Bài viết này được nghiên cứu với mục tiêu nhằm hoàn thiện kỹ thuật LAMP-PCR phát hiện gen đích của Mycobacterium tuberculosis. Phương pháp nghiên cứu: 15 mẫu bệnh phẩm đờm của bệnh nhân (BN) lao được xác định, thiết kế mồi trên cơ sở trình tự chèn lặp lại IS6110 như một gen đích cho phản ứng LAMP. Kiểm tra kết quả bằng realtime-PCR, điện di trên gel agarose.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO BẰNG LAMP Triệu Tiến Sang*; Trần Văn Khoa*; Nguyễn Duy Bắc* TÓM TẮT Sự phát triển kỹ thuật làm tăng độ nhạy phát vi khuẩn lao, ưu tiên hàng đầu nghiên cứu phát mầm bệnh lao nhiều năm qua bệnh lao mối đe dọa lớn tới sức khỏe Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt đoạn vòng lặp kiểu k p tóc (LAMP - loop-mediated isothermal amplification) phương pháp phát axít nucleic, sử dụng nơi khơng có trang thiết bị đắt tiền Mục tiêu: hoàn thiện kỹ thuật LAMP-PCR phát gen đích Mycobacterium tuberculosis Phương pháp: 15 mẫu bệnh phẩm đờm bệnh nhân (BN) lao xác định, thiết kế mồi sở trình tự chèn lặp lại IS6110 gen đích cho phản ứng LAMP Kiểm tra kết realtime-PCR, điện di gel agarose Kết quả: hồn thiện quy trình LAMP-PCR để phát vi khuẩn lao * Từ khoá: Vi khuẩn lao; Kỹ thuật LAMP Initial Results of using Lamp in Mycobacterium Tuberculosis Detection Summary Developing techniques to improve sensitivity in Mycobacterium tuberculosis detection is one of the international research priorities recently, because TB remains globally a major health threat Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a new nucleic acid detection method that can be used in laboratories without expensive equipments Objectives: To develop the LAMP-PCR technique for detecting target genes of Mycobacterium tuberculosis Subjects and methods: 15 specimens of sputum specimens of TB patients were identified, primer design based on repeat sequence IS6110 as target gene for LAMP-PCR Examine the results using realtime-PCR and electrophoresis on agarose gel Results: We have completed the LAMP-PCR process for Mycobacterium tuberculosis detection * Keywords: Mycobacterium tuberculosis; LAMP technique ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, bệnh lao nguyên nhân thứ hai gây tử vong tác nhân nhiễm trùng đơn lẻ Chẩn đoán nhanh hiệu bệnh lao vấn đề quan trọng việc phòng chống bệnh tồn cầu [4 Do tính đơn giản chi phí thấp nên phương pháp soi dịch đờm kỹ thuật chẩn đoán thường quy cho bệnh lao nước phát triển * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Duy Bắc (bac_hvqy@yahoo.com) Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 30/08/2017 Ngày báo đăng: 04/09/2017 330 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Tuy nhiên, kỹ thuật có độ nhạy thấp Xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn cho độ nhạy cao tiêu chuẩn vàng, song nuôi cấy vi khuẩn phương pháp tốn thời gian, đòi hỏi kỹ thuật chuyên môn thực sở chuyên ngành Mặt khác, hình ảnh chụp X quang nhiều trường hợp không rõ ràng [5 Các kỹ thuật dựa PCR phương pháp hứa h n hấp dẫn so với phương pháp thông thường Tuy nhiên, khơng phải nơi có điều kiện thực hạn chế trang thiết bị, kỹ thuật Gần đây, kỹ thuật khuếch đại axít nucleic mơ tả, có tên LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) [6 LAMP có nhiều ưu điểm so với phương pháp PCR thông thường Thứ nhất, phản ứng LAMP thực nhiệt độ cố định (60 - 650C), điều giúp tiết kiệm thời gian thuận tiện khơng cần phải mua thiết bị đắt tiền Thứ hai, LAMP phản ứng đặc hiệu, sử dụng mồi khác nhận biết nhiều vùng khác biệt trình tự đích Thứ ba, kỹ thuật LAMP cho kết với hiệu suất cao tổng hợp sản phẩm khuếch đại, 50 lần so với phản ứng PCR thông thường thể tích Cùng với phản ứng khuyếch đại, ’ ’ lượng lớn muối kết tủa magiê pyrophosphat tạo sản phẩm phụ làm tăng độ đục hỗn hợp phản ứng, cho phép phát mắt thường đo độ đục Do đó, khơng cần thiết bị đòi hỏi tốn nhiều thời gian cho bước phát sau khuếch đại ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợngnghiên cứu 15 mẫu đờm lâm sàng lấy từ BN xác nhận mắc lao (TB), Trung tâm Phòng chống Lao Hà Nội cung cấp Tách ADN từ mẫu kít Qiagen, 10 ul ADN tách chiết sử dụng cho phản ứng LAMP điều kiện tối ưu Để kiểm soát nhiễm chéo, sử dụng đối chứng âm cho phản ứng lâm sàng mẫu Phƣơng pháp nghiên cứu * LAMP primer: Để phát triển kỹ thuật LAMP thành công, thiết kế mồi bước quan trọng Chúng tham khảo sử dụng trình tự mồi khác để nhân gen đích làm tăng độ đặc hiệu Đặc điểm primers ADN oligonucleotide sử dụng cho IS6110-LAMP phát Mycobacterium tuberculosis đây: Primer Tr nh tự (5 -3 ) Chiều dài Vị trí đích IS-FOP AGACCTCACCTATGTGTCGA 20-mer 812-831 IS-BOP TCGCTGAACCGGATCGA 17-mer 1029-1045 IS-FIP (F1c+F2) ATGGAGGTGGCCATCGTGGAAG 41-mer 904-925, 847-865 CCTACGTGGCCTTTGTCAC Sản phẩm (bp) 169 331 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 IS-BIP (B1c+B2) AAGCCATCTGGACCCGCCAA CCCCTATCCGTATGGTGGAT 40-mer 946-965, 996-1015 IS-FLP AGGATCCTGCGAGCGTAG 18-mer 872-889 IS-BLP AAGAAGGCGTACTCGACCTG 20-mer 967-986 Hình 1: Sơ đồ vị trí gắn mồi đoạn gen IS6110 M Tuberculosis ((A) Sơ đồ trình tự IS6110 đầy đủ mũi tên đen đậm đánh dấu vị trí: phần (A) cho thấy vùng khuếch đại đích PCR mồi nested PCR; phần (A) cho thấy vùng khác nhận diện primer LAMP Mồi xi bên ngồi (FOP) mồi ngược bên (BOP) tương ứng với trình tự vùng F3 B3 đích Mồi xi bên (FIP) chứa trình tự có nghĩa vùng F2 đầu 3’ kết nối trực tiếp với trình tự F1c (trình tự bổ sung tới trình tự F1) đầu 5’, mồi ngược bên (BIP) chứa trình tự có nghĩa vùng B2 đầu 3’ trực tiếp liên kết với B1c (bổ sung trình tự đến vùng B1) đầu 5’ Mồi xi vòng (FLP) mồi ngược vòng (BLP), chứa trình tự bổ sung cho phần trình tự F1 F2 vùng B1 B2 (B) Vị trí gắn mồi vị trí khuếch đại mồi LAMP đích 234bp chọn IS6110 Dấu (*) cho biết biến thể dựa chuỗi IS6110 chủng lao khác nhau) 332 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 * Phản ứng LAMP-PCR: Kỹ thuật LAMP tối ưu hóa thể tích tổng cộng 25 ul, sử dụng 15 ul Isothermal Master mix cho LAMP (OptiGene, Anh), 0,1% uM IS-FIP IS-BIP, 0,2 uM IS-FOP IS-BOP, 0,8 uM IS-FLP IS-BLP, mM dNTPs, mM MgSO4, 8U Bst ADN polymerase ul ADN khuôn từ mẫu tách chiết Phản ứng thực nhiệt độ tối ưu 650C 90 phút, kết thúc bất hoạt enzym 900C phút KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Để kiểm tra, đánh giá kết phản ứng LAMP, thông thường cần cách thức là: - Quan sát mắt thường thông qua biến đổi độ đục dung dịch phản ứng: mẫu dương tính cho màu trắng đục, mẫu âm tính có màu suốt - Quan sát sau nhuộm thuốc nhuộm huỳnh quang (thường dùng SYBR green I) bổ sung trực tiếp vào ống PCR: mẫu dương tính cho màu xanh, mẫu âm tính có màu vàng cam - Điện di agarose thường: mẫu dương tính cho kết băng điện di có dạng nhiều băng vạch giống thang chuẩn, mẫu âm tính có dạng dải smear ADN khuôn dimer Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng master mix có sẵn SYBR green I, kiểm tra máy realtime-PCR diện di gel agarose (khi áp dụng thực tế, không cần thiết bị realtime-PCR) Kết đánh giá qua điện di agarose Hình 2: Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP-PCR 15 mẫu nghiên cứu (M: thang ADN, 100 bp; (-) (+): mẫu chứng âm mẫu chứng dương; 1-15: 15 mẫu dương tính) Kết đánh giá qua tín hiệu huỳnh quang hệ thống realtime Độ nhạy cao kỹ thuật IS6110-LAMP phụ thuộc vào thời gian phản ứng khuếch đại Để khảo sát thời gian theo thời gian thực, chúng tơi khảo sát máy 333 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 realtime-PCR LAMP có đặc điểm diễn liên tục điều kiện đẳng nhiệt Vì vậy, chúng tơi xác định thời gian theo chu kỳ giả định, chu kỳ phản ứng tương đương với phút Hình 3: Hình ảnh LAMP-PCR hệ thống realtime (Ký hiệu trái (-) bên phải (+): mẫu chứng dương mẫu chứng âm; lại: mẫu bệnh phẩm lâm sàng) Hình ảnh cho thấy, hầu hết mẫu có tăng tín hiệu sau 20 phút, mẫu số 12 tăng tín hiệu sau 50 phút Trong đó, mẫu chứng âm sau 85 phút khơng thấy tăng tín hiệu huỳnh quang BÀN LUẬN Các kỹ thuật dựa LAMP với đích gyrB rrs gần mô tả nhằm phát vi khuẩn lao [1, Trong nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật LAMP để phát vi khuẩn lao dựa khuếch đại trình tự chèn 6110 (IS6110) IS6110, đặc trưng cho chủng M tuberculosis Hơn nữa, hầu hết thành viên vi khuẩn lao chứa nhiều IS6110, sử dụng gen mục tiêu làm tăng độ nhạy [7 Qua kết nhân gen kiểm tra điện di gel agarose (hình 2) cho thấy mẫu có dạng nhiều băng vạch, cấu trúc hình thang ADN đặc trưng 334 sản phẩm khuếch đại LAMP kết nhân lên kiểu vòng lặp Kích thước sản phẩm đoạn lặp phản ứng LAMP vào khoảng 169 bp (băng vị trí thấp gel) gel agarose, cho thấy khuếch đại đặc hiệu trình tự đích thiết kế Kết thể qua phản ứng LAMP thiết bị realtime cho thấy trùng lặp (hình 3) Bên cạnh việc tăng độ nhạy, lợi lớn khác kỹ thuật LAMP so với PCR nested-PCR thời gian tiến hành kỹ thuật, cần khoảng 1,5 để thực kỹ thuật LAMP-PCR so với 2,5 kỹ thuật PCR thường TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 khoảng kỹ thuật nestedPCR Ngoài ra, lượng ADN lớn sử dụng kỹ thuật LAMP, kết dương tính thu vòng 20 phút (hình 3) Do đó, xem xét cải tiến kỹ thuật LAMP cách kết hợp với thiết bị đo độ đục thời gian thực Điều cho phép thu kết xét nghiệm nhanh mẫu có lượng trực khuẩn cao tuberculosis: modern molecular epidemiology and perspectives In: Tibayrenc M, editor Encyclopedia of infectious diseases: modern methodologies Wiley-Liss, New Jersey 2007, pp.1-29 KẾT LUẬN Keeler E, Perkins MD, Small P, Hanson C, Reed S, Cunningham J et al Reducing the global burden of tuberculosis: the contribution of improved diagnostics Nature 2006, 444 (1), pp.49-57 Nghiên cứu cho thấy LAMP-PCR kỹ thuật rẻ tiền phát nhanh vi khuẩn laotrong điều kiện Việt Nam.Hiện tại, thực kỹ thuật MTB-LAMP số lượng lớn mẫu bệnh phẩm lâm sàng để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật TÀI LIỆU THAM KHẢO Boehme CC, Nabeta P, Henostroza G, Raqib R, Rahim Z, Gerhardt M et al Operational feasibility of using loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of pulmonary tuberculosis in microscopy centers of developing countries J Clin Microbiol 2007, 45 (6), pp.1936-1940 Godreuil S, Tazi L, Ban˜uls AL Pulmonary tuberculosis and Mycobacterium Iwamoto T, Sonobe T, Hayashi K Loopmediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M avium and M intracellulare in sputum samples J Clin Microbiol 2003, 41 (6), pp.2616-2622 Koppaka R, Bock N How reliable is chest radiography? In: Frieden T, editor Toman’s tuberculosis case detection, treatment and monitoring: questions and answers World Health Organization, Geneva 2004, pp.51-60 Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA Nucleic acids Res 2000, 28 (12), p.63 Thierry D, Brisson-Noel A, Vincent-LevyFrebault V, Nguyen S, Guesdon JL, Gicquel B Characterization of a Mycobactenum tuberculosis insertion sequence, IS6110 and its application in diagnosis J Clin Microbiol 1990, 28 (12), pp.2668-2273 335 ... huỳnh quang BÀN LUẬN Các kỹ thuật dựa LAMP với đích gyrB rrs gần mô tả nhằm phát vi khuẩn lao [1, Trong nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật LAMP để phát vi khuẩn lao dựa khuếch đại trình tự chèn 6110... 2006, 444 (1), pp.49-57 Nghiên cứu cho thấy LAMP- PCR kỹ thuật rẻ tiền phát nhanh vi khuẩn laotrong điều kiện Vi t Nam .Hiện tại, thực kỹ thuật MTB -LAMP số lượng lớn mẫu bệnh phẩm lâm sàng để đánh... trưng cho chủng M tuberculosis Hơn nữa, hầu hết thành vi n vi khuẩn lao chứa nhiều IS6110, sử dụng gen mục tiêu làm tăng độ nhạy [7 Qua kết nhân gen kiểm tra điện di gel agarose (hình 2) cho