So sánh và chọn lọc các quy trình PCR phát hiện vi khuẩn c diphtheriae gây bệnh bạch hầu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SO SÁNH VÀ CHỌN LỌC CÁC QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN CORYNEBACTERIUM DIPTHERIAE GÂY BỆNH BẠCH HẦU Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hƣớng dẫn: THS.PHAN VĂN THÀNH BS.HỒ NGUYỄN LỘC THÙY Sinh viên thực hiện: MSSV: 1311100546 NGUYỄN ĐỖ KHÁNH NHƢ Lớp: 13DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SO SÁNH VÀ CHỌN LỌC CÁC QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN CORYNEBACTERIUM DIPTHERIAE GÂY BỆNH BẠCH HẦU Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hƣớng dẫn: THS.PHAN VĂN THÀNH BS.HỒ NGUYỄN LỘC THÙY Sinh viên thực hiện: MSSV: 1311100546 NGUYỄN ĐỖ KHÁNH NHƢ Lớp: 13DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2017 LỜI CAM ĐOAN Khóa luận tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân dƣới hƣớng dẫn khoa học THS Phan Văn Thành Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc Thùy (Chuyên viên nghiên cứu phòng Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễn dịch, viện Pasteur TP Hồ Chí Minh) Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm khóa luận tốt nghiệp TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Đỗ Khánh Nhƣ i LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời nuôi nấng dạy dỗ 22 năm qua, cảm ơn anh chị gia đình định hƣớng ủng hộ đƣờng học tập em Em xin cảm ơn Thạc sĩ Võ Thị Trang Đài, Thạc sĩ Phạm Thị Hoan tận tâm dạy truyền đạt kiến thức cho em suốt q trình thực khóa luận Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến Thạc sĩ Phan Văn Thành Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc Thùy ngƣời ln nhiệt tình giúp đỡ em, định hƣớng cung cấp kiến thức bổ ích cho chúng em, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn em thực tốt khóa luận tốt nghiệp Đồng thời, xin cảm ơn đến chị Nguyễn Hoàng Vân Anh, anh Nguyễn Gia Kỳ, bạn Phạm Trần Diệu Huyền, Trƣơng Khánh Duy, Lê Thị Thùy Trang, Hồ Thị Thu Trang hổ trợ thực tốt khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tất bạn phòng thí nghiệm giúp đỡ suốt q trình làm thí nghiệm Em xin chân thành cảm ơn ! TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Đỗ Khánh Nhƣ ii MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii Phần I: MỞ ĐẦU Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược bệnh Bạch hầu 2.1.1 Tác nhân gây bệnh 2.1.2 Cơ chế gây bệnh 2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu giới 2.1.5 Biện pháp phòng bệnh 2.2 Corynebacterium Diphtheriae 10 2.2.1Hình thái cấu trúc 10 2.2.2Tính chất ni cấy 11 2.2.3Đặc điểm sinh hóa 12 Phần III: PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 16 3.1 Vật liệu nghiên cứu 16 3.1.1Dụng cụ cần thiết 16 3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 18 3.2 Phương pháp nghiên cứu 19 3.2.3 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng Real time PCR 21 3.2.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng Realtime PCR 22 3.2.5 Khảo sát độ nhạy ( ngưỡng phát dưới) phản ứng Realtime PCR 22 3.2.6 Khảo sát độ đặc hiệu phản ứng PCR Realtime PCR 23 PHẦN IV: KẾT QUẢ 24 4.1 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát dưới) phản ứng PCR: 24 4.2 Khảo sát độ đặc hiệu phản ứng PCR: 25 4.3 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng Realtime PCR 26 4.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò quy trình Realtime PCR 27 4.5 Khảo sát độ đặc hiệu quy trình Realtime PCR 27 iii 4.6 Khảo sát độ nhạy quy trình Realtime PCR 28 PHẦN V: KẾT LUẬN 31 Phần VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHẦN VII: PHỤ LỤC 34 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AE Elution buffer AL Lysis buffer AW1 Wash buffer AW2 Wash buffer DNA Deoxyribose Nucleic Acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium Bromide PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Real Time - Polymerase Chain Reaction TBE Tris-Borate EDTA µL Microlitter µM Micromole v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884 (bên trái) 11 Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu Mỹ từ năm 1940-1980 .14 Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu Mỹ từ năm 1980-2010 .15 Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu giới 15 Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu Việt Nam từ năm 2005-2015 16 Hình 2.5: Mô vi khuẩn Gram dƣơngC.diphtheriae dùng kĩ thuật nhuộm Xanh methylene (Nguồn: public health image library-PHLI) 18 Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn dùng kĩ thuật nhuộm Albert (Nguồn: public health image library-PHLI) 18 Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc mơi trƣờng BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạc môi trƣờng HA (bên trái) (Nguồn: public health image library-PHLI) 19 Hình 2.8: Thử nghiệm Elek 21 Hình 4.1: Kết điện di độ nhạy mồi phản ứng PCR xử dụng cặp mồi DT1, DT2 32 Hình 4.2: Kết điện di sản phẩm PCR, quy trình sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 không bổ sung MgCl2 32 Hình 4.3: Kết điện di độ nhạy mồi phản ứng PCR xử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl2 33 Hình 4.4, 4.5, 4.6: Kết điện di gel, thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu cuả mồi DT1, DT2 33 Hình 4.8: Kết khảo sát nồng độ mồi Realtime PCR 34 Hình 4.9: Kết khảo sát nồng độ mẫu dò Realtime PCR 35 Hình 4.10: Kết khảo sát độ đặc hiệu Realtime PCR 35 Hình 4.11: Kết khảo sát độ nhạy Realtime PCR 36 Hình 4.12: Kết chạy Realtime-PCR mẫu Realtime PCR 36 vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa vi khuẩn bạch hầu giả bạch hầu 19 Bảng 2.2: Khả tan huyết biotype 20 Bảng 3.1: Các cặp mồi đầu dò đƣợc dùng để thực phản ứng PCR 25 Bảng 3.2: Các cặp mồi đầu dò đƣợc dùng để thực phản ứng Realtime PCR 26 Bảng 3.3: Các chủng vi khuẩn thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu .26 Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cho cặp mồi DT1, DT2 28 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cho cặp mồi Tox1, Tox2 28 Bảng 3.6: Chu trình nhiệt cho cặp mồi DT1, DT2 29 Bảng 3.7: Chu trình nhiệt cho cặp mồi Tox1, Tox2 29 Bảng 3.8: Chu trính nhiệt phản ứng Realtime PCR 30 Bảng 3.9: Thành phẩn phản ứng phản ứng Realtime PCR 30 Bảng 4.1: Kết chạy 39 mẫu 37 vii CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU Bệnh bạch hầu khuẩn C Diphtheriae gây Biểu lâm sàng thông thƣờng nhiễm trùng khu trú niêm mạc hô hấp, với đặc điểm màng giả xuất nơi nhiễm trùng Một số vi trùng tạo độc tố, nhiễm độc tố, bệnh diễn tiến nặng với nhiều biến chứng nhƣ viêm tim, viêm dây thần kinh, viêm thận biến chứng tim gây tử vong cao Trong chiến thứ II Na Uy, vòng năm sau Đức xâm lƣợc số trƣờng hợp nhiễm bệnh tăng lên đến 50000 ca [3] Ở Việt Nam, thời kỳ chƣa thực tiêm vắc xin bạch hầu Chƣơng trình tiêm chủng mở rộng (TCMR) bệnh bạch hầu thƣờng xảy gây dịch hầu hết tỉnh, đặc biệt thành phố có mật độ dân cƣ cao Do thực tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ mắc bạch hầu Việt Nam giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống 0,14/100.000 dân năm 2000 Nhƣng đến năm 2015 tỉnh Quảng Nam dịch lại xuất hiện, phát ca dƣơng tính với vi khuẩn C.diphtheriae Năm 2016 vụ dịch Bình Phƣớc phát ca có ca tiếp xúc dƣơng tính với khuẩn [15] Phƣơng pháp ni cấy “ Tiêu chuẩn vàng” phòng thí nghiệm nhiên phƣơng pháp tốn nhiều thời gian lúc sinh vật sống mẫu bệnh phẩm sau trình vận chuyển bảo quản mẫu Để phân biệt chủng bạch hầu sinh độc tố không sinh độc tố phƣơng pháp ni cấy truyền thống khó, C.diphtheriae C.ulcerans giống đến 95% axit amin nucleotic Thử nghiệm Elek phƣơng pháp phát đƣợc độc tố bạch hầu Nhƣng tình hình bệnh ngày sinh hóa phẩm dùng cho thử nghiệm sử dụng riêng biệt mà lại không tận dụng đƣợc nhiều nên thử nghiệm đƣợc dùng đến [13] Sự phát triển sinh học phân tử - phƣơng pháp PCR giúp ích nhiều việc nghiên cứu, chữa trị nhƣ kiểm soát bệnh bạch hầu Ƣu điểm phƣơng pháp PCR phát xác chủng bạch hầu sinh độc tố thời gian ngắn, độ đặc hiệu cao Để đáp ứng nhanh nhu cầu phát hiện, chẩn đoán chữa trị, Real time – PCR đời rút ngắn thời gian xét nghiệm bệnh thực Sau tìm đƣợc nồng độ mồi thích hợp tiến hành thực thí nghiệm -1 -7 khảo sát độ nhạy mồi dải nồng độ DNA 10 - 10 , thí nghiệm đƣợc thực với nồng độ mồi 1.2µM 3.2.6 Khảo sát độ đặc hiệu phản ứng PCR Realtime PCR Độ đặc hiệu quy trình PCR đƣợc thiết lập đƣợc kiểm tra chủng vi khuẩn đƣợc liệt kê bảng 3.3 với nồng độ mồi 1.2 µM nồng độ mẫu dò 0.1µM Tiến hành áp dụng quy trình PCR, Realtime PCR chạy 40 mẫu ngốy họng có triệu chứng lâm sàn mẫu ngốy họng tiếp xúc với ca nhiễm bệnh: Quy trình PCR (mồi DT1, DT2): nồng độ mồi 0.4µM Tiến hành điện di sản phẩm PCR 35 phút, điện 100V Quy trình PCR (mồi Tox1, Tox2): nồng độ mồi 0.8µM, bổ sung 1µL MgCl Tiến hành điện sản phẩm PCR 30 phút, điện 100V Quy trình Realtime PCR (mồi ToxA-R, ToxA-F): nồng độ mồi 1.2µM, nồng độ mẫu dò 0.1µM 23 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ 4.1 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát dưới) phản ứng PCR: Lad -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8 10 -9 10 _ Hình 4.1: Kết điện di độ nhạy mồi phản ứng PCR sử dụng cặp mồi DT1, DT2 Theo hình 4.1: Trong thí nghiệm sử dụng cặp mồi DT1, DT2 để khảo sát độ nhạy phản ứng dải nồng độ DNA từ 10 -1-10-9 Nồng độ 0.4µM mồi phát gen độc tố khoảng nồng độ DNA từ 10 -4, nghiã với 2180CFU quy trình PCR phát đƣợc vi khuẩn C.diphtheriae Lad + 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 - Hình 4.2: Kết điện di sản phẩm PCR, quy trình sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 khơng bổ sung MgCl2 Theo hình 4.2: Thí nghiệm sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung thêm -1 -7 MgCl2 để khảo sát độ nhạy phản ứng dải nồng độ DNA từ 10 -10 , Ở nồng -4 độ 0.8µM, mồi bắt đƣợc gen độc tố gây bệnh ngƣỡng 10 Nghĩa với 2180CFU quy tình PCR phát vi khuẩn gây bệnh Kết gel điện di cho thấy thành phần phản ứng có bổ sung MgCl (hình 4.3) cho kết rõ hơn, hình chụp sáng màu so với khơng bổ sung MgCl2 (hình 4.2) 24 Lad 10-1 + 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 - Hình 4.3:Kết điện di độ nhạy mồi phản ứng PCR xử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl2 4.2 Khảo sát độ đặc hiệu phản ứng PCR: Lad + Hình 4.4 Lad + 10 11 12 Hình 4.5 Lad + 13 14 Hình 4.6 Hình 4.4, 4.5, 4.6: Kết điện di gel, thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu cuả mồi DT1, DT2 phản ứng PCR Lad= thang đo kích thƣớc phân tử; (+) = đối chứng dƣơng; 1= Haemophilus influenza, 2= Staphylococcus aureus; 3= Streptococcus pneumonia; 4= Neisseria meningitides; 5= Neisseria gonorrhoeae;6= Pseudomonas aeruginosa; 7= Escherichia coli; 8= Bacillus Subtilis; 9= Haemophilus paraphrophilus; 10= Staphylococcus epidermidis; 11= Bacillusparalicheniformis; 12= Enterobacter cloacae; 13= Neisseria lactamica; 14= Neisseria meningitidis Theo hình 4.4, 4.5, 4.6: Thí nghiệm sử dụng cặp mồi DT1, DT2 chủng vi khuẩn khác để khảo sát độ đặc hiệu phản ứng Kết cho thấy cặp mồi gắn đặc hiệu với gen độc tố vi khuẩn C.diphtheriae 25 Lad + 10 11 12 13 14 _ Hình 4.7: Kết điện di gel, thí nghiệm khảo sát độ đặc hiệu mồi Tox1, Tox2 Lad= thang đo kích thƣớc phân tử; (+) = đối chứng dƣơng; 1= Haemophilus influenza, 2= Staphylococcus aureus; 3= Streptococcus pneumonia; 4= Neisseria meningitides; 5= Neisseria gonorrhoeae;6= Pseudomonas aeruginosa; 7= Escherichia coli; 8= Bacillus Subtilis; 9= Haemophilus paraphrophilus; 10= Staphylococcus epidermidis; 11= Bacillusparalicheniformis; 12= Enterobacter cloacae; 13= Neisseria lactamica; 14= Neisseria meningitides; (-)= đối chứng âm Theo hình 4.7: Thí nghiệm sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl chủng vi khuẩn để khảo sát độ đặc hiệu phản ứng Kết cho thấy cặp mồi gắn đặc hiệu với gen độc tố vi khuẩn C.diphtheriae mà khơng phát thêm chủng vi khuẩn khác 4.3 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng Realtime PCR Hình 4.7: Kết khảo sát nồng độ mồi Với nồng độ mồi khác đƣợc khảo sát, nồng độ mồi sau lần lăp lại cho tín hiệu vƣợt qua tín hiệu nền, kết rõ ràng nên chọ nồng độ 26 4.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò quy trình Realtime PCR Với ba lần lặp lại nồng độ mẫu dò, nồng độ cho tín hiệu vƣợt lên cao khỏi tín hiệu nền, nên chọn nồng độ thấp 0.1µM để sử dụng phản ứng Realtime PCR Hình 4.8: Kết khảo sát nồng độ mẫu dò 4.5 Khảo sát độ đặc hiệu quy trình Realtime PCR Cặp mồi- mẫu dò dùng để kiểm tra độ đặc hiệu cho đối chứng dƣơng C.diphtheriae vƣợt lên cao khỏi tín hiệu nền, khơng phát tín hiệu huỳnh quang với ống chứa DNA chủng vi khuẩn đối chiếu Kết khẳng định độ tin cậy cặp mồi mẫu dò phản ứng Realtime PCR chuẩn đốn C.diphtheriae Hình 4.9: Kết khảo sát độ đặc hiệu (1) đƣờng biểu diễn đối chứng dƣơng (2) đƣờng nền, (3) đƣờng biểu diễn vi khuẩn khác 27 4.6 Khảo sát độ nhạy quy trình Realtime PCR -1 -9 Thí nghiệm khảo sát độ nhạy dãy nồng độ DNA vi khuẩn từ 10 -10 , kết -5 cho thấy cặp mồi- mẫu dò phát đƣợc vi khuẩn ngƣỡng nồng độ 10 , đồng nghĩa với 124 CFU quy trình Realtime PCR phát đƣợc vi khuẩn C.diphtheriae Hình 4.10: Kết khảo sát độ nhạy Hình 4.11: Kết chạy Realtime-PCR mẫu (1) đƣờng biểu diễn chứng dƣơng (2) mẫu 16-389CD (3) mẫu 16-393CD.(4) mẫu 16-386CD.(5) đƣờng 28 Bảng 4.1:Kết chạy 40 mẫu Tên chủng 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 16-373CD 16-377CD 16-378CD 16-379CD 16-380CD 16-381CD 16-382CD 16-383CD 16-384CD 16-385CD 16-386CD 16-387CD 16-388CD 16-389CD 16-390CD 16-391CD 16-392CD 16-393CD 16-394CD 16-395CD 16-396CD 16-397CD 16-398CD 16-399CD 16-400CD 16-401CD 16-402CD 16-403CD 16-404CD 16-405CD 16-406CD 16-407CD 16-408CD 16-409CD 16-410CD 16-411CD 16-412CD 16-417CD 16-418CD 16-419CD Nuôi cấy (+) PCR1 (mồi DT)(+) PCR2 ( mồi Tox)(+) Realtime-PCR (+) X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 29 Qua bảng thống kê số liệu kết quy trình PCR Realtime PCR ta thấy đƣợc quy trình PCR1 phát đƣợc mẫu dƣơng tính/ mẫu ni cấy dƣơng tính hiệu xuất quy trình đạt khoảng 60% Quy trình PCR2 phát mẫu dƣơng tính mẫu 16-393 CD 16-418CD phát dƣơng tính kết ni cấy âm tính, hiệu xuất quy trình đạt khoảng 60% Quy trình Realtime PCR phát đƣợc mẫu dƣơng tính có mẫu 16-393CD 16-418CD phát dƣơng tính kết ni cấy âm tính, hiệu suất quy trình đạt khoảng 80% 30 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN Bài nghiên cứu so sánh ba phƣơng pháp PCR1, PCR2 Realtime PCR : PCR1 sử dụng cặp mồi DT1, DT2; PCR2 sử dụng cặp mồi Tox1, Tox Real time PCR sử dụng mồi ToxA-R, ToxA-F Trong phƣơng pháp PCR2 thí nghiệm khảo sát độ nhạy ta thấy đƣợc cặp mồi Tox1, Tox2 cho kết rõ ràng xác bổ sung MgCl2 Quy trình PCR1, PCR2 đƣợc thiết lập để có độ đặc hiệu tối ƣu độ nhạy phát gen độc tố nồng độ DNA 10 -4 nghĩa với 2180CFU quy trình phát đƣợc vi khuẩn gây bệnh Quy trình Real time PCR đƣợc khảo sát cho độ đặc hiệu cao nồng độ mồi 0.4µM, nồng độ mẫu dò 0.1µM quy trình phát -5 gen độc tố nồng độ DNA 10 Nghĩa với 124CFU quy trình phát đƣợc vi khuẩn gây bệnh Realtime PCR có độ nhạy cao, cho kết cụ thể nhanh chóng làm giảm nhu cầu sử dụng PCR Mặc dù nhiều mẫu lâm sàng chứa lƣợng nhỏ DNA, Realtime PCR phát độc tố có tới hai đến ba gen mục tiêu Tuy nhiên, lợi lớn phƣơng pháp loại cung cấp thông tin phản ứng vừa kết thúc, điều quan trọng trƣờng hợp xảy cố Realtime PCR cung cấp cải tiến đáng kể so với xét nghiệm PCR chuẩn có để phát độc tố, hữu ích việc nghiên cứu, dự đốn phòng chóng dịch bệnh Tuy nhiên nghiên cứu chƣa thực khảo sát nồng độ mồi cho hai quy trình PCR1, PCR2 Cần phải thực thêm thí nghiệm để hồn thiện quy trình Trong thí nghiệm pha lỗng nồng độ, thực pha loãng bậc 10 nên tiến hành thêm pha loãng bậc để nâng cao độ xác cho quy trình 31 CHƢƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1]Dịch tể học bệnh truyền nhiễm phổ biến, NXB y học, 2012, trang 209-214 [2]Dịch tể học bệnh truyền nhiễm phổ biến, NXB y học, 2012, trang212-214 [3]PGS TS Lê Văn Phùng Vi Khuẩn Y Học Vụ Khoa học Đào tạo, 2009, trang 126 [4]PGS.TS Lê Văn Phủng Vi sinh Y học Vụ khoa học đào tạo 2009, trang 130 [5] Xét nghiệm chuẩn đoán vi khuẩn, NXB y học, 2012, trang105-107 [6]Vi sinh vật gây nhiễm trùng quan (Sách đào tạo Bác sĩ chuyên khoa I dịch tễ học thực địa), NXB Y học, 2012, trang 12 Tài liệu nƣớc ngoài: [7] DANIEL HAUSER, MICHEL R POPOFF, MARTINE KIREDJIAN, PATRICE BOQUET AND FRANOIS BIMET Polymerase Chain Reaction Assay for Diagnosis of Potentially Toxinogenic Corynebacterium diphtheriae Strains: Correlation with ADP-Ribosylation Activity Assay., Journal of Clinical Microbiology OCt 1993, p 2720-2723 [8] Espy, M J., et al "Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing." Clinical microbiology reviews 19.1 (2006): 165-256 [9] Hiroshi Nakao, Tanja Popovic Development of a Direct PCR Assay for Detection of the Diphtheria Toxin Gene Journal of Clinical Microbiology , July 1997, p 1651–1655 0095-1137/97/$04.0010 [10]Kobaidze, Ketevan, et al "Direct polymerase chain reaction for detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae strains from the Republic of Georgia after prolonged storage." Journal of Infectious Diseases 181.Supplement_1 (2000): S152S155 [11] Mancini, Fabiola, et al "Identification and molecular discrimination of toxigenic and nontoxigenic diphtheria Corynebacterium strains by combined real-time polymerase chain reaction assays." Diagnostic microbiology and infectious disease 73.2 (2012): 111-120 32 [12] Young, T Kue Population health: concepts and methods Oxford University Press, USA, 2005 [13]Sing A, Berger A, Schneider-Brachert W, Holzmann T, Reischl U Rapid Detection and Molecular Differentiation of Toxigenic Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans Strains by LightCycler PCR Journal of Clinical Microbiology 2011;49(7):2485-2489 doi:10.1128/JCM.00452-11 [14]Sing A, Hogardt M, Bierschenk S, Heesemann J Detection of Differences in the Nucleotide and from Corynebacterium Amino Acid Sequences of diphtheriae and Corynebacterium Extrapharyngeal Infections Journal of Clinical Microbiology Diphtheria Toxin ulcerans Causing 2003;41(10):4848- 4851 doi:10.1128/JCM.41.10.4848-4851.2003 Tài liệu từ internet [15] http://vncdc.gov.vn/vi/danh-muc-benh-truyen-nhiem/1084/benh-bach-hau 33 CHƢƠNG 7: PHỤ LỤC Kết chạy điện di mẫu phƣơng pháp PCR dùng cặp mồi DT1, DT2 Lad - - 373 382 383 377 378 379 380 381 + 384 385 386 387 + lad 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 + lad + Lad 406 407 408 409 34 _ + - 400 401 402 403 404 405 - 410 411 412 + - - 418 419 + lad Kết chạy điện di mẫu phƣơng pháp PCR dùng cặp mồi Tox1, Tox2 lad - + 388 389 390 391 392 35 393 394 395 396 397 398 399 Lad + 412 417 418 419 - Kết chạy Realtime PCR mẫu: 378 Chứng dương Hình chạy mẫu 16-373CD, 16-377CD, 16-378CD, 16-379CD, 16-380CD, 16381CD Chứng dương 389 393 386 Hình chạy mẫu 16-382CD, 16-383CD, 16-384CD, 16-385CD, 16-386CD, 16387CD, 16-388CD, 16-389CD, 16-390CD, 16-391CD, 5616-392CD, 16-393CD, 16-394CD 36 Chứng dương Hình chạy mẫu 16-394CD, 16-395CD, 16-396CD, 16-397CD, 16-398CD, 16399CD, 16-400CD, 16-401CD, 16-402CD, 16-403CD, 16-404CD Chứng dương 418 419 Hình chạy mẫu 16-405CD, 16-406CD, 16-407CD, 16-408CD, 16-409CD, 16-410CD, 16-418CD, 16-419CD 37 ... GIÁO D C VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI H C CÔNG NGHỆ TP HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SO SÁNH VÀ CHỌN L C C C QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN CORYNEBACTERIUM DIPTHERIAE GÂY BỆNH BẠCH HẦU Ngành h c: C ng Nghệ... PCR chuẩn Realtime -PCR sử dụng mẫu dò giúp đ c đƣ c kết x c sau phản ứng kết th c Trên sở đó, đề tài “ So sánh chọn l c quy trình PCR phát vi khuẩn C. diphtheriae gây bệnh bạch hầu ” đƣ c th c. .. DT1 CGGGGATGGTGCTTCGCG Mồi DT2 CGCGATTGGAAGCGGGGT Mồi Tox1 ATCCACTTTTAGTGCGAGAACCTTCGTA Mồi Tox2 GAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAA 17 Kích thƣ c sản phẩm 910bp 248bp Bảng 3.2: C c c p mồi đầu dò đƣợc