Trong công trình nghiên cứu của bài viết này, VK L. monocytogenes sau khi được ly giải bằng phương pháp hóa học trên màng nitrocellulose, đã phát hiện bằng phức hợp kháng thể đơn dòng với hạt nano vàng (biodesign) hoặc phức hợp kháng thể đơn dòng với các chấm lượng tử (tự gắn). Đây là một phương pháp sử dụng vật liệu mới để phát hiện vi khuẩn.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 ỨNG DỤNG PHỨC HỢP HẠT NANO-KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG PHÁT HIỆN VI KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENES Lê Thị Hiên*; Vũ Xuân Nghĩa** Phạm Đức Minh**; Nguyễn Năng Định* TÓM TẮT Phức hợp chấm lượng tử CdSe/ZnS với kháng thể đơn dòng (KTĐD) tạo để ứng dụng phát vi khuẩn (VK) L monocytogenes, sau tế bào ly giải phương pháp hóa học màng nitrocellulose Bên cạnh đó, sản phẩm thương mại phức hợp hạt nano vàng với kháng thể đơn dòng sử dụng để so sánh khả phát L monno Kết cho thấy, phức hợp KTĐD-chấn lượng tử tạo có kích thước tương ứng 10 nm có khả phát L mono nồng độ VK ly giải màng cellulose từ 105 - 106 cfu/ml * Từ khóa: L monocytogenes; Kháng thể đơn dòng; Phức hợp hạt nano Application of monoclonal antibody-conjugated nanoparticles for detection of bacteria Listeria monocytogenes summary The monoclonal antibody-conjugated CdSe/ZnS quantum dots were synthesized for detection of L monocytogenes after the cell lysis on nitrocellulose membrane In addition, a commercial product monoclonal antibody-conjugated gold nanoparticles - was used for comparison of these two materials The study broadened the applications of nanomaterials in bioimaging and pathogene detection * Key words: L monocytogenes; Monoclonal antibody; Nanoparticles ĐẶT VẤN ĐỀ Ngộ độc thực phẩm vấn đề cộng đồng tồn giới quan tâm Ngun nhân gây ca ngộ độc thực phẩm VK Salmonella, Escherichia coli, L monocytogenes Trong đó, số ca tử vong VK, L monocytogenes gây đứng thứ hai (chỉ sau VK Salmonella) tổng số ca tử vong nhiễm khuẩn từ thực phẩm Khác với loài gây ngộ độc thực phẩm khác, L monocytogenes phát triển 4ºC (khi thực phẩm giữ tủ lạnh) Do đó, L.monocytogenes gây ngộ độc cho người từ thực phẩm đông lạnh Mặc dù diện với số lượng nhỏ thực phẩm, vào thể, chúng khơng bị đào thải mà tích lũy chờ hội gây bệnh * Đại học Công nghệ - Đại học Quốc gia Hà Nội ** Học viện Quân y Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS TS Nguyễn TháI Sơn PGS TS Nguyễn Lĩnh Toàn 25 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Hiện có nhiều phương pháp phát VK L monocytogenes như: nuôi cấy [1], PCR [2], Western blot [3], ELISA [4], ELFA [5] Nuôi cấy phương pháp truyền thống, nhiều thời gian cần có môi trường tăng sinh phân lập chọn lọc cho loại VK, nên không phù hợp với nhu cầu phát nhanh VK mẫu thực phẩm chẩn đoán nhanh nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm cho người bệnh để có phương pháp điều trị kịp thời Các phương pháp chẩn đoán phân tử dựa kỹ thuật miễn dịch kỹ thuật PCR cho kết nhanh nhạy Gần đây, công nghệ nano phát triển nhanh tạo vật liệu nano tiên tiến (vật liệu có kích thước nanomet) mang lại nhiều ứng dụng to lớn lĩnh vực dược phẩm y sinh Trong loại vật liệu nano, hạt nano vàng chấm lượng tử (quantum dots) hai loại vật liệu nano nghiên cứu ứng dụng rộng rãi Hạt nano vàng gắn với phân tử sinh học sản phẩm với nhiều ứng dụng lĩnh vực y sinh học, chẩn đoán điều trị tế bào ung thư, đặc biệt cơng nghệ chế tạo kit chẩn đốn nhanh loại bệnh truyền nhiễm [6] Chấm lượng tử với khả phát huỳnh quang độ bền màu với ánh sáng vượt qua chất màu hữu trở thành số vật liệu sáng giá công nghệ nano Chấm lượng tử sử dụng đánh dấu tế bào phần tử sinh học, dẫn truyền phân phối thuốc, công cụ chẩn đốn [7] Trong cơng trình nghiên cứu này, VK L monocytogenes sau ly giải phương pháp hóa học màng nitrocellulose, phát phức hợp kháng thể đơn dòng với hạt nano vàng (biodesign) phức hợp kháng thể đơn dòng với chấm lượng tử (tự gắn) Đây phương pháp sử dụng vật liệu để phát vi khuẩn ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vi khuẩn Vi khuẩn Listeria monocytogenes ATCC 35152, chủng chuẩn quốc tế, tăng sinh bảo quản theo tiêu chuẩn quốc gia Bộ môn Vi sinh Y học, Học viện Quân y VK E coli BL21 (Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam) Vật liêu Kháng thể đơn dòng C86030M kháng L mono (Biodesign), kháng thể đơn dòng C86920M kháng L mono gắn hạt nano vàng (Biodesign), albumin huyết bò (BSA) (Biobasic) Chấm lượng tử CdSe/ZnS (Viện Khoa học Vật liêu - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam cung cấp) Màng nitrocellulose (0,45 micromet, Whatman) Đệm Blotting 10x (250 mM, 1,92 M Glycine) Đệm Blotting 1x (pha loãng đệm Blotting 10x với methanol nước theo tỷ lệ thể tích 1:2:7) Đệm TBS 1x (Tris HCl 50 mM; NaCl 100 mM; pH 7,5) Đệm TTBS 1x (0,05% Tween 20 đệm TBS 1x) Đệm PBS 1x (100 mM NaH2PO4, 100mM Na2HPO4, 150 mM NaCl pH 7,5) Phƣơng pháp nghiên cứu * Tạo phức hợp kháng thể đơn dòng với chấm lượng tử: Gắn chấm lượng tử có nhóm chức amino với kháng thể đơn dòng kháng L mono chất nối bis (3-sulfo-N-hydroxysuccinimide ester) (BS3) (Sigma) Ủ chấm lượng tử 10 mg/ml 27 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 đệm PBS 1x với chất nối BS3 máy lắc 30 phút nhiệt độ phòng Ly tâm 5.000 vòng/phút phút, thu tủa, bỏ dịch tan có chứa chất BS3 dư Thêm 20 µl PBS 1x vào tủa lắc cho tủa phân tán đệm Thêm µl kháng thể (2,8 mg/ml), trộn nhẹ, để nhiệt độ phòng Ly tâm 5.000 vòng/phút phút Thu dịch để phân tích lượng kháng thể dư phương pháp điện di gel polyacrylamide (gel tách 12%, gel cô 5%) Thu tủa (phức hợp hạt nano-kháng thể), phân tán lại PBS 1x ủ với µg BSA 30 phút nhiệt độ phòng Ly tâm thu tủa phân tán lại 20 µl PBS giữ 4ºC để sử dụng * Ly giải VK màng nitrocellulose: Chuẩn bị dung dịch sử dụng để ly giải tế bào rót sẵn vào đĩa Petri khác - Đĩa 1: dung dịch SDS 10%; đĩa 2: dung dịch biến tính (0,5M NaOH; 1,5M NaCl); đĩa 3: dung dịch trung hòa (1,5M NaCl; 0,5M Tris HCl pH 7,5); đĩa 4: dung dịch trung hòa (như đĩa 3); đĩa 5: dung dịch đệm SSC (0,15 M NaCl, citrate natri 15 mM pH 7,0) - Thấm dung dịch giấy thấm để sẵn đĩa - Ngâm màng nitrocellulose đệm blotting 1x ba lần, lần phút Nhỏ - µl tế bào L monocytogenes lên màng nitrocellulose Đặt màng lên giấy thấm ướt dung dịch đĩa Petri theo thứ tự thời gian Đĩa 1: 10 phút; đĩa 2: phút; đĩa 3: phút; đĩa 4: phút; đĩa 5: 15 phút Ly giải xong, để bề mặt màng khô, ngâm màng sữa tách béo 5% TTBS 1x máy lắc nhiệt độ phòng Rửa màng TTBS 1x ba lần, lần phút TBS 1x ba lần, lần phút Vi khuÈn Mµng NC Hãa chÊt GiÊy thÊm §Üa Hình 1: Hình minh họa phương pháp ly giải tế bào màng nitrocellulose * Phát VK sau ly giải màng nitrocellulose phức hợp kháng thể đơn dòng với hạt nano vàng với chấm lượng tử: Nhỏ - µl dung dịch phức hợp hạt nano vàng-kháng thể đơn dòng phức hợp chấm lượng tử-kháng thể đơn dòng lên vị trí có tế bào VK L monocytogenes ly giải màng nitrocellulose Ủ 30 giây nhiệt độ phòng Rửa màng TTBS phút Quan sát chụp ảnh Đối với phức hợp chấm lượng tử kháng thể, ánh sáng huỳnh quang đỏ mẫu quan sát đèn tử ngoại (UV transluminator 2.000) với bước sóng kích thích 300 nm KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tạo phức hợp kháng thể đơn dòng với chấm lƣợng tử Theo phân tích hình ảnh kính hiển vi điện tử quét phân giải cao (FESEM) ban đầu, chấm lượng tử cụm lại thành hạt có kích thước lớn khoảng 300 nm Sau gắn kháng thể, chấm lượng tử tách thành hạt có kích thước nhỏ nhiều, khoảng 10 nm (hình 2) 28 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 vạch với khối lượng phân tử 30 kDa, 50 kDa 160 kDa, tương ứng với chuỗi nhẹ, chuỗi nặng kháng thể kháng thể hoàn chỉnh) 2: Thang protein 3: Dịch phản ứng gắn kháng thể lên chấm lượng tử A Kết cho thấy, dịch khơng kháng thể (đường số 3), chứng tỏ kháng thể gắn kết hết với chấm lượng tử tủa xuống sau ly tâm B Phát VK sau ly giải màng nitrocellulose phức hợp hạt nano vàng-kháng thể đơn dòng phức hợp chấm lƣợng tử-kháng thể đơn dòng Hình 2: Ảnh hiển vi điện tử quét phân giải cao (FESEM) chấm lượng tử trước (A) sau gắn kháng thể (B) Để đánh giá khả gắn kết kháng thể với chấm lượng tử, sau phản ứng, ly tâm thu dịch nổi, phân tích phương pháp điện di biến tính gel polyacrylamide (hình 3) (kDa) 160 Các tế bào VK L monocytogenes ly giải hóa chất thấm qua giấy thấm màng nitrocellulose Sau ly giải, protein VK bám vào màng nitrocellulose Phức hợp hạt nano-kháng thể sử dụng phát kháng nguyên VK màng nitrocellulose Sử dụng đối chứng âm dịch ly giải VK E coli (hình 4) A E coli L.monocytogennes 97 6 10 10 (cfu/ml) 66 B 43 E coli L.monocytogennes 50 30 10 Hình 3: Hình 30 ảnh gel điện di dịch phản ứng gắn kháng thể lên chấm lượng tử 1: Kháng thể đơn dòng C86030M (kháng thể chưa phản ứng với chấm lượng tử 10 10 (cfu/ml) Hình 4: Phát VK L monocytogenes sau ly giải màng nitrocellulose dùng phức hợp chấm lượng tử-kháng thể (A) phức hợp hạt vàng-kháng thể (B) Đối chứng âm dịch ly giải VK E.coli 29 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Sau nhỏ phức hợp chấm lượng tửkháng thể đơn dòng kháng L monocytogenes lên vị trí tế bào L monocytogenes bị ly giải rửa TTBS, quan sát đèn tử ngoại thấy chấm phát huỳnh quang đỏ Trong đó, vị trí dịch ly giải VK E coli, khơng thấy chấm phát sáng (hình A) Kết chứng tỏ, chấm lượng tử gắn với kháng thể đơn dòng kháng L monocytogenes phức hợp tạo thành sử dụng để phát đặc hiệu VK L monocytogenes Nồng độ VK đưa lên màng 106 cfu/ml Tương tự phần trên, phức hợp hạt vàngkháng thể đơn dòng kháng L monocytogenes (biodesign) nhỏ lên màng nitrocellulose rửa TTBS Tại vị trí ly giải VK L monocytogenes thấy xuất vệt tròn màu hồng (màu phức hợp hạt nano vàng-kháng thể), vị trí ly giải VK E coli, khơng thấy màu (hình 4.B) Màu hồng nhìn thấy rõ nồng độ 106 cfu/ml mờ nồng độ 105 cfu/ml Như vậy, phức hợp chấm lượng tửkháng thể (tự gắn) sản phẩm thương mại hạt nano vàng-kháng thể phát VK L monocytogenes nồng độ 105 - 106 cfu/ml vài phút sau nhỏ phức hợp hạt nano-kháng thể đơn dòng kháng L monocytogenes Các phương pháp Western blot (phát L monocytogenes nồng độ 105 cfu/ml [3]) phương pháp ELFA (khoảng phát 104 - 105 cfu/ml [5]) sử dụng phản ứng miễn dịch kháng thể với kháng nguyên protein màng phân tách (Western blot) tinh (ELFA) Trong nghiên cứu này, phức hợp hạt nanokháng thể cho phản ứng miễn dịch với dịch ly giải tế bào (kháng nguyên chưa phân tách) phát L monocytogenes nồng độ gần tương đương Điều cho phép dự đốn, sử dụng kháng ngun tinh sạch, tín hiệu màu cho hạt nano vàng chấm lượng tử tốt nhiều Như vậy, phương pháp ly giải tế bào màng hóa chất đơn giản, không cần công đoạn phá tế bào siêu âm tinh kháng nguyên protein màng tế bào Nghiên cứu góp phần mở rộng ứng dụng vật liệu nano lĩnh vực đánh dấu sinh học phát tác nhân gây bệnh Trong tương lai, phức hợp hạt nano-kháng thể, tương tự chất màu huỳnh quang hữu sử dụng EFLA để làm tăng độ nhạy, ứng dụng phương pháp chẩn đoán phân tử miễn dịch để thay chất màu hữu KẾT LUẬN Vi khuẩn L monocytogenes sau ly giải phương pháp hóa học màng nitrocellulose phát phức hợp kháng thể đơn dòng với hạt nano vàng phức hợp kháng thể đơn dòng với chấm lượng tử TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Đức Minh, Vũ Xuân Nghĩa, Lê Thị Hiên, Nguyễn Năng Định Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn dòng phát VK Listeria monocytogenes Tạp chí Y học Việt Nam 2012, tháng 8, số 1, tr.22-24 30 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Erdogan H.M, Cripps P.J, Morgan K.L Optimization of a culture technique for the isolation of Listeria monocytogenes from faecal samples J Vet Med Infect Dis Vet Public Health 2002, 49 (10), pp.502-506 Levin R.E Application of the polymerase chain reaction for detection of Listeria monocytogenes in foods: a review of methodology Food Biotechnol 2003, 17, pp.99-116 Karamonova L, Blazkova M, Fukal L, Rauch P, Greifov M, Horakova K, Tomaska M, Roubal P, Brett G M, Wyatt G M Development of an ELISA specific for Listeria monocytogenes using a polyclonal antibody raised against a cell extract containing Internalin B Food and Sewell A.M, Warburton D.W, Boville A, Daley E.F, Mullen K The development of an efficient and rapid enzyme linked fluorescent assay method for the detection of Listeria spp from foods Int J Food Microbiol 2003, 81, pp.123-129 Cai W Chen X Nanoplatforms for targeted molecular imaging in living subjects Small 2007, pp.1840-1854 Zrazhevskiy P, Sena M, Gao X Designing multifunctional quantum dots for bioimaging, detection and drug delivery Chem Soc Rev 2010, 39 pp.4326-4354 Agricultural mmunology 2003, 15, pp.167-182 Ngµy nhận bài: 18/10/2012 Ngày giao phản biện: 5/1/2013 Ngày giao b¶n th¶o in: 6/2/2013 31 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 32 ... vậy, phức hợp chấm lượng t kháng thể (tự gắn) sản phẩm thương mại hạt nano vàng -kháng thể phát VK L monocytogenes nồng độ 105 - 106 cfu/ml vài phút sau nhỏ phức hợp hạt nano- kháng thể đơn dòng kháng. .. lượng tử -kháng thể (A) phức hợp hạt vàng -kháng thể (B) Đối chứng âm dịch ly giải VK E.coli 29 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2 013 Sau nhỏ phức hợp chấm lượng t kháng thể đơn dòng kháng L monocytogenes. .. nano vàng với chấm lượng tử: Nhỏ - µl dung dịch phức hợp hạt nano vàng -kháng thể đơn dòng phức hợp chấm lượng tử -kháng thể đơn dòng lên vị trí có tế bào VK L monocytogenes ly giải màng nitrocellulose