Nhằm ứng dụng kỹ thuật khuếch đại chuỗi gen (PCR) để phát hiện vi khuẩn lao trên một số đối tượng khác nhau, nghiên cứu đã khảo sát 83 mẫu đàm được thu thập tại một số cơ sở y tế ở TP. HCM từ tháng 01/2001 đến tháng 10/2003. Nhóm chứng là 32 mẫu đàm thu được từ người đến tiêm phòng bệnh lao tại Viện Pasteur TP. HCM. Kết quả khảo sát cho thấy 100% (21/21) bệnh nhân lao cho kết quả PCR dương tính, trong khi chỉ có 90,47% (19/21) mẫu cho kết quả nuôi cấy dương tính.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập * Phụ Số * 2005 Nghiên cứu Y học PHẢN ỨNG PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO TRÊN MỘT SỐ ĐỐI TƯNG KHÁC NHAU Mai Nguyệt Thu Hồng*, Cao Minh Nga**, Huỳnh Thanh Bình*** TÓM TẮT Nhằm ứng dụng kỹ thuật khuếch đại chuỗi gen (PCR) để phát vi khuẩn lao số đối tượng khác nhau, khảo sát 83 mẫu đàm thu thập số sở y tế TP HCM từ tháng 01/2001 đến tháng 10/2003 Nhóm chứng 32 mẫu đàm thu từ người đến tiêm phòng bệnh lao Viện Pasteur TP HCM Kết khảo sát cho thấy 100% (21/21) bệnh nhân lao cho kết PCR dương tính, có 90,47% (19/21) mẫu cho kết nuôi cấy dương tính Ở nhóm nghi ngờ mắc bệnh lao 19,39% (8/46) mẫu bệnh phẩm có kết PCR dương tính, nhóm có tiếp xúc bệnh lao 15,35% (4/26) mẫu cho kết PCR dương tính nhóm chứng 6,25% (2/32) Ở tất nhóm này, kết nuôi cấy âm tính Kết cho thấy thử nghiệm PCR nhạy phương pháp nuôi cấy để phát vi khuẩn lao mẫu bệnh phẩm SUMMARY DETECTION OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ON DIFFERENT SUBJECTS BY PCR Mai Nguyet Thu Hong, Cao Minh Nga, Huynh Thanh Binh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol * Supplement of No * 2005: 68 – 72 The PCR test has been developed for detection of M tuberculosis on different subjects In order to apply this technique, we studied 93 sputum‘sample of the patients and tuberculosis contact group in the Health Centers in Ho Chi Minh city from 1/2001 to 10/2003 The control group is the BCG vaccination group in Pasteur Institute in HCM city The result showed that 100% (21/21) tuberculosis patients had the positive PCR test but only 90.47% (19/21) positive samples for the culture medium We also detected 17.39% (8/46) positive samples in high risk group, 15.35% (4/26) in tuberculosis contact group in applying the PCR test for detection the M tuberculosis And the ratio of positive samples of control group is 6.25% (2/32) In all these groups, the culture medium gave the negative result This result demonstrated that the PCR test is more sensitive than the culture technique for detection of Mycobacterium tuberculosis ĐẶT VẤN ĐỀ Lao bệnh truyền nhiễm có tỉ lệ mắc tử vong đứng hàng đầu giới Hơn 1/3 dân số giới nhiễm lao với 8,4 triệu ca mắc 1,9 triệu ca tử vong hàng năm 95% ca mắc 98% ca tử vong xảy nước chậm phát triển Sự bùng phát bệnh lao ngày gia tăng với xuất đại dòch HIV Các thống kê cho thấy 1/3 số bệnh nhân AIDS tử vong ca đồng nhiễm bệnh lao * Viện Pasteur TP HCM ** Bộ môn Vi sinh – Khoa Y – Đại Học Y Dược TP HCM *** Bộ môn Miễn dòch-Sinh lý bệnh – Khoa Y – Đại Học Y Dược TP HCM 68 Chuyên đề Y Học sở Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập * Phụ Số * 2005 Là bệnh có khả lây lan cao, việc phát điều trò bệnh lại đòi hỏi thời gian dài Phương pháp chẩn đoán xác áp dụng nuôi cấy vi khuẩn cần phải sau tháng xác đònh bệnh Phương pháp nhuộm soi vi khuẩn phát bệnh sớm, chẩn đoán trường hợp bệnh phẩm có chứa nhiều vi khuẩn dễ bỏ sót ca bệnh Vì vậy, nhiều phương pháp chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao ứng dụng nuôi cấy bệnh phẩm môi trường lỏng, xác đònh vi khuẩn phương pháp phát đoạn gen đặc hiệu……, chưa phải tiêu chuẩn vàng để xác đònh trường hợp dương tính Do đó, cần có thêm nghiên cứu thực nghiệm để làm sở xác đònh độ nhạy, độ đặc hiệu giá trò tiên đoán phương pháp đối tượng nghiên cứu khác Để góp phần vào nghiên cứu thực nghiệm này, đề tài khảo sát tỉ lệ phát vi khuẩn lao phương pháp phát đoạn gen đặc hiệu IS6110 mẫu bệnh phẩm đàm đối tượng khác Từ so sánh tỉ lệ phát vi khuẩn phương pháp nuôi cấy cổ điển (được đánh giá tiêu chuẩn vàng) chẩn đoán hình ảnh X Quang phim phổi Khảo sát xác đònh độ đặc hiệu, độ nhạy cảm giá trò tiên đoán thử nghiệm phát chuỗi gen đối tượng nghiên cứu góp thêm sở liệu cho nhà lâm sàng ứng dụng phương pháp chẩn đoán MỤC TIÊU Đề tài "Phản ứng khuếch đại chuỗi gen (PCR) để phát vi khuẩn lao số đối tượng khác nhau” nhằm mục đích sau đây: -Xác đònh tình trạng nhiễm vi khuẩn M tuberculosis mẫu đàm phương pháp PCR, phương pháp nuôi cấy chẩn đoán hình ảnh bệnh nhân lao, nhóm nghi ngờ mắc bệnh lao, người tiếp xúc bệnh nhân lao người lành (không có phản ứng lao tố tiêm phòng bệnh lao) -Xác đònh độ tin cậy, độ đặc giá trò Vi Sinh tiên đoán phương pháp PCR bệnh nhân lao, nhóm nghi ngờ mắc bệnh lao, người tiếp xúc bệnh nhân lao người lành (không có phản ứng lao tố tiêm phòng bệnh lao) ĐỐI TƯNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu Gồm 125 cá thể thuộc nhóm đối tượng sau: -Bệnh nhân lao xác đònh bệnh viện Phạm Ngọc Thạch (n=21) -Nhóm nghi ngờ mắc bệnh lao: có biểu lâm sàng sốt, ho dai dẳng, có tiền sử tiếp xúc với bệnh nhân lao, phản ứng lao tố 15mm (n=46) -Nhóm tiếp xúc thường xuyên với bệnh nhân lao (n=26) -Nhóm chứng: có phản ứng lao tố âm tính tiêm phòng vắcxin phòng bệnh lao (n=32) Phương pháp nghiên cứu Đây nghiên cứu mô tả cắt ngang Chúng tiến hành lấy mẫu đàm vào lúc sáng sớm Bệnh nhân kích thích ho khạc đàm để xét nghiêm Mẫu đàm chứa lọ vô trùng chuyển đến phòng thí nghiệm vòng Mẫu đàm bảo quản –20oC trước tiến hành thí nghiệm Xử lý bệnh phẩm(1,6) - Tách chất nhày, huyết tương bệnh phẩm đàm proteinase K - Ủ cách thủy 600C qua đêm Chẩn đoán lâm sàng Bệnh nhân nghi ngờ có biểu lâm sàng bệnh lao có triệu chứng sau (tiêu chuẩn chẩn đoán lâm sàng chương trình chống lao quốc gia): -Sốt 38oC kéo dài tuần -Ho dai dẳng tháng -Phản ứng lao tố 15mm -Tốc độ lắng máu sau 100mm 69 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập * Phụ Số * 2005 Hình ảnh X Quang Nghiên cứu Y học Bảng Đặc tính mẫu nghiên cứu (n=125) Phim phổi có tổn thương dạng lao phổi tiến triển (kết luận khoa X Quang bệnh viện Lao bệnh phổi Phạm Ngọc Thạch) Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Đặc tính mẫu 6) đoạn gen đặc hiệu - Ly trích DNA tế bào M tuberculosis phương pháp Boom - Thử nghiệm PCR thực với PCR mix có đoạn mồi (primers) Pt18 INS2 đặc hiệu cho M tuberculosis Sử dụng sinh phẩm hãng AB gene, tự pha chế PCR mix Phòng Y Sinh học Đại học Y Dược TP HCM - Phản ứng PCR thực máy luân nhiệt (thermal cycler) hãng Bio-Rad, theo chương trình cài đặt gồm bước sau: Chu kỳ 1: (x1) Nam 54 43,2 Nữ 71 56,8 – 10 16 12,8 11 – 20 16 12,8 21 – 30 22 17,6 Tuoåi 31 – 40 20 16,0 41 – 23 18,4 51 – 60 14 11,2 61 – 70 6,4 71 – 80 4,8 Chẩn đoán lâm sàng Bảng Chẩn đoán lâm sàng có triệu chứng lao phổi tiến triển Nhóm đối tượng Số ca khảo Số ca chẩn đoán lâm Tỉ lệ sát sàng dương tính (%) Bước 1: 400C; x: 10 phút Bệnh nhân lao 21 21 100 Chu kỳ 2: (x40) Nghi ngờ mắc bệnh lao 46 46 100 Bước 2: 650C; x: phút Tiếp xúc bệnh nhân lao 26 0 Bước 3: 720C; x: phút Nhóm chứng 32 0 Tổng cộng 125 Bước 1: 94 C; x: phút 30 giây Chu kỳ 3: (x1) Bước 1: 720C; x: 60 phút Đọc kết Bằng cách xác đònh sản phẩm PCR qua điện di thạch agarose 1,5% có ethidium bromide Dùng phần mềm Excel để xử lý số liệu KẾT QUẢ Đặc tính mẫu nghiên cứu Trong 125 bệnh nhân nghiên cứu có 54 nam (43,2%) 71 nữ (56,8%) Thuộc lứa tuổi từ đến 74 (bảng 1) 70 Tỉ lệ (%) Giới Nuôi cấy vi khuẩn môi trường Lowenstein Jensen (theo phương pháp chẩn đoán chương trình chống lao quốc gia) Phương pháp PCR(1, IS6110 Số ca Chẩn đoán X quang phổi có hình ảnh lao phổi tiến triển Bảng Chẩn đoán X quang có hình ảnh lao phổi tiến triển Nhóm đối tượng Số ca Số ca chẩn đoán X Tỉ lệ khảo sát quang dương tính (%) Bệnh nhân lao 21 21 100 Nghi ngờ mắc bệnh lao 46 0 Tiếp xúc Bệnh nhân lao 26 0 Nhóm chứng 32 0 Tổng cộng 125 Chuyên đề Y Học sở Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập * Phụ Số * 2005 Nghiên cứu Y học Chẩn đoán nuôi cấy vi khuẩn lao môi trường Lowenstein Jensen Bảng Chẩn đoán nuôi cấy vi khuẩn lao môi trường Lowenstein Jensen Số ca Số ca nuôi cấy vi Tỉ lệ khảo sát khuẩn dương tính (%) Nhóm đối tượng Bệnh nhân lao 21 19 90,47 Nghi ngờ mắc bệnh lao 46 0 Tiếp xúc bệnh nhân lao 26 0 Nhóm chứng 32 0 Tổng cộng 125 Chẩn đoán phát đoạn gen IS6110 Bảng Chẩn đoán phát đoạn gen IS6110 Nhóm đối tượng Số ca khảo Số ca phát đoạn Tỉ lệ (%) sát gen IS6110 Bệnh nhân lao 21 21 100 Nghi ngờ mắc bệnh lao 46 17,39 Tiếp xúc bệnh nhân lao 26 15,35 Nhóm chứng 32 6,25 Tổng cộng 126 Phân tích kết phát chuỗi gen Bảng Chẩn đoán phát đoạn gen IS6110 Nhóm bệnh lao Nhóm không mắc lao Tổng số PCR dương tính 21 14 35 PCR âm tính 90 90 Tổng số 21 104 135 Từ kết trên, cho thấy: -Độ nhạy phản ứng phát chuỗi gen 100% -Độ đặc hiệu phản ứng phát chuỗi gen 86,35% -Giá trò tiên đoán dương phản ứng phát chuỗi gen 60% -Giá trò tiên đoán âm phản ứng phát chuỗi gen 100% Vi Sinh BÀN LUẬN Ứng dụng kỹ thuật để phát nhanh vi khuẩn lao cần thiết chiến lược phòng ngừa lây nhiễm vi khuẩn lao điều trò kòp thời bệnh lao Thực vậy, khả lây lan nhanh qua đường hô hấp, khả ký sinh nội tế bào vi khuẩn tính đề kháng đa kháng sinh nên điều trò bệnh lao đòi hỏi nhiều thời gian, có tỉ lệ thất bại điều trò Vì vậy, việc tìm phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh lao có giá trò góp phần giảm tỉ lệ mắc tử vong bệnh lao, tình hình đại dòch HIV Kết khảo sát vi khuẩn lao 125 mẫu đàm phản ứng khuếch đại chuỗi gencho thấy: -Độ nhạy phản ứng: 100% -Độ đặc hiệu: 86,35% -Giá trò tiên đoán dương: 60% -Giá trò tiên đoán âm: 100% Căn kết cho thấy 21/21 (100%) trường hợp bệnh lao phát phản ứng PCR Tuy nhiên, độ đặc hiệu phản ứng chưa cao Đối với trường hợp không bò bệnh lao, có 14/125 trường hợp cho kết dương tính giả Điều giống với kết nghiên cứu số tác giả khác(1, 5, 6) giải thích sau: -8 trường hợp có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ bệnh lao, không phát hình ảnh X Quang, trường hợp có tiếp xúc với bệnh nhân lao trường hợp thuộc nhóm chứng Chúng nhận thấy đối tượng thuộc nhóm chứng, trường hợp lại thuộc nhóm nguy cao dễ có khả phát bệnh Vì vậy, PCR dương tính với vi khuẩn lao dấu hiệu để giúp nhà lâm sàng dòch tễ quan tâm nhiều đến đối tượng đề nghò chiến lược điều trò phòng chống bệnh -2 trường hợp dương tính thuộc nhóm chứng bệnh nhân có tiếp xúc với người bệnh 71 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập * Phụ Số * 2005 Nghiên cứu Y học hoàn toàn số đề xuất sau: -Cỡ mẫu nghiên cứu chưa đại diện chưa đủ kết xác Số lượng mẫu nhóm đối tượng chưa phù hợp Vì vậy, cần thực thêm nghiên cứu dựa sở nghiên cứu ban đầu này, để có số liệu đầy đủ xác -Trên sở nghiên cứu thăm dò này, nên tiến hành với cỡ mẫu đầy đủ để thu kết xác Giá trò tiên đoán âm 100%, nên tất trường hợp PCR âm tính cho kết khẳng đònh không nhiễm vi khuẩn lao -Phổ biến kỹ thuật chẩn đoán đến phòng thí nghiệm vi sinh để giúp nhà lâm sàng có đònh hướng sớm chẩn đoán điều trò Giá trò tiên đoán dương có 60%, nên phản ứng PCR dương tính chưa thể chắn bệnh nhân bò lao Tuy nhiên, từ kết nghiên cứu khẳng đònh bệnh nhân thuộc nhóm nguy cao, cần phải theo dõi -Quan tâm đặc biệt đến đối tượng có phản ứng PCR dương tính nhóm có nguy cao, dễ phát bệnh TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN Qua nghiên cứu “PCR phát vi khuẩn lao số đối tượng khác nhau”, có kết luận sau đây: -Độ nhạy phản ứng: 100% -Độ đặc hiệu: 86,35% -Giá trò tiên đoán dương: 60% -Giá trò tiên đoán âm: 100% Tuy độ đặc hiệu chưa cao, nhóm có phản ứng PCR dương tính thuộc nhóm có nguy cao, cần có kế hoạch chăm sóc sức khỏe Từ công trình nghiên cứu này, có 72 Thierry D, Chureau C, Aznar C, Luc Guesdon J (1992) The detection of M tuberculosis in uncultured clinical specimens using the polymerase chain reaction and a non-radioactive DNA probe Kaplan JE et al (1998) Opportunistic Infections in Immunodeficient Populations Emerging Infectious Disease (3): 421-422 Centers for Disease Control Kolk A.H.J., Kox L.F.F., Van Leeuwen J and Kuijper (1996) PCR assay for Mycobacterium tuberculosis complex and other Mycobacteria Department of Biomedical Research, Royal Tropical Institute Amsterdam The Netherlands Memish ZA, Mah MW, Mahmooh SA et al (2000) Clinico – diagnostic experience with tuberculosis lymphadenitis in Saudi Arabia Clin Microbiol Infect 2000 Mar; 63: 137-41 Vivan J., Alden MJ., Curry JI., Keichii K., Knott CA, Roger L., Wolfe JM., Moore DF (1993) Detection and identification of M tuberculosis directly from sputum sediments by amplification of rRNA Nguyễn Ngọc Lan (2001) Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) chẩn đoán lao Luận án Tiến só Y học TP Hồ Chí Minh Chuyên đề Y Học sở ... chuỗi gen đối tượng nghiên cứu góp thêm sở liệu cho nhà lâm sàng ứng dụng phương pháp chẩn đoán MỤC TIÊU Đề tài "Phản ứng khuếch đại chuỗi gen (PCR) để phát vi khuẩn lao số đối tượng khác nhau nhằm... hiệu phản ứng phát chuỗi gen 86,35% -Giá trò tiên đoán dương phản ứng phát chuỗi gen 60% -Giá trò tiên đoán âm phản ứng phát chuỗi gen 100% Vi Sinh BÀN LUẬN Ứng dụng kỹ thuật để phát nhanh vi khuẩn. .. dương tính nhóm có nguy cao, dễ phát bệnh TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN Qua nghiên cứu PCR phát vi khuẩn lao số đối tượng khác nhau , có kết luận sau đây: -Độ nhạy phản ứng: 100% -Độ đặc hiệu: 86,35%