Nghiên cứu được tiến hành nhằm phát triển phương pháp multiplex PCR phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn Chlamydia trachomatis. Các mẫu bệnh được khảo sát là của các bệnh nhân tới khám chữa bệnh tại bệnh viện Phụ sản Bắc Giang từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2011,... Mời các bạn cùng tham khảo.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX - PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN CHLAMYDIA TRACHOMATIS Nguyễn Ngọc Chỉnh1, Phạm Đăng Bảng2, Trần Hậu Khang2, Đặng Xuân Nghiêm1 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 2Trường Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu tiến hành nhằm phát triển phương pháp multiplex PCR phát nhanh xác vi khuẩn Chlamydia trachomatis Các mẫu bệnh khảo sát bệnh nhân tới khám chữa bệnh bệnh viện Phụ sản Bắc Giang từ tháng đến tháng năm 2011 Điều kiện tối ưu phản ứng PCR nhằm phát đoạn DNA đặc thù Chlamydia trachomatis cặp mồi CtP, CtM, CtR, NO, Chlamp cặp mồi đối chứng dương AR, khảo sát cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu cặp mồi nằm khoảng từ 53oC đến 57oC Đồng thời, điều kiện tối ưu cho phản ứng Multiplex PCR với cặp mồi: CtP, NO, Chlamp AR xác định 56oC Kết khảo sát tỷ lệ nhiễm bệnh bệnh nhân đến khám phụ khoa bệnh viện Phụ sản Bắc Giang cho thấy có 31 mẫu dương tính số 251 mẫu nghiên cứu, chiếm 12,35% Từ khóa: chẩn đốn nhanh, Chlamydia trachomatis, Multiplex PCR I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh nhiễm khuẩn đường sinh dục vi phương pháp có độ xác cao Ratti khuẩn Chlamydia trachomatis (C trachomatis) cộng (1991) dùng cặp mồi Chlamp để xác định vi khuẩn C trachomatis [2] Năm 1993, bệnh phổ biến toàn Thế giới có mức độ lây nhiễm cao Theo Tổ chức Y tế Thế giới, Roosendaal cộng so sánh độ nhạy phương pháp chuẩn đoán PCR, sử năm có khoảng 90 triệu người mắc bệnh nhiễm vi khuẩn Nhiễm C trachomatis dụng cặp mồi AR, CtM, CtR, CtP để xác định vi khuẩn C.trachomatis [3] Đến năm nguyên nhân gây viêm vùng chậu, với khoảng 80% nữ giới 70% nam giới nhiễm 2006, Viroj cộng dùng cặp mồi C trachomatis không biểu triệu chứng, NLO để xác định mẫu bệnh [1] Mục tiêu nghiên cứu nhằm khảo nghiệm, tối ưu hóa việc nguyên nhân bệnh lây bệnh cộng đồng [1] Vi khuẩn C trachomatis vi khuẩn ứng dụng cặp mồi công bố để phát vi khuẩn C trachomatis phương pháp kí sinh nội bào, bệnh biểu bên ngồi nên cần có biện pháp phát nhanh vi PCR; phát triển phương pháp multiplex PCR phát vi khuẩn C trachomatis xác định khuẩn để có biện pháp chữa kịp thời tránh gây tỷ lệ nhiễm C trachomatis Bắc Giang biến chứng cho bệnh nhân Việc sử dụng cặp mồi nghiên cứu công bố phương pháp multiplex PCR giới để phát triển thành kít phát vi khuẩn C trachomatis bệnh nhân Địa liên hệ: Đặng Xuân Nghiêm, khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Email: dxnghiem@hua.edu.vn Ngày nhận: 12/01/2013 Ngày chấp thuận: 20/6/2013 TCNCYH 83 (3) - 2013 II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng 20 mẫu DNA vi khuẩn C trachomatis thu thập tách chiết Bệnh viện Da liễu Trung Ương sử dụng để tối ưu hóa phản ứng PCR, 251 mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nữ đến khám phụ khoa bệnh viện Phụ sản Bắc Giang tình nguyện tham gia 27 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nghiên cứu từ ngày 15/03/2011 đến ngày vortex 30 giây, ủ 10 phút nhiệt độ phòng 13/05/2011 Sau đó, 200µl chloroform thêm vào trộn cho toàn dung dịch ống Phương pháp 2.1 Phương pháp thu thập mẫu eppendorf chuyển thành màu trắng đục, hỗn hợp ly tâm 4oC, 13000 vòng/phút Mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nữ tham gia nghiên cứu thu thập qua hai 10 phút Dịch chuyển vào ống eppendorf có sẵn 600µl isopropanol lạnh, dạng: nước tiểu mẫu quệt cổ tử cung Mẫu bảo quản ống eppendorf có trộn ủ -20oC 30 phút DNA thu đệm PBS (Phosphate-buffered saline) ly tâm 14000 vòng/phút 15 phút 4oC cách ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút rửa 900µl ethanol 70%, để khơ để thu tế bào mẫu bệnh Sau ethanol nhiệt độ phòng hòa tan 50µl dung dịch đệm TE 10mM, pH Mẫu tế bào rửa đệm PBS bảo quản - 20oC DNA bảo quản - 20oC [4] Phương pháp sử dụng proteinase K 2.2 Phương pháp tách chiết DNA Phương pháp sử dụng Trizol: 200 µl mẫu trộn với 900 µl dung dịch Trizol pH 8, phương pháp đun sôi tiến hành theo nghiên cứu Jenab cộng (2010) [5] 2.3 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR, Multiplex PCR Bảng Các mồi sử dụng nghiên cứu Vị trí đoạn gen nhân Tên mồi Kích thước (bp) Trình tự mồi (5’ – 3’) Chlamp - CCAAAGCTATTCAAAATCGGAGCTCTAAGA Chlamp - GTCTTCTGCTTACAATGCTCTTGCATATTA 610 - 612 Nhiễm sắc thể vi khuẩn NLO ATGAAAAAACTCTTGAAATCG NRO CTCAACTGTAACTGCGTATTT AR1 GGCGGTGACGGAGCTGGGGCG AR2 CGCCGCTGCACTGTGAAGCTC CtP1 TAGTAACTGCCACTTCATCA CtP2 TTCCCCTTGTAATTCGTTGC CtM1 GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCCTC 1128 DNA người 153 Plasmid Gen MOMP NST vi khuẩn 201 129 CtM2 CCAAGTGGTGCAAGGATCGCA CtR1 GTGGATAGTCTCAACCCTAT CtR2 CCCTAAGTGTTGGCAACTAA Riboxơm 28 310 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Để đánh giá độ nhạy tiềm xác định 2.4 Khảo sát tỷ lệ nhiễm bệnh Bắc Giang mẫu bệnh phẩm có nhiễm vi khuẩn C tracho- Nghiên cứu tiến hành khảo sát 251 mẫu bệnh thu thập bệnh viện Phụ sản Bắc matis phản ứng PCR, cặp mồi nghiên cứu cặp mồi đối chứng dương sử dụng (bảng 1) Mỗi cặp mồi nhân đoạn DNA khác vi khuẩn C trachomatis, ngoại trừ cặp AR đối chứng dương phản ứng PCR, nhân trình tự HLA người - đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên bạch cầu HLA lớp tế bào người Trong Giang Các mẫu bệnh tách chiết DNA chạy multiplex PCR Nếu phản ứng multiplex PCR dương tính mẫu bệnh có chứa vi khuẩn C trachomatis, không phản ứng mẫu bệnh kết luận không chứa vi khuẩn gây bệnh III KẾT QUẢ xét nghiệm, đoạn DNA sản phẩm cặp mồi AR phải nhân lên để xác định DNA tách từ mẫu bệnh phẩm thành công Đồng thời, DNA khuôn tách chiết từ mẫu người biết chắn mang bệnh không mắc bệnh chạy đối chứng dương âm tương ứng Cặp mồi Chlamp, NO nhân đoạn DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn [6; 7], cặp mồi CtP nhân đoạn DNA plamid 7,5 kb phổ biến, Kết tách chiết DNA từ mẫu bệnh DNA tổng số mẫu bệnh tách chiết theo phương pháp khác nhau: phương pháp sử dụng Trizol, phương pháp sử dụng protein K phương pháp đun sôi Nồng độ chất lượng DNA tổng số kiểm tra máy đo quang phổ hấp thụ điện di Kết nhiều thí nghiệm lặp lại cho thấy phương pháp sử dụng Trizol cho chất lượng CtR nhân đoạn DNA gen mã hóa riboxơm số lượng DNA tốt Ngoài ra, mẫu bệnh phẩm tế bào thu từ ly tâm nước tiểu cho kết 16S, cặp mồi CtM nhân đoạn DNA không biến tách chiết so với mẫu dịch tiết đổi gen mã hóa protein màng tế bào cổ tử cung Độ nhạy xét nghiệm bệnh phẩm nước tiểu thấp nhiều so với vi khuẩn C trachomatis [3] bệnh phẩm mẫu quệt cổ tử cung Thành phần PCR: PCR buffer (50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris - HCl pH = 8,3); 200 µM loại dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP); 50 pmol cho mồi U Taq polymerase Trong phản ứng Multiplex PCR, để phản ứng tối ưu, phản ứng Multiplex PCR có 200 µM loại dNTP, 1,5 mM MgCl2 Kết kiểm nghiệm điều kiện tối ưu để chạy cặp mồi Mỗi cặp mồi nghiên cứu nhân đoạn DNA khác có kích thước khác Qua khảo sát với DNA khuôn từ mẫu bệnh đối chứng dương tách chiết kít chuẩn IVA pDNA Extraction Kit - Code VA.A92- 50 pmol cho mồi Chu trình nhiệt: 95oC 002A, điều kiện khác thành phần phút, 95oC phút, 50 - 60oC phút, 72oC Mg2+, hàm lượng dNTP, thời gian bắt cặp o 1,5 phút, lặp lại 35 chu kỳ, kết thúc 72 C cặp mồi cho ta thấy kết khác 10 phút Sản phẩm PCR điện di gel khơng có ý nghĩa Tuy nhiên, hình agarose 2,5% cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu cặp mồi khác TCNCYH 83 (3) - 2013 29 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình Sản phẩm PCR cặp mồi nghiên cứu Nhiệt độ tối ưu cho cặp mồi kích thước sản phẩm PCR, phản ứng nghiên cứu lựa chọn dựa theo nghiên cứu Ratti cộng (1991), Roosen- multiplex PCR tiến hành xây dựng để phát nhanh xác vi khuẩn C daal cộng (1993), Viroj cộng (2006) Trong nghiên cứu này, nhiệt độ tối ưu trachomatis cặp mồi, AR, CtP, Chlamp NO, có nhiệt độ gắn mồi gần giống được xác định lại riêng cho cặp mồi sau: cặp mồi AR, NO, CtR, CtM có nhiệt chọn để chạy phản ứng multiplex PCR Nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR độ gắn mồi tối ưu 55oC, cặp mồi Chlamp có khảo sát lại dải nhiệt độ từ 47oC tới 56oC nhiệt độ gắn mồi tối ưu 53oC cặp mồi CtP có nhiệt độ gắn mồi tốt 57oC Như kết thể hình vậy, nhân tố nhiệt độ bắt cặp ảnh hưởng mạnh tới kết phản ứng PCR Hình cho thấy, ngoại trừ mồi AR, cặp mồi nghiên cứu nhạy cho sản phẩm rõ nét, kích thước Sản phẩm PCR cặp mồi khẳng định DNA C trachomatis việc cắt enzyme giới hạn thích hợp giải trình tự Việc khảo sát thực nhằm tìm cặp mồi tốt nhất, có nhiệt đội gắn mồi tối ưu gần giống để dùng phản ứng multiplex PCR Kết multiplex PCR Dựa vào kết khảo sát nhiệt độ gắn mồi 30 Hình Sản phẩm phản ứng Multiplex PCR với cặp mồi: AR, CtP, Chlamp NO M: Thang DNA 100 bp; 1: 47oC; 2: 50oC; 3: 53oC; 4: 56oC TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Nhiệt độ gắn mồi tốt cho phản ứng o Multiplex PCR 56 C Kết khảo sát mẫu bệnh từ bệnh viện Phụ sản Bắc Giang Trong nghiên cứu này, có 251 mẫu bệnh phẩm bệnh nhân thu thập Căn vào nhóm tuổi, tình trạng nhân, q qn nghề nghiệp, bệnh nhân phân nhiều nhóm nhỏ khác khác theo đặc điểm Đáng ngạc nhiên phản ứng multiplex PCR với mẫu nghiên cứu cho sản phẩm đầy đủ cặp mồi thành phần với độ nét cao khơng có sản phẩm ngồi DNA cặp mồi AR nhân lên Kết có khác biệt với công bố Roosendaal cộng (1993) cặp mồi CtP có độ nhạy cao cặp mồi khác Kết phản ứng multiplex PCR phát 31 mẫu tổng số 251 mẫu bệnh phẩm bệnh nhân tham gia nghiên cứu có kết dương tính, chiếm 12,35% Hình Tỷ lệ bệnh nhân dương tính với phản ứng Multiplex PCR theo lứa tuổi, nơi sống, tình trạng nhân nghề nghiệp TCNCYH 83 (3) - 2013 31 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC IV BÀN LUẬN Phát triển phản ứng multiplex PCR Hiện nay, phương pháp nuôi cấy vi khuẩn C trachomatis tế bào nuôi chọn AR, CtP, Chlamp NO Hai cặp mồi CtM CtR khảo sát thêm vào hỗn hợp mồi cho phản ứng multiplex PCR chúng cho băng điện di không rõ nét phản ứng nên không sử dụng cho xác tiêu chuẩn vàng chẩn đoán C nghiên cứu Sản phẩm nhân lên đoạn DNA nằm plasmid nhiễm sắc thể trachomatis Tuy nhiên, việc phải vận chuyển vi khuẩn C trachomatis mồi CtP, Chlamp, bệnh phẩm tới phòng thí nghiệm đủ tiêu No nhân lên có kích thước theo thứ tự là: 610 - 612 bp, 1128 bp, 201 bp Mồi AR nhân lên cấy phương pháp cho kết chuẩn chi phí cao cho q trình nuôi cấy nhược điểm phương pháp [7] Phương pháp phát kháng nguyên đoạn DNA người có kích thước 153 bp Do sản phẩm xác thực Immunofluorescence (DIF)) miễn dịch gắn nói việc giải trình tự cắt enzyme giới hạn thích hợp nên kết luận men (Enzyme - Immunoassays (EIA)) phản ứng multiplex PCR giúp phát phương pháp xét nghiệm sử dụng rộng rãi mà không cần nuôi cấy C tracho- nhanh nhiễm vi khuẩn C trachomatis cách xác áp dụng để tiến hành matis Gần đây, kỹ thuật lai DNA khảo sát bệnh nhân tham gia nghiên cứu miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (Direct giới thiệu Tuy nhiên, so sánh với phương pháp khác điều kiện tối ưu, Tỷ lệ nhiễm bệnh bệnh nhân tham gia nghiên cứu Bắc Giang phương pháp xét nghiệm có độ nhạy Để giảm thiểu sai sót kỹ thuật xảy thấp Hơn nữa, kỹ thuật DIF kỹ thuật chuẩn đoán phản ứng PCR với cặp mồi đơn lẻ để tiết kiệm thời gian khó, đòi hỏi kinh nghiệm cao, EIA đặc hiệu, việc phát kháng nguyên thường xảy phản phản ứng chéo [8] hóa chất xét nghiệm, phản ứng multiplex PCR với mồi DNA khuôn tách Phương pháp multiplex - PCR phương chiết trizol kể sử dụng để phát pháp có độ nhạy độ tin cậy cao việc vi khuẩn C Trachomatis mẫu bệnh phẩm tình nguyện viên Bắc Giang, phát xác vi khuẩn C trachomatis mẫu bệnh phẩm kết xét nghiệm phụ thuộc vào loại mẫu bệnh phẩm cách xử lý mẫu Theo tác giả Vũ số bệnh nhân dương tính cao so với nghiên cứu tác giả nước Theo Tuấn Anh (2003), mẫu nước tiểu có nghiên cứu Nguyễn Thị Thanh Huyền năm 2002, tỷ lệ nhiễm C trachomatis phụ vi khuẩn Chlamydia trachomatis mẫu nữ có hội chứng tiết dịch âm đạo 10,5% DNA tách chiết từ mẫu bệnh nước tiểu có [10] Năm 2002, Nguyễn Thị Ngọc Yến Trần Hậu Khang nhận thấy tỷ lệ nhiễm C nồng độ DNA thấp khơng có chứa DNA [9] Trong nghiên cứu này, mẫu bệnh phẩm nước tiểu có kết tách chiết DNA so với mẫu dịch tiết cổ tử cung Điều phù hợp với nghiên cứu Vũ Tuấn trachomatis số bệnh nhân mang bệnh lây truyền qua đường sinh dục viện Da liễu Quốc gia 9,5% [6] Nguyên nhân tỷ lệ nhiễm C trachomatis nghiên cứu cao Anh Nhiệt độ 56oC tối ưu cho sản phẩm nghiên cứu trước giải thích PCR rõ với cặp mồi lựa đa số bệnh nhân Bắc Giang có 32 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC biểu bệnh tới sở khám chữa Địa bàn sinh sống: Bệnh nhiễm khuẩn bệnh để khám điều trị Đây thói quen khơng tốt gây tốn cho điều trị gây đường tình dục vi khuẩn C trachomatis nhiều di chứng sau Nhóm tuổi: Tuổi yếu tố quan trọng tới nghiệp nhiều nông thôn: Khu vực sống bệnh vi khuẩn C trachomatis Bệnh lây nhiễm mạnh độ tuổi sinh hoạt tình dục hẳn so với tỷ lệ nhiễm bệnh huyện lẻ thường gặp vùng thành thị, trung tâm cơng thành phố có tỷ lệ nhiễm 16,5% cao tỉnh nhiều Độ tuổi khác quốc gia, vùng khác Trong nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh cao thuộc V KẾT LUẬN Phương pháp sử dụng Trizol cho lượng lứa tuổi 25 - 35 với tỷ lệ 15,2% sau độ tuổi 25 với tỷ lệ 10,9% Số liệu cho sản phẩm DNA không bị đứt gãy nồng độ thấy phụ nữ trẻ tuổi có tỷ lệ nhiễm bệnh cao Kucinskiene cộng (2006) tổng hợp nhau: cặp mồi AR, CtM, NO có nhiệt độ tối ưu nghiên cứu C trachomatis khoảng thời gian từ 1998 đến 2005 thấy tỷ lệ nhiễm C trachomatis cao phụ nữ trẻ tuổi, đặc biệt thiếu niên nữ cổ tử cung chưa phát triển hoàn chỉnh, dễ nhạy cảm với C trachomatis [11] Tình trạng nhân: Tình trạng nhân yếu tố nghiên cứu giới nhấn mạnh có liên quan đến tỷ lệ nhiễm C trachomatis Đối tượng phụ nữ độc thân có nguy nhiễm C trachomatis cao gấp 3,6 lần so với nhóm có gia đình Còn nghiên cứu Romoren Botswana đối tượng phụ nữ có thai thấy phụ nữ độc thân có nguy nhiễm C trachomatis cao gấp tới 6,9 lần so với phụ nữ có gia đình [2] Trong nghiên cứu này, nhóm bệnh nhân độc thân có tỷ lệ nhiễm C trachomatis 15,9%, cao nhóm bệnh nhân có gia đình Nghề nghiệp: Nhóm cơng nhân nhóm có tỷ lệ nhiễm bệnh cao với 19,4%, tiếp sau cao Nhiệt độ tối ưu cặp mồi khác là: 55oC, cặp mồi CtR, Chlamp có nhiệt độ tối ưu là: 53oC, cặp mồi CtP có nhiệt độ tối ưu là: 57oC Phản ứng multiplex PCR với tổng số cặp mồi chọn, CtP, NO, Chlamp AR, với nhiệt độ tối ưu 56oC cho độ nhạy cao đồng Tại bệnh viện phụ sản Bắc Giang, có 31 mẫu tổng số 251 mẫu bệnh phẩm nghiên cứu dương tính với C trachomatis chiếm tỷ lệ 12,35% Tỷ lệ trung bình thành phố Bắc Giang cao huyện lẻ, đối tượng chưa có gia đình cao có gia đình độ tuổi < 30 có tỷ lệ nhiễm cao so với lứa tuổi khác TÀI LIỆU KHAM KHẢO Viroj, W (2006) PCR Test for Detection of Chlamydia trachomatis Using NLO and NRO Primers, a Re-evaluation, Sexuality and Disability 24 (4), 217 - 221 Ratti G., Moroni A., Cevenini R., nhóm nơng dân với 10,7% thấp nhóm học sinh, sinh viên Tỷ lệ bệnh nhân (1991) Detection of Chlamydia trachomatis mắc bệnh nhiễm C.trachomatis thuộc nhóm cơng nhân cao (19,4%) Kết using the polymerase chain reaction, J Clin lý giải lối sống tập trung Romoren M., Sundby J., Manonmany trình độ nhân thức cách phòng trừ, điều trị bệnh chưa cao V., et al (2007) Chlamydia and gonorrhoea in TCNCYH 83 (3) - 2013 DNA in patients with non-gonococcal urethritis Pathol 44(7), 564 - 568 pregnant Batswana women: time to discard 33 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC the syndromic approach, BMC Infectious Diseases 7, 27 Chomczynski P, Sacchi N., (1987) Single - step method of RNA isolation by acid Roosendaal, R., Walboomer,s J.M.M., Veltman, O.R., et al (1993) Comparison of different primer sets for detection of Chlamydia trachomatys by the polymerrase guanidinium thiocyanate - phenol-chloroform chain reaction, J Med Microbio1, 38, 426 - 433 extraction Anal Biochem, 162(1), 156 - 159 Vũ Tuấn Anh (2003) Tình hình, đặc điểm lâm sàng giá trị chẩn đoán PCR nhiễm Chlamydia trachomatis Jenab A., Roghanian R., Golbang N., et al (2010) Comparison of three methods of DNA extraction in endocervical specimens for Chlamydia trachomatis infection by spectrophotometry, agarose gel, and PCR, Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 58(3), 227 - 234 Nguyễn Thị Ngọc Yến, Trần Hậu Khang (2002) Điều trị nhiễm trùng đường sinh dục Chlamydia trachomatis Zithromax, Y học thực hành, 471(3), 27 - 29 đường sinh dục, Luận văn Thạc sỹ Y học,Học viện Quân Y 10 Nguyễn Thị Thanh Huyền (2002) Nghiên cứu tình hình nguyên nhân đặc điểm lâm sàng hội chứng tiết dịch đường sinh dục phụ nữ đến khám lại Viện Da liễu, Luận văn Thạc sỹ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội 11 Kucinskiene V., Sutaite I., Vali- Ridgway GL, Taylor-Robinson D, (1991) Current problems in microbiology: Chlamydia infections: which laboratory test J ukeviciene S et al (2006) Prevalence and risk factors of genital Chlamydia trachomatis Clin Pathol 44, - infection, Medicina (Kaunas), 42(10), 885 - Summarry OPTIMIZE MULTIPLEX-PCR CONDITIONS FOR QUICK AND RELIABLE DETECTION OF CHLAMYDIA TRACHOMATIS This study aimed at developing a multiplex-PCR for quick and reliable detection of Chlamydia trachomatis infection The optimal conditions of PCR reactions to detect specific DNA fragment of Chlamydia trachomatis with primer pairs CtP, CtM, CtR, NO, Chlamp, and positive control primers, AR, were investigated The results showed that the optimal annealing temperature of each primer-pairs ranged from 53oC to 57oC Besides, the optimal annealing temperature of the multiplex PCR reaction which includes AR, NO, CtP and Chlamp primers was identified as 56oC The rate of infection in gynecological patients in Bac Giang Hospital was 12.35%, as there are 31 positive samples in a total of 251 samples Keywords: quick diagnosis, Chlamydia trachomatis, Multiplex PCR 34 TCNCYH 83 (3) - 2013 ... tách Phương pháp multiplex - PCR phương chiết trizol kể sử dụng để phát pháp có độ nhạy độ tin cậy cao vi c vi khuẩn C Trachomatis mẫu bệnh phẩm tình nguyện vi n Bắc Giang, phát xác vi khuẩn C trachomatis. .. LUẬN Phát triển phản ứng multiplex PCR Hiện nay, phương pháp nuôi cấy vi khuẩn C trachomatis tế bào nuôi chọn AR, CtP, Chlamp NO Hai cặp mồi CtM CtR khảo sát thêm vào hỗn hợp mồi cho phản ứng multiplex. .. bệnh tách chiết DNA chạy multiplex PCR Nếu phản ứng multiplex PCR dương tính mẫu bệnh có chứa vi khuẩn C trachomatis, không phản ứng mẫu bệnh kết luận không chứa vi khuẩn gây bệnh III KẾT QUẢ