Xác định một số vi khuẩn bằng kỹ thuật realtime PCR đa mồi và đặc điểm dịch tễ của bệnh nhi mắc tiêu chảy

Tiêu chảy là bệnh có tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong cao thường gặp ở trẻ nhỏ. Ước tính hàng năm tại các nước đang phát triển có khoảng 2 tỷ đến 4 tỷ đợt tiêu chảy xảy ra với tỷ lệ cao nhất ở trẻ dưới 5 tuổi. Nghiên cứu tiến hành xác định các vi khuẩn E.coli, Shigella, Campylobacter và mô tả một số đặc điểm dịch tễ trên bệnh nhi mắc tiêu chảy.

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH MỘT SỐ VI KHUẨN BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR ĐA MỒI VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA BỆNH NHI MẮC TIÊU CHẢY Phùng Thị Bích Thủy, Phạm Thu Hiền Bệnh viện Nhi Trung ương Tiêu chảy bệnh có tỷ lệ mắc tỷ lệ tử vong cao thường gặp trẻ nhỏ Ước tính hàng năm nước phát triển có khoảng tỷ đến tỷ đợt tiêu chảy xảy với tỷ lệ cao trẻ tuổi Nghiên cứu tiến hành xác định vi khuẩn E.coli, Shigella, Campylobacter mô tả số đặc điểm dịch tễ bệnh nhi mắc tiêu chảy Nghiên cứu thực 602 trẻ mắc tiêu chảy cấp độ tuổi từ tháng đến 15 tuổi điều trị bệnh viện Nhi Trung Ương từ 01/7/2017 đến 30/6/2018 Sử dụng kỹ thuật realtime PCR đa mồi xác định tác nhân vi khuẩn Kết nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ mắc tiêu chảy nhiễm khuẩn 11,13% tổng số tiêu chảy cấp nhập viện bao gồm Campylobacter(8,47%), Shigella(1,33%), E.coli(1,33%) 73% trẻ nhập viện 24 tháng tuổi Bệnh mắc hai giới nam nhiều nữ với tỷ lệ 1,58/1 Bệnh xuất quanh năm cao vào tháng đến tháng với tỷ lệ 41,8% Kỹ thuật realtime PCR đa mồi xác định vi khuẩn gây tiêu chảy mang lại hiệu chẩn đoán sớm điều trị trẻ em Từ khóa: realtime PCR đa mồi, vi khuẩn, tiêu chảy, trẻ em I ĐẶT VẤN ĐỀ Tiêu chảy bệnh có tỷ lệ mắc tỷ lệ tử vong cao thường gặp trẻ nhỏ Ước tính hàng năm nước phát triển có khoảng tỷ đến tỷ đợt tiêu chảy xảy với tỷ lệ cao trẻ tuổi [1] Theo tổ chức y tế giới hàng năm có khoảng 2,2 triệu ca tử vong tiêu chảy khiến bệnh tiêu chảy trở thành nguyên nhân gây tử vong nhiều thứ toàn giới [2] Trung bình trẻ tuổi mắc từ đến đợt tiêu chảy, chí có trẻ mắc đến đợt tiêu chảy năm [3] Tiêu chảy gây ảnh hưởng đến tăng trưởng trẻ gánh nặng không kinh tế mà Tác giả liên hệ: Phùng Thị Bích Thủy, Bệnh viện Nhi Trung Ương Email: thuyphung.nhp@gmail.com Ngày nhận: 31/01/2019 Ngày chấp nhận: 21/03/2019 102 tinh thần cho gia đình xã hội, đặc biệt quốc gia nghèo phát triển có Việt Nam [4] Nguyên nhân gây tử vong trẻ bị tiêu chảy nước điện giải, tiếp đến suy dinh dưỡng suy dinh dưỡng tiêu chảy tạo thành vòng xoắn bệnh lý: tiêu chảy dẫn đến suy dinh dưỡng suy dinh dưỡng lại dễ mắc tiêu chảy Trong năm qua, có nhiều biện pháp tích cực cơng tác phòng chống bệnh tiêu chảy, bệnh tiêu chảy xảy mức độ cao với nguyên nhân virus, vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm,… Trong số tác nhân vi khuẩn trẻ em, E.Coli chiếm tới 20%, Shigella chiếm từ 5% đến 10%, Campylobacter chiếm 5% đến 10% [5; 6] Các kỹ thuật xác định vi khuẩn gây tiêu chảy chủ yếu dựa vào nuôi cấy truyền thống PCR đơn mồi Nuôi cấy tiêu chuẩn vàng TCNCYH 119 (3) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC xác định nguyên gây bệnh nhiên việc sử dụng kháng sinh ức chế nuôi cấy đồng thời cho kết thời gian dài Một kỹ thuật ứng dụng giới real-time PCR đa mồi có hiệu cao sàng lọc sớm nguyên gây bệnh đem lại hiệu cao điều trị bệnh nhân tiêu chảy Chính chúng tơi tiến hành nghiên cứu xác định số nguyên vi khuẩn kỹ thuật real-time PCR đa mồi đặc điểm dịch tễ bệnh nhi mắc tiêu chảy với mục tiêu: xác định tác nhân vi khuẩn E.coli, Shigella, Campylobacter bệnh nhân tiêu chảyvà phân tích số đặc điểm dịch tễ bệnh nhân nhiễm vi khuẩn tiêu chảy II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng 602 mẫu bệnh phẩm phân trẻ em có độ tuổi từ tháng đến 15 tuổi chẩn đoán điều trị tiêu chảy cấp theo tiêu chuẩn Tổ chức Y tế giới (WHO) [7] điều trị bệnh viện Nhi Trung Ương từ 01/7/2017 đến 30/6/2018 Phương pháp Nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp phân tích tiến cứu xác định tần suất nhiễm vi khuẩn bệnh nhi Mẫu bệnh phẩm phân sau thu nhận khoa lâm sàng chuyển tới khoa Nghiên cứu Sinh học phân tử bệnh truyền nhiễm để thực phản ứng real-time PCR TCNCYH 119 (3) - 2019 đa mồi Vật chất di truyền vi khuẩn tách chiết theo kit MagNA Pure LC Total Nucleic acid Isolation Kit- Roche hệ thống máy tách chiết tự động MagNA Pure LC 2.0 (Roche) Quá trình chạy real-time PCR đa mồi thực hệ thống ABI 7500 xác định E.coli, Shigella, Campylobacter theo hệ thống primer probe tác giả Kabayiza cộng [8] Kỹ thuật real-time PCR đa mồi xác định tác nhân vi khuẩn E.coli gồm gen vtx2, est, vtx1 elt, Shigella, Campylobacter, kỹ thuật real-time sử dụng mồi oligonucleotide probe thủy phân đánh dấu kép (dual labeled hydrolysis probes) (Taqman) theo nguyên lý real-time PCR nhằm phát định tính in vitro E.coli, Shigella, Campylobacter III KẾT QUẢ Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn E.coli, Shigella, Campylobacter Nghiên cứu tiến hành kỹ thuật realtime PCR đa mồi xác định E.coli, Shigella, Campylobacter thực với 602 mẫu thu kết dương tính 67 trường hợp chiếm 11,13% âm tính với tác nhân vi khuẩn 535 trường hợp chiếm 88,87% Các tác nhân vi khuẩn được phân loại theo bảng Trong 67 trường dương tính, Campylobacter có 51 trường hợp chiếm 8,47%, Shigella E.coli có trường hợp chiếm 1,33% 103 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli, Shigella, Campylobacter bệnh nhi tiêu chảy Tác nhân Số lượng (N) Tỷ lệ % Campylobacter 51 8,47% Shigella 1,33% E.coli 1,33% Tổng 602 100% Một số đặc điểm dịch tễ học 2.1 Phân bố tác nhân E.coli, Shigella, Campylobacter theo tuổi Phân bố theo nhóm cuổi tác nhân E.coli, Shigella, Campylobacter trình bày bảng Kết cho thấy, độ tuổi thường gặp tác nhân nằm khoảng từ tháng đến 60 tháng với 19 trường hợp - 12 tháng, 20 trường hợp từ 13 - 24 tháng 17 trường hợp 25 60 tháng Bảng 2: Phân bố tác nhân E.coli, Shigella, Campylobacter theo tuổi Nhóm tuổi (tháng) Số lượng (N) Tỷ lệ % 0-6 10 15% - 12 19 28,1% 13 - 24 20 29,9% 25 - 60 17 25,5% > 60 1,5% Tổng 67 100% P < 0,05 2.2 Phân bố tác nhân E.coli, Shigella, Campylobacter theo giới Nghiên cứu cho thấy tác nhân vi khuẩn gây tiêu chảy trẻ nam nhiều trẻ nữ với 61,2% (41 trường hợp) trẻ nữ 38,8% (26 trường hợp) Kết trình bày biểu đồ Biểu đồ Phân bố tác nhân E.coli, Shigella, Campylobacter theo giới 104 TCNCYH 119 (3) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2.3 Phân bố tác nhân E.coli, Shigella, Campylobacter theo mùa Nghiên cứu cho thấy bệnh nhi tiêu chảy nhiễm vi khuẩn E.coli, Shigella, Campylobacter chủ yếu gặp nhiều nhât vào tháng - với 28 trường hợp, tiếp đến từ tháng - với 20 trường hợp tháng 10 - 12 gặp 16 trường hợp Các tác nhân vi khuẩn gặp vào tháng - với trường hợp Kết trình bày bảng Bảng Phân bố tác nhân E.coli, Shigella, Campylobacter theo mùa Tháng Số lượng (N) Tỷ lệ % 1-3 20 29,85% 4-6 28 41,8% 7-9 4,48% 10 - 12 16 23,87% Tổng 67 100% IV BÀN LUẬN Nghiên cứu tiến hành 602 trẻ chẩn đoán tiêu chảy cấp bệnh viện Nhi Trung ương từ 01/07/2017 đến 30/06/2018 Dựa sở tài liệu tham khảo tác giả Kabayiza cộng chúng tơi có tiến hành cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm Theo nghiên cứu tác giả, thực phát đơn lẻ tác nhân ống phản ứng Tuy nhiên cải tiến phát ba gen tác nhân ống phản ứng chạy chương trình gồm: Hỗn hợp 1: Campylobacter, Shigella spp.và E.coli (vtx2); Hỗn hợp 2: E.coli (est), E.coli (vtx1) E.coli (elt) dựa tín hiệu huỳnh quang khác Kết thực đơn mồi đa mồi không khác biệt, việc ứng dụng kỹ thuật realtime PCR đa mồi cho phép xác định nhiều tác nhân thời gian có giá trị sàng lọc sớm đồng thời giảm chi phí tiêu hao máy móc nhân lực Ứng dụng kỹ thuật realtime PCR đa mồi có ý nghĩa sàng lọc sớm so với kỹ thuật nuôi cấy truyền thống thường cho kết sau - ngày phát bệnh nhân sử dụng kháng sinh TCNCYH 119 (3) - 2019 P > 0,05 Chúng nhận thấy tỉ lệ trẻ mắc tiêu chảy nhiễm khuẩn 11,13% tổng số 602 trẻ mắc tiêu chảy cấp, với Campylobacter chiếm 8,47%, Shigella chiếm 1,33%, E.coli chiếm 1,33% Kết nghiên cứu chúng tơi có tỷ lệ tiêu chảy nhiễm khuẩn tương đồng với nghiên cứu bệnh viện Nhi Đồng Hà Nội Theo tác giả Phạm Thị Ngọc Tuyết cộng [10] thực nghiên cứu 632 bệnh nhân tiêu chảy cấp bệnh viện Nhi Đồng năm 2005 nhận thấy tỷ lệ mắc tiêu chảy nhiễm khuẩn chiếm 10,8% tổng số trẻ tiêu chảy cấp nhập viện điều trị Theo tác giả Nguyễn Vũ Trung cộng [9] thực hiên nghiên cứu nguyên nhân dịch tễ học tiêu chảy cấp trẻ em Hà Nội năm 2006 nhận thấy tỷ lệ tiêu chảy nhiễm khuẩn Campylobacter > 4%, Shigella 3% đến 9%, E.coli 1% đến 9% Tuy nghiên nghiên cứu lại thấp so với tác giả Ajjampur cộng [6] thực nghiên cứu miền nam Ấn Độ cho thấy tỷ lệ tiêu chảy nhiễm khuẩn Campylobacter Shigella 5% đến 10%, E.coli chiếm 20% Với kết nghiên cứu cho thấy tiêu chảy vi khuẩn có tỷ lệ cao bệnh nhi Campylobacter có tỷ 105 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC lệnh nhiễm cao so với Shigella E.coli có khả lây trực tiếp từ thức ăn có chứa vi khuẩn thịt, sữa, nước sinh hoạt, bên cạnh chúng vi khuẩn hiếu khí có khả di động có tiên mao, ngưỡng gây bệnh chúng cao khoảng 500 tế bào đủ khả gây bệnh khả gây bệnh chúng cao vi khuẩn khác E.coli chủ yếu sống trực tràng chủ yếu truyền bệnh qua phân người động vật, Shigella khơng sinh bào tử khơng có khả di động khả lây nhiễm Chính vậy, việc xác định tỷ lệ có ý nghĩa việc điều trị kháng sinh phù hợp đồng thời khuyến cáo việc giữ vệ sinh ăn uống môi trường sinh hoạt cho trẻ cộng đồng Đặc điểm dịch tễ học cho thấy, bệnh nhân mắc tiêu chảy bệnh viện Nhi Trung ương gặp lứa tuổi, nhiều trẻ 24 tháng với tỷ lệ 87%, trẻ từ - 24 tháng chiếm 57% Kết tương đồng với số tác giả Nguyễn Vũ Trung cộng [9] nghiên cứu nguyên nhân dịch tễ học bệnh tiêu chảy cấp trẻ em Hà Nội năm 2006 thấy tỷ lệ tiêu chảy nhiễm khuẩn trẻ 24 tháng chiếm 71% với 41% trẻ 12 tháng tác giả Phan Thị Ngọc Tuyết cộng [10] tỷ lệ trẻ mắc tiêu chảy lứa tuổi 36 tháng chiếm tới 93,3% lứa tuổi 12 tháng chiếm 50,1% Từ kết cho thấy trẻ từ đến 24 tháng tuổi hay bị mắc bệnh tiêu chảy trẻ tập ăn dặm, giảm kháng thể mẹ truyền, kháng thể chủ động chưa có (nếu khơng sử dụng vắc xin phòng bệnh), nguy tiếp xúc mầm bệnh tăng lên trẻ biết bò tăng hoạt động cá nhân môi trường sống Phân bố tác nhân vi khuẩn E.coli, Shigella Campylobacter theo giới cho thấy tỷ lệ tiêu chảy nhiễm khuẩn nam cao 106 nữ với 61,2% so với 38,8% Kết giống số nghiên cứu khác khác biệt thống kê phân bố theo giới nam nữ tiêu chảy trẻ em [8 - 10] Kết chênh lệch tỷ lệ sinh trẻ nam nhiều trẻ nữ ảnh hưởng quan niệm phương Đông coi trọng nam nữ xã hội, nhiên phân bố mang tính ngẫu nhiên chưa có tính thống kê rõ ràng Trong nghiên cứu, bệnh tiêu chảy nhiễm khuẩn xảy quanh năm xảy nhiều vào tháng mùa hè từ tháng đến tháng với tỷ lệ lên đến 41,8% sau tháng đến tháng với tỷ lệ 29,85% Điều tương đồng với nghiên cứu tác giả Phan Thị Ngọc Tuyết [10] bệnh thường tập chung vào tháng đầu năm Như nói tiêu chảy cấp vi khuẩn miền bắc Việt Nam giống nước nhiệt đới gặp tất tháng năm nhiều tháng đầu năm, mùa lễ hội hay mùa hè lúc thời tiết có nhiều thay đổi khí hậu thường nóng ẩm thích hợp với phát triển vi khuẩn Chính cần có biện pháp phòng bệnh, vệ sinh mơi trường, tun truyền trường học gia đình tốt mùa để giảm tỷ lệ tiêu chảy trẻ em V KẾT LUẬN Qua nghiên cứu 602 bệnh nhân mắc tiêu chảy cấp điều trị khoa phòng bệnh viện Nhi Trung ương thời gian từ 01/07/2017 đến 30/06/2018 Đề tài rút số kết luận sau: - Tỷ lệ mắc tiêu chảy nhiễm khuẩn xác định kỹ thuật realtime PCR đa mồi vi khuẩn 11,13% tổng số tiêu chảy cấp nhập viện bao gồm Campylobacter (8,47%), Shigella (1,33%), E.coli (1,33%) - 73% trẻ nhập viện 24 tháng tuổi Bệnh mắc hai giới nam nhiều TCNCYH 119 (3) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nữ với tỷ lệ 1,58/1 Bệnh xuất quanh năm cao vào tháng đến tháng với tỷ lệ 41,8% - Kỹ thuật realtime PCR đa mồi có khả phát sớm tác nhân gây tiêu chảy bên cạnh kỹ thuật truyền thống khác Lời cảm ơn Chúng chân thành cảm ơn tập thể cán khoa Nghiên cứu Sinh học phân tử bệnh truyền nhiễm, Bệnh viện Nhi Trung ương nơi thực thu thập số liệu nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Kosek M et al (2003).The global burden of diarrheal disease, as estimated from studies published between 1992 and 2000 Bull World Health Organ 81: 197–204 WHO (2001) Assainissement et diarrhée Agir contre les infections 2: 1–2 Bộ môn Nhi, Trường đại học Y Hà Nội (2009) Bệnh tiêu chảy cấp, Bài giảng Nhi khoa, tập Nhà xuất Y học, tr.223-41 Corinne N Thompson, et al (2015) A Prospective Multi Center Observational Study of Children Hospitalized with Diarrhea in Ho Chi Minh City, Vietnam" Am J Trop Me Hyg., 92(5), pp 1045-1052 Bhutta ZA Kliegman S, St.Geme, Schor B (2011) Acute gastroenteritis in children In: Nelsontextbook of pediatrics 19th ed Philadelphia: Elsevier Saunders, pp 1323–38 Ajjampur SS, Sankaran P, Kannan A, et al (2009) Giardia duodenalis assemblages associated with diarrhea in children in South India identified by PCR-RFLP Am J Trop Med Hyg, 80:16–9 Tổ chức y tế giới (2007) Kỹ giám sát điều trị tiêu chảy, chương trình phòng chống bệnh tiêu chảy Kabayiza JC, Andersson ME, Nilsson S, Baribwira C, Muhirwa G, Bergström T, Lindh M (2014) Diarrhoeagenic microbes by real-time PCR in Rwandan children under years of age with acute gastroenteritis Clin Microbiol Infect Nguyen, T V., et al (2006) Etiology and epidemiology of diarrhea in children in Hanoi, Viet Nam, Int J Infect Dis, 10(4), 298308 10 Phạm Thị Ngọc Tuyết, Nguyễn Đỗ Nguyên Cộng (2005) Bệnh tiêu chảy cấp Bệnh viện Nhi Đồng Tp HCM năm 2005: Lâm sàng dịch tễ học Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, Tập 10, Phụ số Summary DETERMINATION OF BACTERIA BY REALTIME PCR TECHNIQUE AND CHARACTERISTICS OF EPIDEMIOLOGY IN DIARHEA CHILDREN Diarrhea is a disease that has a high incidence and mortality rate in young children There are about billion to billion cases of diarrhea that occur in developing countries, with the highest rate in children under years old The objectives were to determine the prominent species of bacteria in diarrheal patients and analyze the important epidemiological characteristics in these patients This study recruited 602 children with diarrhea aged month to 15 years admitted to the National Children’s Hospital from 01/7/2017 to 30/6/2018 The mutiplex realtime PCR technique was used to identify bacterial pathogens in stool specimens The ratio of male to female cases was 1.58:1 The TCNCYH 119 (3) - 2019 107 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC application of multiplex realtime PCR detected 11 13% bacteria infections including Campylobacter (8.47%), Shigella (1.33%), E.coli (1.33%) 73% were hospitalized under 24 months The disease occurs during in the year but the highest in April to June with the rate of 41.8% Multiplex Realtime PCR technnique can detect bacteria which cause diarrhea and is effective in diagnosing bacterial disease in children Key words: multiplex realtime PCR, bacteria, diarhea, children 108 TCNCYH 119 (3) - 2019 ... điều trị bệnh nhân tiêu chảy Chính tiến hành nghiên cứu xác định số nguyên vi khuẩn kỹ thuật real-time PCR đa mồi đặc điểm dịch tễ bệnh nhi mắc tiêu chảy với mục tiêu: xác định tác nhân vi khuẩn. .. phòng bệnh vi n Nhi Trung ương thời gian từ 01/07/2017 đến 30/06/2018 Đề tài rút số kết luận sau: - Tỷ lệ mắc tiêu chảy nhi m khuẩn xác định kỹ thuật realtime PCR đa mồi vi khuẩn 11,13% tổng số tiêu. .. E.coli, Shigella, Campylobacter bệnh nhân tiêu chảyvà phân tích số đặc điểm dịch tễ bệnh nhân nhi m vi khuẩn tiêu chảy II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng 602 mẫu bệnh phẩm phân trẻ em có độ tuổi