Sự có mặt của các loại vi khuẩn trong môi trường không khí, đất và nước là một trong những nguyên nhân chính gây ra các bệnh về đường hô hấp và các bệnh ngoài da cho con người và các loại vật nuôi. Do đó, việc phát hiện sớm các vi khuẩn quanh môi trường sống là yếu tố then chốt để ngăn chặn mối nguy hại phát sinh từ vi khuẩn. Trong nghiên cứu này, tác giả thiết kế và xây dựng một giấy lọc nhỏ có đường kính khoảng 0,5 cm được hấp phụ thêm luciferin và enzym luciferase. Giấy lọc này có khả năng định lượng được lượng vi khuẩn trong mẫu thông qua việc định lượng hàm lượng ATP có trong vi khuẩn. Quy trình chế tạo giấy lọc hấp phụ luciferase và luciferin đã được tối ưu hóa. Giấy lọc hấp phụ luciferase và luciferin cho thấy khả năng giữ ổn định luciferase và luciferin trong 30 ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng, và khả năng phát hiện nồng độ E. coli có thể lên tới 1,17x103 CFU/ml. Phương pháp phát hiện vi khuẩn qua việc định lượng hàm lượng ATP bằng giấy lọc hấp phụ luciferase và luciferin có thể giảm thời gian phát hiện vi khuẩn xuống còn 5 phút. Phương pháp xác định hàm lượng vi khuẩn bằng giấy lọc hấp phụ enzym luciferase và cơ chất luciferin là một phương pháp mới, triển vọng cao trong việc phát triển các cảm biến hóa sinh có độ chính xác cao và cho kết quả nhanh.
Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Phát vi khuẩn đĩa giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin Nguyễn Thị Dung* Trường Đại học Công nghệ, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngày nhận 15/10/2018; ngày chuyển phản biện 19/10/2018; ngày nhận phản biện 26/11/2018; ngày chấp nhận đăng 18/12/2018 Tóm tắt: Sự có mặt loại vi khuẩn mơi trường khơng khí, đất nước nguyên nhân gây bệnh đường hơ hấp bệnh ngồi da cho người loại vật nuôi Do đó, việc phát sớm vi khuẩn quanh mơi trường sống yếu tố then chốt để ngăn chặn mối nguy hại phát sinh từ vi khuẩn Trong nghiên cứu này, tác giả thiết kế xây dựng giấy lọc nhỏ có đường kính khoảng 0,5 cm hấp phụ thêm luciferin enzym luciferase Giấy lọc có khả định lượng lượng vi khuẩn mẫu thơng qua việc định lượng hàm lượng ATP có vi khuẩn Quy trình chế tạo giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin tối ưu hóa Giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin cho thấy khả giữ ổn định luciferase luciferin 30 ngày điều kiện nhiệt độ phòng, khả phát nồng độ E coli lên tới 1,17x103 CFU/ml Phương pháp phát vi khuẩn qua việc định lượng hàm lượng ATP giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin giảm thời gian phát vi khuẩn xuống phút Phương pháp xác định hàm lượng vi khuẩn giấy lọc hấp phụ enzym luciferase chất luciferin phương pháp mới, triển vọng cao việc phát triển cảm biến hóa sinh có độ xác cao cho kết nhanh Từ khóa: ATP, cảm biến điện hóa, giấy lọc, luciferase, luciferin, vi khuẩn Chỉ số phân loại: 2.7 Mở đầu Các vi sinh vật vi khuẩn, virus, nấm tiềm ẩn nhiều nguy gây bệnh cho cộng đồng khả phát tán mạnh mẽ qua môi trường đất, nước, khơng khí [1, 2] Con người gặp nhiều khó khăn để chống lại lây lan vi sinh vật chúng bùng phát thành dịch bệnh Vì chúng có kích thước nhỏ nên dễ dàng di chuyển phát tán phạm vi rộng lớn nhờ dòng dịch chuyển khơng khí, gió, nước Chúng thâm nhập vào thể người lây lan qua q trình hơ hấp, tiết; từ gây đại dịch phạm vi rộng lớn [3, 4] Chính nguy tiềm ẩn nên việc phát vi sinh vật thời gian thực, cho kết xác vơ cần thiết Hiện có vài phương pháp truyền thống dùng để phát vi khuẩn môi trường phương pháp nuôi cấy [5, 6], phương pháp sinh hóa, phương pháp vi điện tử [7, 8], phương pháp xét nghiệm miễn dịch [9], PCR [10, 11]… Tuy nhiên, việc phát vi khuẩn thời gian thực gặp nhiều khó khăn bước tiến hành thí nghiệm phức tạp giá thành cao [1] Cụ thể như, phương pháp nuôi cấy vi khuẩn tốn vài ngày để vi khuẩn lớn hình thành khuẩn lạc để đếm mắt thường [12, 13] Hơn nữa, với phương pháp này, có lượng nhỏ vi khuẩn (khoảng 10%) ni cấy [14], phần lớn lại khơng thể ni cấy [2] Một phương pháp phân tích khác cho độ xác cao PCR [15, 16] phương pháp tốn vài để thực hiện, u cầu quy trình cơng nghệ phức tạp buộc phải tiến hành chuyên gia [1] Gần đây, phương pháp phát vi sinh vật thông qua việc xác định lượng ATP phản ứng phát xạ ATP luciferin/luciferase nhiều nhà khoa học quan tâm [12, 17] Trong phản ứng phát xạ luciferin/luciferase, luciferin phản ứng với ATP xúc tác enzym luciferase để tạo oxyluciferin, adenosine monophosphate, ánh sáng Ánh sáng phát xạ có bước sóng từ 550 đến 570 nm đo lại máy đo quang [18] Từ tín hiệu cường độ sáng phát xạ đo ta tính tốn lượng ATP tương ứng tham gia phản ứng lượng vi khuẩn tương ứng có mẫu thủy phân lượng ATP Tuy nhiên, phương pháp có nhiều hạn chế, hoạt độ enzym luciferase bị giảm nhanh chóng điều kiện phòng dung dịch phản ứng chứa luciferin luciferase thường tốn thời gian để chuẩn bị Vậy nên việc phát vi sinh vật theo thời gian thực với bước tiến hành đơn giản, giá thành thấp thách thức lớn Trong nghiên cứu này, đề xuất giải pháp đo lượng vi khuẩn thời gian thực sử dụng giấy lọc tối ưu hóa trình hấp phụ hỗn hợp luciferase luciferin lên bề mặt Phương pháp giảm thời gian phát hiện, tăng thời gian hoạt hóa enzym luciferase điều kiện nhiệt độ phòng Giấy lọc sau hấp phụ enzym luciferase chất luciferin, bảo quản điều kiện nhiệt độ phòng sử dụng trực tiếp khơng cần qua bước tiền xử lý Khả phân tích giấy lọc với Escherichia coli (E coli) theo thời gian bảo quản khảo sát Email: dung.nguyenthi.tunhien@gmail.com ∗ 61(6) 6.2019 66 Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Detection of bacteria by adsorption of luciferase and luciferin in paper discs Thi Dung Nguyen* University of Engineering and Technology, Hanoi VNU Received 15 October 2018; accepted 18 December 2018 Abstract: Ánh sáng phát từ phản ứng ATP luciferin/luciferase đo cường ánh sáng máy luminometer (spectramax-M2, Molecular devices corp., Sunnyvale, CA, USA) Dung dịch dinh dưỡng agar dinh dưỡng mua từ Becton & Dickinon, Co (Franklin Lakes, NJ, USA) Nuôi cấy vi khuẩn Với q trình tiền ni cấy, khuẩn lạc E coli từ đĩa thạch nuôi cấy lấy nhân nuôi dung dịch dinh dưỡng (5,0 g Peptone, 3.0 g protein lít nước cất) lắc qua đêm với tốc độ 150 vòng/phút nhiệt độ 37oC Sau đó, E coli ni cấy lần hai, dung dịch dinh dưỡng với tỷ lệ dung dịch chứa E coli dung dịch dinh dưỡng ban đầu dung dịch dinh dưỡng 1:100 E coli nuôi đến đạt nồng độ khoảng 108 CFU/ml thu hồi cách ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút 10 phút, sau rửa lần với nước, hòa tan lại với nước cất thể tích để thu dung dịch E coli loại bỏ hoàn toàn dung dịch dinh dưỡng There are numerous microbes in the air, soil, and water, which is one of the main cause of some respiratory diseases and external ailments in human and livestock Therefore, the early detection and identification of microorganisms is a key factor to prevent the risks associated with microbial infections In this study, paper discs (0.5 cm in diameter) was prepared with Tối ưu hóa q trình hấp phụ luciferase luciferin lên giấy the adsorption of luciferase and luciferin and used lọc to determine the adenosine triphosphate (ATP) in bacteria The repetition of sequential adsorption/drying Giấy lọc cắt thành hình tròn với đường kính khoảng 0,5 of the reaction solution (luciferase and luciferin) on the cm tiệt trùng Tiếp theo, dung dịch hỗn hợp luciferase paper discs was optimised The storage stability of the luciferin chuẩn bị nhỏ trực tiếp lên bề mặt giấy paper discs was about one month at room temperature Sau trình nhỏ dung dịch hỗn hợp luciferase luciferin, giấy after the preparation The paper discs adsorped with lọc làm khơ từ từ trong bình kín chứa silica đặt luciferase/luciferin could detect the ATP extracted from nhiệt độ phòng Q trình nhỏ hỗn hợp dung dịch làm khô Escherichia coli (E coli) as low as 1.17x103 CFU/ml ATP tự nhiên lặp lại vài lần Cuối cùng, giấy lọc sau evaluation using the paper discs for detection of bacteria hấp phụ luciferase luciferin lên bề mặt, làm khô may reduce the detection time to less than The tự nhiên bình chứa silica thêm 24 để loại bỏ hoàn novel paper discs immobilized with luciferase and toàn nước khỏi giấy lọc trước sử dụng Các giấy lọc luciferin are valuable for the development of fast and hấp phụ luciferase luciferin sau bảo quản bình luciferase ởluciferin sauphòng quảnsửtrong bình chứatrình silicachuẩn nhiệt sensitive sensors for early detection of microorganisms phụ chứa silica nhiệt độ cho bảo tới dụng Quy t i dụng Quy trìnhvà chuẩn bị giấy lọc hấpsơphụ bị giấycholọc hấpsửphụ luciferase luciferin đồluciferase hóa nhưvà Keywords: ATP, bacteria detection, biosensor, luciferase, độ phòng hình luciferin sơ đồ hóa hình luciferin, paper disc Classification number: 2.7 Luciferase/luciferin dung dịch 10 µl Ngun liệu phương pháp , Hóa chất vi khuẩn 1.trình Quychu trìnhẩnchuẩn bị lọc giấy lọcphụ hấpluciferase phụ luciferase luciferin Quy bị giấy hấp luciferin Chúng sử dụng luciferin, enzym luciferase, dung dịch đệm HìnhHình pH, dung dịch đệm thủy phân, chất chuẩn ATP chứa ĐoĐo cường độ ánh sáng sáng phát xạ xạ sử dụng giấy lọc hấp cường độ ánh phát sử dụng giấyphụ lọcluciferase hấp phụvà KIT “Roche ATP Bioluminescence Assay Kit HSII” (Sigmaluciferase luciferin Aldrich; Merch KGaA, Darmstadt, Đức) Hỗn hợp luciferin luciferin luciferase trộn lẫn theo tỷ lệ nồng độ Kit thêm vào Giấy luciferase luciferin từ quản bình bảo Giấy lọclọc hấphấp phụ phụ luciferase luciferin lấyđược từ lấy bìnhrabảo đặt 2,5 ml dung dịch đệm (có chứa sẵn ion Mg2+) Dung dịch hỗn hợp vào quản đặt vào đĩa 96 lỗ để đo cường độ ánh sáng Dung dịch đĩa 96 lỗ để đo cường độ ánh sáng Dung dịch E coli sau loạiE.bỏ luciferase luciferin vừa pha chia nhỏ làm nhiều phần, coli sau loại bỏ hoàn toàn dung dịch dinh dưỡng, đượco hoàn toàn dung ịdch dinh dưỡng, lấy 100 µl đem thủy phân nhiệt 95 C phần chứa 200 µl bảo quản lạnh nhiệt độ -20oC lấy 100 µl đem thủy phân nhiệt 95oC 10 phút Quá trình 10 phút.Quá trình thủy phân nhiệt giúp giải phóng ATP kh ỏi tế Giấy lọc sử dụng thí nghiệm giấy lọc cellulose thủy phân nhiệt giúp giải phóng ATP khỏi tế bào Sau Sau 50 µl dung dịch E coli sau thủy phân nhỏ lên bề mặt Whatman mua từ Cơng ty Sigma-Aldrich (Merck KGa A) bào.50 µl dung dịch E coli sau thủy phân nhỏ lên bề lọc hấp luciferin đãvàđược đặt bênđãtrong 96bên ỗ l Ngay sau giấyphụ lọcluciferase hấp phụvàluciferase luciferin đượcđĩađặt Giấy lọc cắt nhỏ thành đĩa tròn với đường kính 0,5 cm giấymặt dung dịch thủy phân E coli nhỏ vào giấy lọc, chúng chuyển đến máy đo cường độ ánh sáng đo cường độ ánh sáng phát xạ Đ ối với 61(6) 6.2019 thí nghiệm khảo sát khả phân tích giấy lọc qua thời gian, giấy lọc hấp phụ 67 luciferase luciferin chuẩn bị với số lượng lớn thời điểm, sau đem bảo quản bình chứa silica nhiệt độ thường Giấy lọc sau lấy khỏi bình bảo quản (sau 1, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 25, 30, 40, 50, bên lỗ trống số lượt hấp phụ tăng lên Hơn nữa, phân tử luciferase luciferin bề mặt giấy lọc dễ bị thay đổi cấu trúc khơng gian, dẫn đến enzym bị bất hoạt Do đó, thấy khơng có tăng cường độ ánh sáng phát Khoa học Kỹ thuật Công nghệ xạ sử dụng giấy lọc nhỏ/làm khơ lần (hình 2) Q trình hấp phụ luciferase luciferin lên giấy lọc tối ưu với lần hấp phụ, lần hấp phụ 10 µl dung dịch hỗn hợp luciferase luciferin Ở thí nghiệm tiếp theo, chúng tơi sử dụng giấy lọc hấp phụ dung dịch phản ứng đĩa 96 lỗ Ngay sau dung dịch thủy phân E coli nhỏ vào giấy lọc, chúng chuyển đến máy đo cường độ ánh sáng đo cường độ ánh sáng phát xạ Đối với thí nghiệm khảo sát khả phân tích giấy lọc qua thời gian, giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin chuẩn bị với số lượng lớn thời điểm, sau đem bảo quản bình chứa silica nhiệt độ thường Giấy lọc sau lấy khỏi bình bảo quản (sau 1, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 25, 30, 40, 50, 60 ngày) đo cường độ ánh xạ phát từ mẫu E coli có nồng độ tất lần đo Cường độ ánh sáng (LRU) luciferase luciferin với ba lần hấp phụ 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 lần lần lần Số lần hấp phụ (lần) Hình So sánh cường độ ánh sáng phát xạ sử dụng giấy lọc có số lần hấp phụ khác Hình So sánh cường độ ánh sáng phát xạ sử dụng giấy lọc có số Kết thảo luận lần hấp phụ khác Tối ưu hóa q trình hấp phụ luciferase luciferin lên giấy Đánh giá khả phát E coli giấy lọc hấp phụ Đánh giá khả phát E coli giấy lọc hấp phụ luciferase luciferase luciferin luciferin Để đạt kết tốt từ phép đo sử dụng giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin, khảo sát để tìm lượng dung dịch hỗn hợp luciferase luciferin tối ưu nhỏ lên giấy lọc số lần nhỏ/làm khô tối ưu Đầu tiên, xác định lượng hợp chất luciferase, luciferin cần hấp phụ lên giấy lọc tối ưu Sử dụng dung dịch hỗn hợp luciferase, luciferin chuẩn bị giấy lọc thơng dụng (kích thước lỗ 2,5 µm) dùng giá đỡ có lỗ trống nhỏ li ti chứa phân tử luciferase luciferin bên Để đảm bảo dung dịch hỗn hợp luciferase luciferin không bị tràn ngồi bề mặt giấy lọc, mà từ từ hấp phụ vào bên giấy lọc, lượng nhỏ (10 µl) dung dịch hỗn hợp luciferase, luciferin nhỏ lên giấy lọc để yên bình chứa silica Khảo sát số lần hấp phụ (nhỏ/làm khô) khác (1, 3, lần) lên giấy lọc khác để tìm số lần tối ưu Mỗi giấy lọc sau khảo sát với dung dịch chứa lượng E coli (~107CFU/ ml) thủy phân Hình biểu thị khác cường độ ánh sáng phát xạ thu sử dụng giấy lọc có số lần hấp phụ khác Theo đó, số lần hấp phụ lần, tương đương 30 µl dung dịch hỗn hợp luciferase luciferin, cho tín hiệu cường độ ánh sáng cao Khi 10 µl dung dịch hỗn hợp luciferase, luciferin nhỏ lên bề mặt giấy lọc, chúng từ từ di chuyển vào bên lỗ trống (2,5 µm) giấy lọc, bị giữ Do đó, cấu trúc khơng gian enzym luciferase chất luciferin đảm bảo, trì trạng thái hoạt động thời gian dài điều kiện nhiệt độ phòng Khi dung dịch hỗn hợp luciferase luciferin nhỏ lên bề mặt giấy lọc, vài phân tử luciferase luciferin không cố định lỗ trống giấy lọc mà tồn bề mặt giấy, chúng hạn chế hấp phụ luciferase, luciferin vào bên lỗ trống số lượt hấp phụ tăng lên Hơn nữa, phân tử luciferase luciferin bề mặt giấy lọc dễ bị thay đổi cấu trúc không gian, dẫn đến enzym bị bất hoạt Do đó, thấy khơng có tăng cường độ ánh sáng phát xạ sử dụng giấy lọc nhỏ/làm khô lần (hình 2) Quá trình hấp phụ luciferase luciferin lên giấy lọc tối ưu với lần hấp phụ, lần hấp phụ 10 µl dung dịch hỗn hợp luciferase luciferin Ở thí nghiệm tiếp theo, sử dụng giấy lọc hấp phụ dung dịch phản ứng luciferase luciferin với ba lần hấp phụ Sau trình tối ưu hóa hấp phụ luciferase luciferin, chúng tơi khảo sát khả phát vi khuẩn E coli nồng độ khác giấy lọc so sánh với kết thu từ việc sử dụng luciferase luciferin dạng dung dịch (theo quy trình thương mại hóa từ Kit Công ty SignmaAldrich) Bước đầu khảo sát mối tương quan hàm lượng ATP cường độ ánh sáng thu phương pháp đo quang cho thấy, nồng độ ATP tăng cường độ ánh sáng tăng trùng với kết luận Công ty Sigma Aldrich Từ đồ thị hình cho thấy, nồng độ vi khuẩn tăng cường độ ánh sáng phát xạ tăng Vậy nên, nồng độ vi khuẩn tăng lên hàm lượng ATP mẫu tăng lên Hình biểu thị mối liên hệ nồng độ E coli với cường độ ánh sáng phát xạ với hai phương pháp đo (phương pháp sử dụng luciferase luciferin hấp phụ giấy lọc phương pháp sử dụng luciferase luciferin dạng dung dịch thương mại hóa) Từ đồ thị thấy cường độ ánh sáng phát xạ từ thí nghiệm sử dụng giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin gần tương tương với cường độ ánh sáng thu từ thí nghiệm sử dụng dung dịch chứa luciferase luciferin Từ đó, kết luận luciferase luciferin hấp phụ giấy lọc cho kết tương đương đáng tin cậy kết thu từ việc sử dụng luciferase luciferin dạng dung dịch thương mại hóa Cường độ ánh sáng phát xạ tăng tỷ 9000 100000 Luciferase luciferin dung dịch 8000 7000 Luciferase luciferin gắn giấy lọc 10000 Cường độ ánh sáng (RLU) Cường độ ánh sáng (RLU) lọc 1000 100 1E+00 1E+03 1E+06 1E+09 E coli (CFU/ml) Hình Cường độ ánh sáng phát xạ thu sátsáng mẫu vớix Hình Cư ờngkhảo độ ánh phát thunồng đượcđộ khiE khảo sát mẫu với coli khác nồng độ E coli khác và sửsử dụng hỗn hợp luciferase dụng hỗn hợp luciferase và luciferin hấpphụ phụ luciferase đư ợc hấp giấy dạng dungdung dịch dịch giấy lọc lọcvàvà dạng 6000 5000 4000 3000 2000 1000 11 15 19 25 30 40 50 60 Thời gian bảo quản (ngày) Hình Cường độ ánh sáng thu sử dụng Hình 4được Cư ờng độ ánh sáng thunhững đư ợc sửlọc dụng lọc hấp phụ giấy hấp phụgiấy luciferase luciferase luciferase lúc luciferin lúc có thời có thời gian bảo quản khác gian bảo quản khác Độ bền phân tích giấy lọc sau thời gian bảo quản 61(6) 6.2019 68 Tiếp theo thí nghiệm kiểm tra khả phát vi khuẩn giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin, nghiên cứu tiếp tục kiểm tra độ bền phân tích giấy lọc sau thời gian bảo quản điều kiện nhiệt độ thường Hay nói cách khác khảo sát thời gian trì hoạt tính enzym luciferase sau thời gian bảo quản Khoa học Kỹ thuật Công nghệ lệ thuận với nồng độ vi khuẩn E coli dự đốn Hình cho thấy, cường độ ánh sáng phát xạ đo từ giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin cao kết thu từ dung dịch hỗn hợp luciferase luciferin Hơn nữa, thời gian phát vi khuẩn mẫu sử dụng giấy lọc khoảng 1-2 phút, tiết kiệm nhiều so với việc phát vi khuẩn sử dụng dung dịch phản ứng luciferase luciferin khoảng Độ bền phân tích giấy lọc sau thời gian bảo quản Tiếp theo thí nghiệm kiểm tra khả phát vi khuẩn giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin, nghiên cứu tiếp tục kiểm tra độ bền phân tích giấy lọc sau thời gian bảo quản điều kiện nhiệt độ thường Hay nói cách khác khảo sát thời gian trì hoạt tính enzym luciferase sau thời gian bảo quản Giấy lọc sau hấp phụ luciferase luciferin bảo quản bình kín chứa silica nhiệt độ phòng Như vậy, trình bảo quản, giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin giữ trạng thái khô enzym luciferase cố định lỗ trống giấy lọc, giúp enzym giữ cấu trúc không gian bền vững Hình cho thấy cường độ ánh sáng phát xạ không đổi suốt tháng bảo quản từ từ giảm dần ngày sau Cường độ ánh sáng giảm sau 30 ngày giảm hoạt độ enzym giấy lọc theo thời gian bảo quản Enzym dễ dàng hoạt tính để điều kiện nhiệt độ thường biến đổi cấu trúc không gian vùng hoạt động Nhưng enzym hấp thụ giấy lọc, cấu trúc không gian enzym trì bền vững khoảng 30 ngày điều kiện thường Những kết rằng, giấy lọc nguyên liệu đơn giản, hiệu quả, tiết kiệm cho việc hấp phụ enzym luciferase giúp giữ cấu trúc enzym trạng thái bền 30 ngày So sánh với độ bền enzym luciferase dung dịch từ Kit (1 ngày nhiệt độ 15-25oC), thấy hoạt độ luciferase hấp phụ giấy lọc bền vững nhiều Hơn nữa, với thời gian bảo quản 30 ngày từ ngày hấp phụ luciferase luciferin lên bề mặt, việc chuẩn bị giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin cho việc phân tích lượng vi khuẩn có mẫu trở lên đơn giản, tiết kiệm thương mại hóa Kết luận Từ kết thực nghiệm kết luận rằng, giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin sử dụng để phân tích lượng ATP thủy phân từ mẫu chứa vi khuẩn Giấy lọc sau hấp phụ luciferase luciferin trì trạng thái bền hoạt hóa, ổn định 30 ngày nhiệt độ phòng bình kín chứa silica, lấy sử dụng cho việc phát vi khuẩn lúc thông qua xác định hàm lượng ATP thủy phân từ mẫu chứa vi khuẩn Giới hạn phát giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin 1,17x103 CFU/ml E coli Vậy nên, giấy lọc hấp phụ luciferase luciferin có khả ứng dụng cao việc phát triển hệ cảm biến sinh hóa nhằm phát vi khuẩn môi trường cho kết đo thời gian thực TÀI LIỆU THAM KHẢO 61(6) 6.2019 [1] B Ghosh, H Lal, and A Srivastava (2015), "Review of bioaerosols in indoor environment with special reference to sampling, analysis and control mechanisms", Environment International, 85, pp.254-272 [2] P Blais-Lecours, P Perrott, and C Duchaine (2015), "Non-culturable bioaerosols in indoor settings: Impact on health and molecular approaches for detection", Atmospheric Environment, 110, pp.45-53 [3] L.D Stetzenbach, M.P Buttner, P Cruz (2004), "Detection and enumeration of airborne biocontaminants", Current Opinion in Biotechnology, 15(3), pp.170-174 [4] J.K Louie, et al (2005), "Characterization of Viral Agents Causing Acute Respiratory Infection in a San Francisco University Medical Center Clinic during the Influenza Season", Clinical Infectious Diseases, 41(6), pp.822-828 [5 S Dutil, et al (2008), "Measurement of Airborne Bacteria and Endotoxin Generated During Dental Cleaning", Journal of Occupational and Environmental Hygiene, 6(2), pp.121-130 [6] K Fallschissel, et al (2010), "Detection of Airborne Bacteria in a German Turkey House by Cultivation-Based and Molecular Methods", The Annals of Occupational Hygiene, 54(8), pp.934-943 [7] L.M.E Vanhee, H.J Nelis, T Coenye (2009), "Detection and quantification of viable airborne bacteria and fungi using solid-phase cytometry", Nature Protocols, 4, p.224 [8] Y.-L Pan (2015), "Detection and characterization of biological and other organic-carbon aerosol particles in atmosphere using fluorescence", Journal of Quantitative Spectroscopy and Radiative Transfer, 150, pp.12-35 [9] T.W Owen, et al (2007), "Microgravimetric immunosensor for direct detection of aerosolized influenza A virus particles, Sensors and Actuators B", Chemical, 126(2), pp.691-699 [10] R.H Williams, E Ward, H.A McCartney (2001), "Methods for Integrated Air Sampling and DNA Analysis for Detection of Airborne Fungal Spores", Applied and Environmental Microbiology, 67(6), pp.2453-2459 [11] T Rinsoz, et al (2008), "Application of real-time PCR for total airborne bacterial assessment: Comparison with epifluorescence microscopy and culture-dependent methods", Atmospheric Environment, 42(28), pp.67676774 [12] D.J Squirrell, R.L Price, M.J Murphy (2002), "Rapid and specific detection of bacteria using bioluminescence", Analytica Chimica Acta, 457(1), pp.109-114 [13] W.D Griffiths, G.A.L DeCosemo (1994), "The assessment of bioaerosols: A critical review", Journal of Aerosol Science, 25(8), pp.14251458 [14] J Peccia, M Hernandez (2006), "Incorporating polymerase chain reaction-based identification, population characterization, and quantification of microorganisms into aerosol science: A review", Atmospheric Environment, 40(21), pp.3941-3961 [15] M Kubist, et al (2006), "The real-time polymerase chain reaction", Molecular Aspects of Medicine, 27(2), pp.95-125 [16] R Singh, et al (2014), "Biosensors for pathogen detection: A smart approach towards clinical diagnosis Sensors and Actuators B", Chemical, 197, pp.385-404 [17] S.J Lee, et al (2008), "A microfluidic ATP-bioluminescence sensor for the detection of airborne microbes Sensors and Actuators B", Chemical, 132(2), pp.443-448 [18] J.M.M Leitão, J.C.G Esteves da Silva (2010), "Firefly luciferase inhibition", Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 101(1), pp.1-8 69 ... lên giấy Đánh giá khả phát E coli giấy lọc hấp phụ Đánh giá khả phát E coli giấy lọc hấp phụ luciferase luciferase luciferin luciferin Để đạt kết tốt từ phép đo sử dụng giấy lọc hấp phụ luciferase. .. lên bề lọc hấp luciferin đ và ược đặt bênđãtrong 96bên ỗ l Ngay sau giấyphụ lọcluciferase hấp phụv luciferase luciferin đượcđĩađặt Giấy lọc cắt nhỏ thành đĩa tròn với đường kính 0,5 cm giấymặt... dụng giấy lọc hấp phụ dung dịch phản ứng luciferase luciferin với ba lần hấp phụ Sau q trình tối ưu hóa hấp phụ luciferase luciferin, khảo sát khả phát vi khuẩn E coli nồng độ khác giấy lọc so