ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU MỞ ĐẦU Hiện nay, một trong các vấn đề nóng bỏng về chăm sóc sức khỏe sinh sản mà các nước trên thế giới đang đối mặt là bệnh lây truyền qua đường tình dục Viêm đường sinh dục do Ch[.]
MỞ ĐẦU Hiện nay, vấn đề nóng bỏng chăm sóc sức khỏe sinh sản mà nước giới đối mặt bệnh lây truyền qua đường tình dục Viêm đường sinh dục Chlamydia trachomatis coi bệnh lây truyền qua đường tình dục đứng đầu giới Nhiễm Chlamydia trachomatis thường gây viêm niệu đạo, viêm cổ tử cung Tuy nhiên nếu không điều trị có thể dẫn đến các biến chứng viêm phần phụ, đau vùng chậu mãn tính, thai ngồi tử cung, vơ sinh tổn thương ống dẫn trứng, viêm mào tinh đòi hỏi phải chăm sóc y tế với phí tổn cao Tổ chức Y tế giới ước tính hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm Chlamydia trachomatis phát [34] Bệnh Chlamydia trachomatis hay gặp người trẻ tuổi, độ tuổi sinh đẻ Các nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh tăng lên Tại Châu Âu từ năm 1996-2003, số bệnh nhân nhiễm Chlamydia trachomatis tăng gấp đôi, Hoa Kỳ số tăng 14% giai đoạn 2000-2005 [15, 18] Ở Việt Nam khoảng vài năm gần vấn đề nhiễm khuẩn Chlamydia trachomatis ý Một vài nghiên cứu đưa tỷ lệ khoảng 30% trường hợp đến khám phụ khoa có tiết dịch đường âm đạo bất thường Chlamydia trachomatis Nguy hiểm nhiễm Chlamydia trachomatis qua đường sinh dục có tới 75% nữ giới 50% nam giới mắc bệnh mà khơng có triệu chứng, người bệnh hồn tồn khơng biết nhiễm vi khuẩn [2,9] Để chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis người ta thường dùng xét nghiệm ni cấy- tiêu chuẩn vàng để chẩn đốn xác định nhiễm Chlamydia trachomatis Tuy nhiên xét nghiệm có hạn chế phải bảo đảm vi khuẩn cịn sống q trình vận chuyển đến phịng xét nghiệm, thời gian xét nghiệm dài Khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng rộng rãi y học để phát tồn vi sinh vật mẫu bệnh phẩm Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction– PCR) NAATs có độ nhạy độ đặc hiệu cao, nhiều nghiên cứu xem PCR tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị xét nghiệm chẩn đoán khác Đối với bệnh nhiễm Chlamydia trachomatis, xét nghiệm cho phép xác định tồn vi khuẩn dịch âm đạo, tử cung bệnh nhân Với mong muốn đóng góp vào cơng tác chăm sóc sức khỏe nói chung cơng tác chăm sóc sức khỏe sinh sản nói riêng, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung Chlamydia trachomatis Bệnh viện Đại học Y Thái Bình” với mục tiêu: - Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật thực phản ứng PCR phát vi khuẩn Chlamydia trachomatis - Xác định tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis bệnh nhân viêm âm đạo, cổ tử cung Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Chlamydia trachomatis Chlamydia trachomatis thuộc chi Chlamydia, họ Chlamydiaceae, lớp Chlamydiae, ngành Chlamydiae, giới Bacteria [2, 9] Về hình thái quan sát kính hiển vi quang học, vi khuẩn có hình cầu hình bầu dục, kích thước khác nhau, vi khuẩn Gram âm có màng lipopolisaccharide Vì thiếu số enzyme tổng hợp hợp chất cao sử dụng cho tế bào, vi khuẩn phải ký sinh nội bào bắt buộc, khơng có khả sống sót bên tế bào Hệ gen Chlamydia trachomatis gồm phân tử DNA dài 1.042.519 nucleotide với 894 trình tự mã hóa cho protein Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen vi khuẩn Chlamydia trachomatis ( Theo Deborah Dean et al., (2009) Predicting Phenotype and Emerging Strains among Chlamydia trachomatis Infections, CDC Home Vol 15.(9)) Chlamydia trachomatis (C.trachomatis) chứa đến 10 plasmid có kích thước 7.5 kb Trình tự nucleotide plasmid trình tự bảo thủ cao (có 1% nucleotide thay thế), chứa khung đọc mở (Open Reading Frame) mã hoá gen kháng nguyên Mặc dù chức plasmid cịn chưa xác định hết trình tự nucleotide có mặt plasmid tế bào chứng tỏ có vai trị quan trọng vi khuẩn C.trachomatis C.trachomatis chia thành 15 loại tuýp huyết khác bao gồm: Tuýp huyết (A-K), L1, L2, L3, Ba, Da, Ia L2a Trong tuýp A, B, Ba C gây bệnh mắt hột Tuýp D, E, F, G, H, I, J K gây bệnh viêm đường sinh dục Tuýp L1, L2 L3 gây bệnh lympho hạt, bệnh viêm hạch bạch huyết hoa liễu bẹn [2,9] Chu kỳ phát triển C.trachomatis bào tương tế bào kéo dài 48-72 [34] Vòng đời C.trachomatis gồm giai đoạn: Thể thể lưới - Thể (Elementary Body- EB) tế bào trịn có đường kính khoảng 0.3m, nhân đậm Thể xâm nhập vào tế bào theo kiểu thực bào - Thể lưới (Reticulate Body- RB): Sau xâm nhập vào tế bào C.trachomatis chuyển hóa nhờ tế bào tạo thành thể lưới (đường kính 1m), sinh sản theo hình thức phân đơi kiểu trực phân khoảng 2-3 lần Sau thể lưới lại chuyển thành thể giải phóng khỏi tế bào thơng qua hình thức ngoại tiết bào (exocytosis) Thơng thường thể lưới giải phóng 100-1000 thể tiếp tục xâm nhập vào tế bào Hình 1.2 Chu kỳ vịng đời vi khuẩn C.trachomatis (theo Yvonne Pannekoek) Đường truyền bệnh: Vi khuẩn C.trachomatis vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc, khơng có khả sống sót ngồi tế bào nên đường truyền chủ yếu đường tình dục lây từ mẹ sang người mẹ mang thai bị nhiễm C.trachomatis Khả gây bệnh: C.trachomatis có khả gây nên bệnh người: Bệnh mắt hột bệnh nhiễm trùng sinh dục tiết niệu, bệnh sinh dục tiết niệu nhiều tuýp (D, E, F, G, H, I, J K) gây ra, tăng nhanh số lượng người mắc Trẻ sơ sinh bị mắc bệnh viêm kết mạc viêm phổi C.trachomatis bị lây từ mẹ Ở phụ nữ Có tới 75% phụ nữ khơng có biểu triệu chứng lâm sàng triệu chứng có khơng điển hình [3], nên việc chẩn đốn sàng lọc nhiễm C.trachomatis đơn dựa vào triệu chứng lâm sàng hồn tồn khơng khả thi Cho đến có biểu viêm vùng chậu bệnh nhân khám vơ sinh phát có tổn thương ống dẫn trứng C.trachomatis gây biến chứng khó phục hồi Vì cần thiết phải có phương pháp chẩn đốn xác phù hợp giúp phát C.trachomatis nhằm ngăn chặn hậu mà gây Ở nữ giới, vi khuẩn C.trachomatis gây viêm âm đao, cổ tử cung niệu đạo Các biến chứng thường gặp ở bệnh nhân nhiễm C.trachomatis mạn tính bao gờm: - Tắc vịi trứng phụ nữ: Một nguyên nhân gây tắc vòi trứng viễm nhiễm vòi trứng, buồng trứng, dây chằng quanh tử cung vịi trứng C.trachomatis - Chửa ngồi tử cung: Ngun nhân viêm nhiễm vịi trứng C.trachomatis khiến phơi thai tắc điểm hẹp Phôi thai lớn dần lên, đến mức phá vỡ mạch máu nơi đậu lại vịi trứng, gây chảy máu dội ổ bụng, làm thai phụ tử vong nhanh chóng Nhiều thống kê cho thấy có tới 9% phụ nữ nhiễm C.trachomatis bị chửa tử cung - Viêm vùng chậu: Phần lớn, viêm vùng chậu vi khuẩn lậu C.trachomatis gây ra. Viêm vùng chậu bệnh thầm lặng, nhiều tác giả thống kê cho thấy có tới 40% phụ nữ nhiễm C.trachomatis bị viêm nhiễm vùng tiểu khung, số có 20% bị vơ sinh làm ảnh hưởng khơng nhỏ tới chất lượng sống - C.trachomatis kết hợp với HPV (Human papilloma virus) – virus gây u nhú có khả đưa đến ung thư cổ tử cung Ở nam giới Ở nam giới triệu chứng lâm sàng nhiễm C.trachomatis mờ nhạt hơn, biểu viêm niệu đạo có mủ mà giới chuyên khoa gọi viêm niệu đạo khơng lậu, sau dẫn đến viêm mào tinh hoàn Tại túi tinh, vi khuẩn gây độc cho tinh trùng, làm giảm số lượng tinh trùng, đời sống tinh trùng ngắn lại, chất lượng giảm xuống Đây lý gây vơ sinh nam Tuy nhiên, C.trachomatis lây qua đường tình dục nên nam giới nhiễm bệnh không phát điều trị nguồn tái nhiễm cho bạn tình Ngồi ra, số nghiên cứu cho thấy C.trachomatis nam giới có khả bám vào tinh trùng theo tinh trùng qua cổ tử cung lên ống dẫn trứng, giúp phát tán C.trachomatis vòi trứng phụ nữ 1.2 Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis [32] 1.2.1 Nuôi cấy Để phát C.trachomatis, người ta dùng biện pháp ni cấy để chờ vi khuẩn gia tăng số lượng C.trachomatis không phát triển ngồi tế bào sống nên khơng thể ni cấy theo phương pháp thường dùng mà phải tiến hành nuôi cấy tế bào McCoy Hela 229, tế bào thai - Đối với bệnh mắt hột, người ta lấy nang cách nạo nang cấy vào tế bào thai người để phát hạt vùi nguyên sinh chất tế bào - Đối với bệnh viêm sinh dục– tiết niệu: lấy mủ chất tiết niệu đạo (nam giới); chất tiết cổ tử cung, âm đạo (nữ giới) nuôi cấy mơi trường có chứa tế bào McCoy Hela 229 370C- 5% CO2 Quan sát tính chất xâm nhiễm sau 48 nuôi cấy và phát hiện C.trachomatis kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang: ủ với kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu cho kháng nguyên vỏ lipopolysaccharide (LPS) protein màng (major outer membrane protein- MOMP) Xét nghiệm đánh giá tiêu chuẩn vàng nhóm xét nghiệm có độ đặc hiệu cao (100%), cho phép lưu giữ vi khuẩn làm kháng sinh đồ phát chủng kháng thuốc Nhược điểm phương pháp đòi hỏi thời gian dài, phải bảo đảm vi khuẩn sống trình vận chuyển đến phịng thí nghiệm, đội ngũ cán thành thạo nuôi cấy tế bào Bên cạnh xét nghiệm có độ nhạy thấp (70-85%), thấp so với khuếch đại nucleic acid (nucleic acid amplification tests– NAATs) [32] 1.2.2 Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (enzyme immunoassays– EIAs) Phương pháp dựa phản ứng hóa miễn dịch giúp phát kháng nguyên LPS C.trachomatis kháng thể đơn dòng đa dòng đánh dấu enzyme, phức hợp kháng nguyên - kháng thể hoạt hóa enzyme chuyển chất khơng màu thành có màu, phát phản ứng tạo màu hay đo quang phổ kế Khi mẫu xét nghiệm thêm vào màng, kháng nguyên C.trachomatis gắn với kháng thể phủ sẵn màng Sau bổ sung kháng thể đặc hiệu với C.trachomatis liên kết với kháng nguyên bắt giữ kháng thể màng Dung dịch enzyme thêm vào liên kết với kháng thể đặc hiệu C.trachomatis Bước rửa để loại bỏ thành phần không gắn với màng Bổ sung chất đặc hiệu với enzyme vào màng Nếu có kháng nguyên, chất phản ứng với enzyme tạo thay đổi màu sắc phát đo máy quang phổ kế Xét nghiệm có hiệu với quy mơ sàng lọc lớn, khơng địi hỏi vi khuẩn cịn sống, rẻ tiền nuôi cấy yêu cầu kỹ xét nghiệm vừa phải Tuy có nhược điểm không sử dụng với nhiều loại mẫu lấy từ đại tràng, quan hô hấp âm đạo giảm độ nhạy độ đặc hiệu với mẫu này, sử dụng sàng lọc quần thể có tỷ lệ dương tính thấp (≤ 5%) [32] Xét nghiệm có độ nhạy thấp NAATs độ đặc hiệu thấp nuôi cấy tế bào 1.2.3 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp (direct fluorescent antibody- DFA) Phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng hay đa dòng đặc hiệu đánh dấu huỳnh quang để phát trực tiếp kháng nguyên vỏ LPS hay kháng nguyên mã hóa protein màng MOMP Mẫu bệnh phẩm thu thập, mẫu đánh dấu tên địa bệnh nhân Sau đó, mẫu phết nhẹ nhàng lên lam kính cố định methanol Sau làm khơ khơng khí từ đến phút, lam kính vận chuyển đến phịng thí nghiệm, nhuộm bằng kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu với C.trachomatis Kháng thể liên kết đặc hiệu với C.trachomatis có mẫu Tiếp bước rửa để loại bỏ kháng thể không liên kết Quan sát kính hiển vi huỳnh quang, mẫu dương tính C.trachomatis dạng màu xanh táo tương phản với màu đỏ đất tế bào Xét nghiệm áp dụng cho nhiều loại mẫu khác nhau, không yêu cầu vi khuẩn sống, đòi hỏi kỹ xét nghiệm vừa phải, thích hợp chẩn đốn đối tượng có nguy cao Sự thành cơng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Có kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu với C.trachomatis, đủ kháng thể để kết hợp, kính hiển vi huỳnh quang chất lượng tốt Kỹ thuật không thích hợp cho số lượng mẫu lớn đối tượng có nguy thấp, độ nhạy thấp NAATs độ đặc hiệu thấp nuôi cấy tế bào [32] 1.2.4 Kỹ thuật khuếch đại nucleic acid (nucleic acid amplification tests– NAATs) NAATs kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng rộng rãi y học để phát tồn vi sinh vật mẫu bệnh phẩm, độ nhạy 90%, độ đặc hiệu tương đương với nuôi cấy tế bào Kỹ thuật NAATs có ưu điểm là có thể áp dụng ở những nơi khơng có khả ni cấy, xét nghiệm khơng địi hỏi vi khuẩn cịn sống, thời gian xét nghiệm ngắn (trong ngày) Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction– PCR) xét nghiệm có độ nhạy độ đặc hiệu cao thích hợp cho phát C.trachomatis [21] Nhiều nghiên cứu xem PCR tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị xét nghiệm chẩn đoán khác Đối với bệnh nhiễm C.trachomatis, xét nghiệm cho phép xác định tồn vi khuẩn dịch quết cổ tử cung hoặc mẫu nước tiểu bệnh nhân với cặp mồi plasmid, gen mã hóa protein màng rRNA Tuy nhiên, xét nghiệm giảm độ nhạy có mặt chất ức chế có mẫu khơng đủ độ nhạy để phát mẫu chứa dạng vi khuẩn C trachomatis Do tạo sản phẩm âm tính giả Theo Saiki cộng (1985) [23], để phát 25 ng DNA gel agarose nhuộm ethidium bromide sau 35 chu kỳ khuếch đại từ 10 phân tử ban đầu mẫu cần hiệu khuếch đại cao 90% Nested PCR kỹ thuật sử dụng hai cặp mồi thay cặp mồi kỹ thuật PCR cổ điển Cặp mồi thứ hai thiết kế nằm đoạn gen mà cặp mồi thứ khuếch đại Quá trình chạy PCR lần đầu khơng khác PCR thơng thường Sản phẩm phản ứng PCR lần đầu làm khuôn cho phản ứng PCR lần thứ hai với cặp mồi thứ hai Kết sau hai lần PCR thu sản phẩm đặc hiệu nhiều Kỹ thuật có độ nhạy cao, phát vi khuẩn mật độ thấp mà phương pháp thơng thường khó phát (1-5 ký sinh trùng/1 µl máu) Đây xem “tiêu chuẩn vàng” phát vi khuẩn mẫu bệnh phẩm độ nhạy độ đặc hiệu cao Theo Pamela Cribb cộng (2002) [22], xét nghiệm phát DNA tương ứng với nhỏ 10 dạng (EB) vi khuẩn C.trachomatis hỗn hợp phản ứng, cho phép phát kết âm tính giả đáp ứng với thay đổi phịng thí nghiệm khác Mẫu xử lý để tách DNA C.trachomatis Các thành phần phản ứng PCR thiết lập gồm primer, dNTP, Taq polimerase, MgCl Các primer liên kết với DNA đích đặc hiệu C.trachomatis Enzym Taq polymerase kéo dài trình tự DNA sử dụng nucleotide tự để tạo trình tự DNA bổ sung Quá trình khuếch đại xảy hỗn hợp phản ứng ủ máy luân nhiệt Mỗi chu kỳ làm tăng số lượng DNA đích theo hàm mũ Sau khuếch đại, sản phẩm lần sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR lần Sau phản ứng PCR lần 2, sản phẩm điện di gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide và phân tích hệ thống chụp ảnh gel Xét nghiệm phát vi khuẩn C.trachomatis mẫu nước tiểu (độ nhạy mẫu thấp mẫu dịch phết), nhiều loại mẫu lấy từ đại tràng, quan hô hấp âm đạo Xét nghiệm độ nhạy 90%, độ đặc hiệu tương đương với nuôi cấy tế bào, có ưu điểm là có thể áp dụng ở những nơi khơng có khả ni cấy, khơng địi hỏi vi khuẩn cịn sống, thời gian xét nghiệm ngắn (trong ngày) [13, 17] Nhược điểm xét nghiệm yếu tố ngoại nhiễm cao, tránh cách sử dụng đầu lọc dùng enzyme uracil- N- glycosylase phản ứng 1.3 Các nghiên cứu Chlamydia trachomatis giới nước 1.3.1 Các nghiên cứu giới Số người nhiễm 100.000 Năm Hình 1.3 Tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis số nước Châu Âu Theo ECDC năm 2009 [15], tỷ lệ dương tính C.trachomatis số nước Châu Âu thay đổi từ năm 1998 đến năm 2007 Ở Thụy Điển Phần Lan, nơi nghiên cứu tiến hành từ đầu năm 90, tỷ lệ giảm đầu năm 90 (tương tự với tỷ lệ bệnh lây truyền qua đường tình dục khác Châu Âu) thay đổi thói quen sinh hoạt tình dục mối lo từ hiểm họa AIDS Tỷ lệ tăng lên từ năm 1995 Tại Anh Đan Mạch, tỷ lệ tăng dần theo năm, nguyên nhân không nghiên cứu từ đầu năm 90, sử dụng chẩn đốn có độ nhạy cao hơn, đối tượng nghiên cứu nằm nhóm có nguy cao Theo nghiên cứu tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Châu Âu [20] cho thấy: 10 ... tài ? ?Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung Chlamydia trachomatis Bệnh viện Đại học Y Thái Bình? ?? với mục tiêu: - Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật thực phản ứng PCR phát... soi cổ tử cung Nghiên cứu cho th? ?y khơng có khác biệt phụ nữ có dịch phết cổ tử cung bình thường bất thường Bệnh phẩm dịch phết cổ tử cung sử dụng để ni c? ?y Tỷ lệ dương tính C .trachomatis 12% Nghiên. .. phát vi khuẩn Chlamydia trachomatis - Xác định tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis bệnh nhân viêm âm đạo, cổ tử cung Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Chlamydia trachomatis Chlamydia trachomatis