M leprae là nguyên nhân gây ra bệnh phong duy nhất cho đến năm 2008, khi một loài thứ hai, M lepromatosis được xác định ở Mexico Cùng với nhau, hai sinh vật này được gọi là phức hợp M leprae

Ở nhiều nơi trên thế giới, bệnh phong rất hiếm gặp Đây là một bệnh nhiễm trùng phức tạp, chưa hiểu biết rõ và khó nghiên cứu Mặc dù bệnh phong không lây nhiễm cao (trái với suy nghĩ thông thường), hiếm khi gây tử vong và có thể được điều trị hiệu quả bằng thuốc kháng sinh, nhưng bệnh vẫn tiếp tục gây ra sự kỳ thị xã hội đáng

kể Sự hiểu lầm về bệnh có thể tồn tại bởi vì bệnh phong là không thể chữa khỏi trước khi sự ra đời của liệu pháp kháng sinh hiệu quả vào những năm 1940 Những người mắc bệnh sẽ bị biến dạng và thường bị khuyết tật nghiêm trọng, làm cho họ sợ và tránh xa người khác Vì sự kỳ thị xã hội này, tác động tâm lý của bệnh phong là rất nghiêm trọng

2.2 Tình hình bệnh phong và các nghiên cứu liên quan

Trên toàn cầu, số ca bệnh phong đang giảm Vào năm 2020, khoảng 130.000 trường hợp mắc mới đã được báo cáo, và khoảng 73% trường hợp xảy ra ở Ấn Độ, Brazil và Indonesia Năm 2020, 159 trường hợp mới được báo cáo ở Mỹ; khoảng ba phần tư xảy ra ở 6 tiểu bang: California, Florida, Hawaii, Louisiana, New York, and Texas Hầu hết các trường hợp mắc bệnh phong ở Hoa Kỳ liên quan đến những người

di cư từ hoặc làm việc tại các quốc gia nơi thường có bệnh phong Hầu hết các trường hợp mắc phải ở bản địa liên quan đến những người sống ở các bang miền nam, nơi tìm thấy những con giáp chín dải với các kiểu gen độc nhất của M leprae Những kiểu gen độc đáo này được tìm thấy ở những bệnh nhân Hoa Kỳ có khả năng mắc bệnh phong ở Hoa Kỳ, và nhiều bệnh nhân trong số này cho biết đã tiếp xúc trực tiếp với armadillos Bệnh phong có thể phát sinh ở mọi lứa tuổi Tuổi cao là một yếu tố

2.4 Các phương pháp phát hiện bệnh phong

Thông thường, bệnh phong có thể được chẩn đoán dựa trên các dấu hiệu lâm sàng của bệnh Ngoài ra, bác sĩ sẽ thực hiện một số sinh thiết như lấy một mảnh da/dây thần kinh từ người bệnh và gửi đến làm xét nghiệm Các xét nghiệm da để chẩn đoán bệnh phong cũng sẽ được tiến hành để xác định loại bệnh bằng cách tiêm một lượng nhỏ vi khuẩn gây bệnh (nhưng đã bị bất hoạt) vào da, điển hình là ở cẳng tay trên Những người mắc bệnh phong ở mức độ 1 hoặc mức độ 2 sẽ có kết quả dương tính tại vị trí tiêm

Ngoài ra các phương pháp như phát hiện chỉ số vi khuẩn bằng kính hiển vi và kiểm tra mô bệnh học là những công cụ bổ sung chính để chẩn đoán bệnh phong, tuy nhiên những phương pháp này không thể xác nhận bệnh nhân có bị bệnh phong hay không vì M leprae không phát triển in vitro và không có dấu hiệu đáng tin cậy nào

để ước tính nguy cơ tiến triển của bệnh

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

Chín mươi bảy mẫu (53 mẫu sinh thiết da từ bệnh nhân phong và 44 mẫu sinh thiết da từ bệnh nhân mắc các bệnh về da khác) đã được sử dụng cho xét nghiệm qPCR Đặc điểm lâm sàng và nhân khẩu học của tất cả bệnh nhân được thể hiện trong Hình 1

Các bệnh nhân phong được xác định theo phân loại lâm sàng, vi khuẩn học và giải phẫu bệnh học của Ridley-Jopling (R&J) và phân loại hoạt động thành các dạng nhiều bacilli (MB) hoặc ít bacilli (PB) theo WHO Các bệnh nhân phong hoặc các bệnh

da khác (ODD) được điều trị theo tình trạng bệnh của họ

Hình 1 Đặc điểm lâm sàng và nhân khẩu học của tất cả bệnh nhân

6

3.1.2 Mẫu phân lập vi khuẩn và DNA tổng hợp

Các mẫu phân lập chính trong nghiên cứu này bao gồm: M.leprae Thai-53 được tách sạch từ chân chuột BALB/c không có tuyến ức DNA tinh khiết từ M.leprae được

sử dụng làm đối chứng dương tính và trong các nghiên cứu độ nhạy phân tích DNA

từ 21 mẫu đã được sử dụng cho nghiên cứu độ đặc hiệu phân tích Ngoài ra còn có các mẫu khác bao gồm L.amazonensis và L.braziliensis, và DNA từ nhiều loài vi khuẩn mycobacteria khác nhau

Loại DNA dùng để tổng hợp là DNA tổng hợp (gBlock) bao gồm một chuỗi DNA kép chứa trình tự của ba gen mục tiêu (RLEP, 16S rRNA và 18S rRNA)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Đánh giá đường cong chuẩn và giới hạn phát hiện 95%

Đường cong chuẩn được sử dụng để xác định giới hạn phát hiện và độ ổn định của xét nghiệm, sử dụng một loạt các độ pha loãng nối tiếp (1:10) từ M.leprae hoặc DNA tổng hợp Chuỗi pha loãng dao động từ 0,5 fg/phản ứng đến 5 ng/phản ứng đối với DNA M.leprae tinh khiết và 1,83 ×107 bản sao/phản ứng đối với DNA tổng hợp 3.2.2 Phương pháp Real time PCR

Tác giả đã thiết kế và xác thực một phương pháp PCR đồng thời nhiều mục tiêu, có thể phát hiện cùng lúc hai mục tiêu của M.leprae (gen 16S rRNA và RLEP)

và một mục tiêu của động vật có vú (gen 18S rRNA), để kiểm soát quá trình phản ứng Các vùng gen này được chọn vì chúng có độ đặc hiệu cao cho M.leprae hoặc người, nghĩa là chúng không trùng khớp với các gen của các loài khác Tuy nhiên, bộ định vị 16S rRNA có thể nhầm lẫn với M.lepromatosis, một loài vi khuẩn gây bệnh phong khác, nên cần có một chất đánh dấu khác biệt để loại trừ khả năng này

Một xét nghiệm qPCR đã được phát triển với các primer và probe phát huỳnh quang để phát hiện các vùng từ gen RLEP và 16S rRNA của M.leprae, và gen 18S rRNA của người (Bảng 3.2)

Đối với mỗi phản ứng, 5 μL dung dịch DNA được thêm vào để có thể tích cuối cùng là 25 μL Các hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị theo ba lần và được khuếch đại ở 95˚C trong 10 phút, và 45 chu kỳ: 95˚C trong 15 giây và 60˚C trong 1 phút (chọn đọc kết quả tại bước này), 72°C trong 20 giây

Bảng 3.2 Trình tự primer và loại probe phát huỳnh quang

Tất cả các phản ứng đều bao gồm một đối chứng dương là mẫu DNA có chứa M.leprae, được dùng để kiểm tra tính chính xác của qPCR và nước làm đối chứng âm không có DNA nào, được dùng để kiểm tra sự nhiễm bẩn của qPCR

Giai đoạn khởi đầu: đây là giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 95°C và được tiến hành trong 10 phút

Giai đoạn biến tính: đây là bước đầu tiên của chu kỳ và là quá trình tăng nhiệt

độ lên 95°C trong 15 giây ADN được biển tỉnh bằng cách phá vỡ liên kết hydro giữa các bazo, tạo thành phân tử ADN sợi đơn

Giai đoạn gắn mối: nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 60°C trong 1 phút để mỗi gắn vào sợi ADN đơn Nhiệt độ nảy cần phải đủ thấp để cho phép mỗi bắt cặp với sợi ADN, nhưng cũng đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là, mỗi chỉ nền gắn hoàn toàn với phần trình tự bổ sung trên mạch khuôn Nếu nhiệt độ quả thấp mỗi

sẽ gắn không đặc hiệu Nếu quả cao, mỗi có thể không gắn Thông thưởng nhiệt độ gắn mỗi thường thấp hơn 3-5°C so với Tm của mỗi dung trong phản ứng Liên kết hydro bền giữa phân từ ADN- ADN chỉ được hình thành khi mỗi bổ sung hoàn toàn với khuôn Polymerase liên kết với các phân tử lại ADN mỗi khuôn và bắt đầu tổng hợp ADN

Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ 72°C được sử dụng trong 20 giây tại giai đoạn này ADN polymerase tổng hợp sợi ADN mới bổ sung với ADN khuôn bằng cách thêm dNTP theo nguyên tắc bổ sung theo chiều 5' đến 3', phản ứng trùng ngưng xảy ra giữa nhóm 5' phosphate của NTP với nhóm 3' hydroxyl phía cuối của sợi ADN vừa mới được hình thành Thời gian của giai đoạn kéo dài phụ thuộc vào ADN polymerase và

độ dải của đoạn DNA cần khuếch đại

8

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ

4.1 Hiệu suất phân tích

Các mồi và đầu dò thủy phân được thiết kế để nhắm mục tiêu các chuỗi 16S rRNA và RLEP của M leprae đã được thử nghiệm trong các phản ứng đa pha để phát hiện đồng thời trình tự 18S rRNA của con người Ngưỡng huỳnh quang tối ưu đã được chọn dựa trên thông lệ chung là nó phải được đặt ở nửa dưới của biểu đồ đường cong tích lũy huỳnh quang từ độ pha loãng 10 lần

Sau khi đặt đường cơ sở cho chức năng tự động, các giá trị ngưỡng huỳnh quang được chọn để xác định giá trị Cp (Điểm giao nhau) cho từng mục tiêu đã được đặt và được thiết lập như sau: 0,2 cho RLEP, 0,15 đối với rRNA 16S và 0,16 đối với rRNA 18S

Giới hạn phát hiện phân tích 95% (LoD 95% ) được xác định từ một loạt các thử nghiệm trong đó DNA chiết xuất từ M leprae được pha loãng từ 5 ng xuống 100 ag/phản ứng Các mô hình Probit được trang bị và LoD 95% thu được cho 16S rRNA và RLEP, được xác định bằng thực nghiệm là khoảng 450 fg DNA (khoảng 126 bộ gen M leprae) đối với gen 16S rRNA và khoảng 4,60 fg DNA (khoảng 4,60 fg DNA (khoảng 126 gen) 1,3 M leprae ) cho gen RLEP

Hình 2 Đường cong tiêu chuẩn khuếch đại của các mục tiêu 16S rRNA và RLEP

Phản ứng ghép kênh đã phát triển được đánh giá dựa trên tập hợp các vi sinh vật để đánh giá tính đặc hiệu của mồi và mẫu dò trong các điều kiện này hầu hết các khuếch đại dương được quan sát đều tương ứng với RLEP, được phát hiện trong hai trong số ba lần lặp lại ở M fortuitum và M kyroniense

Hình 3 Giới hạn phát hiện phân tích 95% (LoD 95%) đối với 16S rRNA và RLEP

10

Mặc dù một số phản ứng thể hiện tín hiệu 16S rRNA trên ngưỡng, những sự khuếch đại này rất không đặc trưng và có thể dễ dàng phân biệt được với sự khuếch đại thích hợp khi so sánh với đối chứng dương với 500 fg/phản ứng của M leprae

DNA chiết xuất từ các vi sinh vật được chỉ định (mỗi vi sinh vật 5 ng/μL) được sử dụng trong các phản ứng ghép kênh được thực hiện ba lần về mặt kỹ thuật trong hai thí nghiệm độc lập Kết quả được so sánh với biểu đồ khuếch đại cho 100 fg M leprae DNA/μL (bảng trên cùng bên trái) Cấu hình khuếch đại được hiển thị cho từng mục tiêu và mỗi dòng tương ứng với một giếng riêng lẻ Các đường chấm chấm biểu thị ngưỡng cho RLEP (mức cao nhất trong hai mục tiêu M leprae , ở mức 0,2)

4.2 Sự ổn định

Độ ổn định bảo quản được đánh giá bằng cách thực hiện đánh giá hàng tháng các phản ứng với các nồng độ khác nhau của phân tử DNA tổng hợp trong 5 tháng Hầu hết các điểm dữ liệu được kiểm tra đều dao động dưới giới hạn đã thiết lập của ba độ lệch chuẩn trên mức trung bình của tất cả các điểm thời gian Hình ảnh dưới đây hiển thị

Cp thu được cho ba mục tiêu được đánh giá (16S rRNA, RLEP và 18S rRNA) ở nồng

độ đại diện cho ngắn gọn, trong khoảng thời gian 5 tháng Thử nghiệm vẫn đáng tin cậy đối với toàn bộ phạm vi nồng độ được thử nghiệm

Mỗi bảng hiển thị các giá trị Cp thu được cho từng mục tiêu (dòng của bảng) và cho từng nồng độ mẫu (cột của bảng) theo thời gian

Hình 4 Độ đặc hiệu phân tích đối với các phản ứng ghép kênh 16S rRNA và RLEP