Kính Hiển vi điện tử trong nghiên cứu khoa học sự sống: Phần 1

Phần 1 cuốn sách cung cấp cho người học các kiến thức: Lịch sử khoa học hiển vi và cơ sở vật lý của hiển vi điện tử, kính hiển vi điện tử truyền qua, phương pháp làm tiêu bản hiển vi điện tử truyền qua, kính hiển vi điện tử quét. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Trang 2

NGUYEN KIM GIAO

HIEN VI DIEN TU

TRONG KHOA HOC SU SONG

(Sách dùng cho cóc trường đợi học)

Trang 3

Hiển ví điện tư là một môn học đã được đưa vào giảng, dạy cho các lớp sa dai học thuộc các chuyên ngành về hình thái học, vỉ sinh vật học trong,

nÏững năm gần dây

Cuốn sách *Hiển vi điện tư trong khoa học sự sống” được biên soạn

nhìn cũng cấp những kiến thức rất cơ bản về hiển vì điện tử và các

phương pháp nghiên cứu hiển vi điện tử trên các tổ chức sống từ mô, tế bọ đến các ví khuẩn, ví rút và các đại phân tử Day là những nội dung

rả thiết thực cho các học viên cao học, các nghiên cứu sinh và các nhà

niên cứu khoa học sự sống

Với hơn ba mươi năm kinh nghiệm làm công tác giảng dạy và ngiên cứu Lý sinh Y học và Hiển ví điện tử Y học ở trường Đại học Y H nội, Học viện Quan Y và Viên Vệ sinh Dịch tế Trung ương, tác giả

PG TS Nguyễn Kim Giao đã chọn lọc và trình bày các nội dung cuốn

sản một cách cô đọng, và súc tích

Chúng tôi coi cuốn sách "Hiển vỉ điện tử trong khoa học sự sống” là

mt giáo trình phục vụ đào tạo sau đại học đồng thời là một tài liệu thm khảo bổ ích cho các bộ môn mô phôi và tế bào, bộ môn vi sinh học thóc các trường, Đại học Y, Dại học Nông nghiệp, Đại học Khoa học Tự niên Irong ca nước

lói hân hạnh được giới thiệu cuốn sách "Hiển vi điện tử trong khoa

hẹ về sự sống” của PGS TS Nguyễn Kim Giao cùng bạn đọc

Hà Nội, ngày 10-6-2004 LUuavvÀ

—————_

Phạm Gia Khánh

Giáo sư Tiến sĩ Y học

Thiếu tướng, Giám đốc Học Viện Quân Y

Trang 4

Loi noi dau

Lịch sử phát triển của xã hội lồi người ln gắn liển với lich

sử phát triển của khoa học và công nghệ Lý thuyết về tế bào và Phương pháp hiển vì là một trong những thí dụ nổi bật về mối

quan hệ khăng khít ảnh hưởng và thúc đẩy lẫn nhau cùng phát

triển giữa khoa học và công nghệ

Nhờ có sự phát triển của hiển vi quang học trong các thế kỷ

17-19 mà con người mới nhận biết được chỉ tiết các tế bào động vật

và thực vật và nhờ đó, lý thuyết tế bào mới ra đời và phát triển

Nhờ có việc chế tạo ra kính hiển vi điện tử và xây dựng được

các phương pháp làm tiêu bản trong nửa đầu thế kỷ 20 mà người ta có thể quan sát được cấu trúc của các bào quan tế bào, của vỉ

khuẩn vi rút và các vi sinh vật khác Đây là một giai đoạn phat

triển rực rỡ của các ngành khoa học sinh học Chính vì thế việc

hiểu và biết sử dụng phương pháp hiển vi điện tử đã ngày càng đóng vai trò vô cùng quan trọng không thể thiếu trong các nghiên cứu cấu trúc vật chất nói chung và cấu trúc sinh học nói riêng Cho

đến nay ở Việt Nam mới chỉ có rất ít tài liệu viết bằng tiếng Việt

về phương pháp hiển vi điện tử dùng trong nghiên cứu cấu trúc vật chất, đặc biệt là cấu trúc sinh học và đây là lý do chính để tác

giả viết cuốn sách này

Cuốn sách “Hiển vi điện tử trong khoa học sự sống” bao gồm

bảy chương

Chương 1 giới thiệu ngắn gọn về Lịch sử khoa học hiển vi và

những cơ sở vật lý của phương pháp hiển vi điện tử

Chương 9 và chương 3 trình bày về phương pháp Hiển vi điện

truyén qua (TEM), bao gồm nguyên lý cấu tạo của kính hiển vi

điện tứ truyền qua và các phương pháp làm mẫu

iii

Trang 5

Chương 4 và chương 5 trình bày về phương pháp hiển vi điện

tử quét (SEM), bao gồm nguyên lý hoạt động và cấu tạo của SEM

cũng như các phương pháp làm mẫu đặc trưng cho phương pháp

này Dọc xong các chương từ 2 đến 5, độc giả không những chỉ hiểu

nguyên lý của TRM và SEM mà còn có thể sử dụng những qui

trình đưa ra trong sách để làm tiêu bản dùng cho nghiên cứu cấu

trúc hình thái của các mẫu sinh học

Chương 6 trình bày về Miễn dịch hiển vi điện tử, trong đó giới

thiệu nguyên lý và các phương pháp nghiên cứu chức năng miễn

dịch ở mức độ siêu cấu trúc tế bào với độ phân giải cao

Chương 7 trình bày về Xử lý thông tin từ ảnh hiển vi điện tử

sinh học, trong đó tác giả tổng hợp lại một số phương pháp mà các

tác giả khác cũng như chính bản thân mình đã phát triển và áp dụng để nhận biết cấu trúc và giải thích siêu cấu trúc của mô, tế bào, vi khuẩn và vi rút trên các ảnh hiển vi điện tử thu được Đây

là những điều có thể coi là rất bổ ích và cần thiết cho những người

nghiên cứu với phương pháp hiển vi điện tử, đặc biệt là những

người mới đi vào lĩnh vực này

Những nội dung đưa ra ở đây nằm trong giáo trình chuyên dé mà tác giả đã giảng nhiều năm cho các lớp sau đại học của Học

Viện Quân Y, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương (VVSDTTU),

Trường ĐH Y Hà Nội và cả tại Trường ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐH Quếc gia Hà Nội

Cuốn sách chuyên để được biên soạn với mục đích chính là làm tài liệu học tập cho học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc

các chuyên ngành tế bào học, mô phôi học, giải phẫu bệnh học, vi

sinh học cũng như làm tài liệu tham khảo cho những người làm công tác nghiên cứu thuộc các lĩnh vực khoa học sự sống Tác giả

hy vọng cuốn sách này sẽ có ích cho nhiều bạn đọc, phục vụ tốt cho

việc giảng dạy và nghiên cứu khoa học

Tác giả xin được tỏ lòng biết ơn tới G8 TSKH Hoàng Thuỷ Nguyén, GS TS Hoang Thuy Long (Vién VSDTTU), GS TSKH

Nguyễn Văn Mẫn (Trung tâm Khoa học và Sản xuất Vắc-xin

Trang 6

SABIN) da ung ho va giúp; đố tác giả trong quá trình hoàn thành

những nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm và viết cuốn sách này

Tác gia xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học sau đây:

*ứn TS I.L Benedetti và G8 TS I Dunia (Đại học Pari 6- 7, CH Pháp): *TS Yoshino Muranaka (Đại học Y khoa, Hamamatsu, Nhật Bản): «TS Yasuaki Hotta (Dai hoc Nha khoa, Nagoya, Nhat Ban);

* Giam déc, TS Shunsuke Yoshida: TS Akira Kabaya và TS

Tetsuo Oikawa (Hang JEOL — Nhat Ban)

đã hợp tác với Phòng thí nghiệm Hiển vi điện tử, Viện VSDTTƯ trong nhiều năm trong chuyển giao công nghệ, trao đổi kinh

nghiệm cũng như tài liệu tham khảo, các tư liệu ảnh về hiển vi

điện tử sinh học và trong việc cung cấp các thông tin cập nhật về

thiết bị cho lĩnh vực chuyên môn này

Tác giả xin chân thành cảm ơn G8 T§ Trần Văn Hanh (Học

Viện Quân Y), G8 TS Đặng Đức Phú (Viện VSDTTU), GS TS

Trinh Binh (DHYKHN), GS.TS Nguyén Thi Kim Ngan va PGS TS Nguyén Thé Hién (DHKHTN-DHQGHN), đã cộng tác trong quá

trình đào tạo và đóng góp nhiều ý kiến quí báu cho việc trình bày

nội dung của cuốn sách

Tác giả xin chân thành cảm ơn CN Nguyễn Minh Liên, TS

Đã Thị Thoa, BS Nguyễn Thanh Thuỷ và CN Trần Quang Huy,

những người cùng công tác đã giúp đỡ tác giả trong việc hoàn

thành bản thảo

Tác giả bày tổ lòng cảm ơn Nhà xuất bản ĐHQGHN đã biên

tập và tạo điều kiện cho cuốn sách sớm được ra mắt bạn đọc

Chắc chắn cuốn sách sẽ còn thiếu sót Rất mong nhận được sự góp ý và chỉ bảo của bạn đọc Tác giả xin chân thành cảm ơn

Trang 7

Chuong 1

Lịch sử khoa học hiển vi và cơ sở vật lý

của hiển vi điện tử

1.1 Lịch sử của khoa học hiển vi

Sự ra đời và phát triển của khoa học hiển vi là một quá trình

gắn liền với sự phát triển của khoa học vật lý trong nhiều thế kỷ

Mặc dù những thị kính đơn giản đã được làm ra ngay từ thế kỷ 13 nhưng chỉ đến năm 1660, Hans và Zacharia Janssen mới là những người đầu tiên chế tạo ra kính hiển vi có hai thấu kính ghép Từ

năm 1899 J Lister đã thiết kế chế tạo ra các thấu kính hiển vi và

những kính hiển vi với thấu kính mới hiệu chỉnh này đã thúc đẩy việc làm các tiêu bản cho phép quan sát được các cấu trúc sống của

tế bào và mô

Năm1873, Ernst Abbe đã phát triển một lý thuyết quang học

(3,14) cho rằng năng suất phân giải của thấu kính bị giới hạn bởi

bước sóng ánh sáng và tuân theo công thức;

_ 0.612

nsina@

ỗ

Những năm sau đó (4,17), các nhà thiết kế kính hiển vi đã chế tạo ra nhiều loại kính hiển vi như kính hiển vi tử ngoại, kính hiển

vi tia X, kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi tương phản pha,

kính hiển vi giao thoa v.v Người ta đã dựa vào những tính chất đặc biệt của ánh sáng để thu được những thông tin khác nhau về hình ảnh cấu trúc của tế bào Kết quả là tất cả những nghiên cứu,

cải tiến về kính hiển vi đã làm tăng thêm sự hiểu biết vi mô của

chúng ta về tế bào

Trang 8

Tuy nhiên, giới hạn độ phân giải ở = 0,2um của kính hiển vi

quang hoc tưởng như đã là hàng rào ngăn cần các nhà y sinh học

nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc đưới tế bào

Dựa trên lý thuyết của Luis De Broglie (1924, nhận giải

thưởng Nobel Vật lý năm 1929) cho rằng các điện tử vừa có tính

chất hạt vừa có tính chất sóng và chứng minh của Bush (1926) giải thích rằng quĩ đạo chuyển động của các điện tử bị lệch bởi thấu

kính điện từ giống như ánh sáng bị lệch bởi thấu kính quang học, M Knoll và E Ruska ở trường Đại học Kỹ thuật Berlin đã chế tạo

ra chiếc kính hiển u¡ điện tử truyền qua (Transmission Electron

Mieroscope - TEM) đầu tiên vào năm 1934 Mẫu sinh vật đầu tiên

được quan sát là các sợi bông Ngay lúc đó hai vấn đề đặt ra với các nhà nghiên cứu là độ tương phản rất thấp của các mô sinh vật và

cần phải có được những tiêu bản rất mỏng Cùng với các mẫu

mỏng như các nuôi cấy tế bào quan sát được bằng kính hiển vi điện tử thì việc sử dụng máy cắt siêu mỏng với lưỡi dao thuỷ tỉnh do Latta và Hartmann đề xuất (năm 1950) đã khởi đầu cho việc

dùng kính hiển vi điện tử truyền qua để nghiên cứu và phân tích

các cấu trúc tế bào và mô Một loạt những kỹ thuật làm tiêu bản

cho kính hiển vi điện tử như kỹ thuật nhuộm mẫu bằng kim loại

nặng (sử dụng OsO,), các kỹ thuật nhuộm điện tử khác, kỹ thuật cắt siêu mỏng, cắt thành chuỗi, in sao chép mặt mẫu bằng màng

cácbon, phủ kim loại tạo bóng làm tăng độ tương phần và các kỹ

thuật hoá tế bào, tự chụp hình phóng xạ, vi phân tích và đông bẻ gãy v.v cùng các kiểu quan sát các tiêu bản sinh vật đã được nghiên cứu áp dụng Các phương pháp này cho phép làm ra được

những tiêu bản tốt, đã giúp cho các nhà sinh học tiếp cận được tới

độ phân giải của kính hiển vi điện tử truyền qua, nhỏ hơn vào khoảng 1000 lần so với độ phân giải của kính hiển vi quang học

Vào những năm đầu 1950, hầu như mỗi một quan sát về siêu cấu trúc tế bào đều có thể công bố được trên các tạp chí khoa học

và tài liệu tham khảo De Harven gọi đây là thời đại hoàng kim

của hiển vì điện tử sinh học

Trong những năm cuối cùng của thế kỷ 20, các phương pháp làm mẫu và các thiết bị mới đã mở ra những phương hướng mới trong việc phân tích các tế bào bằng hiển vi điện tử

3

Trang 9

Miễn dịch hiển vì điện tứ cung cấp cho các nhà sinh học tế bào

phương pháp phân tích có hiệu lực để nhận biết và định vị các

kháng nguyên tế bào đưới những diều kiện sinh lý và sinh bệnh lý

khác nhau Những kỹ thuật làm mẫu tại nhiệt độ thấp như làm đông lạnh nhanh, cất lạnh siêu mỏng và làm đông thay thế đã

nâng cao chất lượng kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử về độ nhạy, độ phân giải và đánh đấu miễn dịch nhiều lần

Để ghi nhận những đóng góp to lớn vào việc nghiên cứu các mối

tương quan giữa cấu trúc và chức năng của các bào quan tế bào bằng hiển vi điện tử, ba giải Nobel y học và sinh học vào năm 1974

đã được trao cho: A Claude (1899-1982), nhà sinh hoá người Bỉ,

C.R de Duve (1917) và nhà tế bào học người Mỹ G.E Palade (1912)

Nhà vật lý học người Đức E Ruska (1906-1988) cũng được trao chung giải Nobel vật lý năm 1986, sau hơn nửa thế kỷ phát minh ra kính hiển vi điện tử truyền qua

Sự ra đời và phát triển của kinh hién uì điện tử quét (Scanning Electron Microscope — SEM) cham hdn kinh hién vi dién tử truyền qua Von Ardene là người đầu tiên chế tạo ra kính hiển vi điện tử quét vào năm 1938 C.W Oatley lam việc ở trường Dai

học Cambridge đã bắt đầu nghiên cứu, phát triển kính hiển vi điện

tử quét từ năm 1948 Kính hiển vi điện tử quét mà ông chế tạo ra

năm 1953 là một trong những SEM hiện đại đầu tiên

Năm 1913, H Moseley thấy rằng tần số của những tia X phát

ra khi có chùm điện tử chiếu vào mẫu là một hàm số của nguyên

tử số của những nguyên tố có mặt trong mẫu và có thể dựa vào

việc phân tích độ dài bước sóng hoặc năng lượng của các tia X mà

biết được chính xác các nguyên tố hoá học có trong thành phần của

mẫu Năm 1949, R Castaing đã chế tạo ra bộ vỉ phân tích đầu dò

điện tử đầu tiên và chứng tổ rằng nó có thể phân tích được thành

phần hoá học ở những vùng rất nhỏ của mẫu Thiết bị vi phân tích dau dé dién tt (Electron Probe Micro Analyser — EPMA) dau tiên chế tạo ra năm 1956 được làm theo thiết kế của Castaing

Những phổ kế tia X tán sắc năng lượng (EDS), phổ kế tia X tán sắc bước sóng (WDS) được lắp vào các SEM làm cho chúng vừa

Trang 10

có thể xác định được cấu trúc hình thái vừa có thể xác định được

cấu trúc hoá học của các mẫu nghiên cứu

Cùng với các kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kính hiển

vị điện tử quét (SEM), hính hiển vi dién tử truyền qua quét

(Scanning Transmission Pleetron Mieroseope - STRM) là sự kết hợp

của hai loại kính trên với chùm tia cố định hoặc đi chuyển cũng đã

được chế tạo Ảnh STEM đầu tiên được công bố là ảnh của tỉnh thể oxit kẽm

Về mặt phương pháp luận các nhà nghiên cứu y sinh học tin

rằng việc quan sát các mẫu sinh học bằng biển vi điện tử tới lúc

nào đó sẽ đạt đến một giới hạn và người ta phải chuyển hướng

nghiên cứu nhờ việc sử dụng các loại kính hiển vi khác

Điều đó đã xảy ra năm 1986 (6), khi giải Nobel về vật lý được

trao cho hai nhà khoa học là G Binnig và H Rohrer vì đã chế tạo được kính hiển vi xuyên ngầm (Scanning Tunelling Microscope -

STM) cho phép thấy rõ từng nguyên tử trên bề mặt vật rắn Kính hiển vi lực nguyên tử (Atomie Force Mieroscope - AFM, ra đời cuối năm 1986) cũng cho phép thấy được từng nguyên tử trên bề mặt

của những mẫu không dẫn điện, có thể làm việc trong không khí, thậm chí trong cả môi trường lỏng Rồi nhiều loại kính hiển vi mới

xuất hiện, với độ phân giải cao hơn hẳn các loại cũ, cho phép quan

sát được nhiều cấu trúc đặc biệt mà trước đó không thể làm rõ như

kính hiển vi luc tt’ (Magnetic Force Microscope- MFM), kinh hién

vi lực ma sát, kính hiển vi thế điện động, kính hiển vi điện trở

v.v Thế hệ các kính hiển vi mới này đều hoạt động theo một cách

hoàn toàn mới là quét cơ học một đầu đò trên mặt mẫu, khuếch đại tín hiệu thu được ở đầu dò để tạo ra ảnh, do đó chúng có tên chung la kink hién vi dau dd quét (Scanning Probe Microscop - SPM) Cac

nhà khoa học và kỹ thuật đang đi sâu nghiên cứu áp dụng các loại

kính này và hy vọng thu được nhiều thông tỉn mới về bản chất sâu xa của cấu trúc sinh học ở mức độ nguyên tử

Tại Việt Nam, do nhận thức được ý nghĩa khoa học và tầm quan trọng của kính hiển vi điện tử trong nghiên cứu y, sinh học và chẩn đoán bệnh, GS TSKH Hoàng Thuỷ Nguyên đã thành lập

Phòng thí nghiệm Hiển vi điện tử tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung

4

Trang 11

ương vào năm 1974 với kính hiển vi điện tử truyền qua JJM-T8

cùng các thiết bị tạo mâu như máy cắt lát siêu mỏng

UITRAMICROTOME II, máy bốc bay kim loại trong chân không JEE-4B Vao nam 1997, kin hiển vì điện tử truyền qua thứ hai JEM1010 véi độ phân giải SRA, độ phóng đại 50 - 600.000 lần, điện thế gia tốc chùm điện tử 30-100 kV lại được lắp đặt tại đây

Nhờ tính năng ưu việt của JEM-1010 và những phương pháp tạo mẫu mới, kể cả phương pháp đánh đấu miễn địch hiển vi điện tử

v.v việc xác định các vi rút gây bệnh và việc kiểm tra các vắcxin vi

rút sản xuất được đã trở thành hoạt động thường xuyên Một loạt

các nghiên cứu ở mức độ phân tử thuộc các lĩnh vực y học, sinh học và nông nghiệp cũng đã được thực hiện tại Phòng thí nghiệm này

Ngoài Phòng thí nghiệm nêu trên, một số phòng thí nghiệm

hiển vi điện tử ở các trường đại học và viện nghiên cứu cũng đã được

xay dựng, lắp đặt và khai thác phục vụ nhiều nghiên cứu đa dang

trên các lĩnh vực khác nhau như tại Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội, (2M100B - Liên Xô), Viện Vật lý thuộc Viện Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia (EM-125K), Viện Kỹ thuật Nhiệt đới (JSM5ð310), Viện 69 (JSMð410LV), Trường ĐHKHTN - ĐHQGHN (JSM5410LV), trường Đại học Xây dựng (JSM 5610LV), Viện Dầu

khí (JSM5ð910L/V), Viện Địa chất Khoáng sản v.v và gần đây nhất

là Học viện Quân Y (JEM-1011) Những phòng thí nghiệm này đã có những đóng góp trong nghiên cứu hình thái cấu trúc và phân tích thành phần hoá học của các chất, vật liệu thuộc lĩnh vực chuyên ngành của mình

Điểm lại hơn ba trăm năm phát triển của ngành khoa học

hiển vi, từ những ngày sơ khai với kính hiển vi quang học một

thấu kính, kính hiển vi hai thấu kính ghép đến các loại kính hiển vi điện tử như kính hiển vi điện tử truyền qua, kính hiển vi điện tử quét và các loại kính hiển vi đầu đò quét, ta có thể thấy rằng tương lai của ngành khoa học hiển vi đã và đang phát triển rực rỡ

Nhiều loại kính hiển vi dựa trên những nguyên lý vật lý khác

nhau với sự điều khiển bằng máy tính điện tử đã lần lượt được chế

tạo và ứng dụng trong các nghiên cứu sinh học tế bào, góp phần 5

Trang 12

đem lại những hiểu biết sâu sắc hơn đối với thế giới sống từ mức

độ mô, tế bào, bào quan đến các đại phân tử, phân tử và nguyên tử Tổng hợp lại, để có thể thấy được vai trò của kính hiển vi như

là các thiết bị quan sát mẫu có kích thước khác nhau, dưới đây

trình bày một biểu đồ so sánh năng suất phân giải của những thiết bị quan sát có độ phóng đại khác nhau (bên trái) và những cấu trúc mà có thể phân giải được (bên phải) với thang chiều dài logarit (ở giữa)

Độ phóng đại Mẫu

xi9 —~ Tem

x10" “| Phan hoa ede van

Hồng cấu CTế bào máu! Giới han năng xuất phân giải 2 Kinh hién vi quang hoc = mie Kính hiển vi điên tử quết ~—_ Kính hiến vì điện tử truyến qua Kính hiển vi lực nguyên tử

Sơ đồ về độ phóng đại và khả năng quan sát của kính hiển vi các loại (theo JEOL — JAPAN)

Trang 13

1.2 Điện tử và thấu kính điện từ

1.2.1 Năng suất phân giải và độ phân giải

Chất lượng ảnh thường được đánh giá bằng “Năng suất phân

giải”, xác định như là khoảng cách ngắn nhất giữa hai điểm (hoặc

hai đường) mà có thể ghi nhận được như là hai ảnh khác nhau Tuy nhiên thuật ngữ này bao hàm hai nghĩa khác nhau: năng suất

phân giải của thiết bị và độ phân giải của ảnh Điều quan trọng là

sự khác nhau này cần được hiểu thấu đáo

Trong trường hợp kính hiển vi quang học, năng suất phân giải đ được xác định bằng quang sai nhiễu xạ với giả thiết bỏ qua hiện

tượng cầu sai và sắc sai: _ 0.614 _ 0.614 nsin@ NA d (1) 6 day: A: là bước sóng ánh sáng, là chiết suất của môi trường xung quanh vật, a là góc mở của khẩu độ, Na: la sO khau dé

Mặt khác kính hiển vi điện tử chịu ảnh hưởng bởi cầu sai mà hiện nay không có khả năng loại bỏ hoàn toàn Do đó chùm điện tử đi gần quang trục cần được sử dụng và năng suất phân giải của kính hiển vi điện tử được xác định qua sự kết hợp tối ưu ảnh hưởng của cầu sai và quang sai nhiễu xạ, như có thể thấy trên hình 1.1 Sherzer đã tính được giới hạn năng suất phân giải đ„¡„ và góc mở khẩu độ thấu kính vật œ„„¿ tương ứng như sau:

nim = 0.48NA'CS (2)

Q,,, = 1.41YA/Cs (3)

với  là bước sóng của các điện tử; €, là hệ số cầu sai của thấu

Trang 14

vua : đụ CẤU sai “ tet Quang sai nhiễu xạ đ, Í nhiễ %p Góc mở khẩu độ Hình 1.1

Giới hạn năng suất phân giải

Phương trình này được xây dựng với giả thiết rằng chỉ có cầu

sai và quang sai nhiễu xạ gây ảnh hưởng lên độ phân giải Tuy

nhiên ảnh hưởng của các yếu tố như sắc sai lại không có thể loại bỏ

trong hiển vi điện tử Như đã nói ở trên, việc loại bỏ các quang sai

trong kính hiển vi điện tử (Electron Microscope - EM) 1a khé khan

hơn nhiều so với trường hợp của kính hiển vi quang học (Light Mieroscope - LM) Tuy nhiên, với EM thì có thể thu được công suất phân giải cao vì bước sóng của điện tử chỉ ngắn vào khoảng 1/100.000 bước sóng của ánh sáng Bước sóng 3 của điện tử được xác

định qua hiệu điện thế gia tốc Hiệu điện thế gia tốc của EM thường vào khoảng vài chục kV hoặc cao hơn nên phải tính đến những hiệu

chỉnh dựa trên hiệu ứng tương đối tính trong chuyển động có gia tốc

của điện tử trong việc xác định bước sóng của chúng 1.2261

————————— (nm)

VV ¥1+9,7880x107

So sánh với công suất phân giải của kính hiển vi, độ phân giải của ảnh là kém hơn vì những điều kiện của mẫu hiển vi và của

ảnh Để thu được độ phân giải tốt nhất thì cần đặc biệt chú ý tới

việc tạo và chuẩn bị mẫu, bảo dưỡng và điều chỉnh kính hiển vi điện tử cũng như tới việc chụp và xử lý ảnh

8

4= (4)

Trang 15

Để xác định được năng suất phân giải đ bằng mắt thường thì

cần phải có độ phóng đại ảnh thích hợp Độ phóng đại ẤM tối thiểu

có hiệu qua đuợc xác định bằng năng suất phân giải của mắt ở,

(xấp xỉ bằng 0.1mm) Do đó:

TT na (5)

Nếu năng suất phân giải của kính hiển vi điện tử là 0.2 nm và năng suất phân giải của kính hiển vi quang học là 200 nm thì độ phóng đại hiệu dụng của các kính hiển vi này có thể đạt là 500.000 x (lần) và 500 x (lần)

Để biết chính xác năng suất phân giải, ảnh quan sát cần phải được chụp ở độ phóng đại thấp hơn so với tính toán và sau đó ảnh còn được phóng đại tiếp Vì ảnh thu được bằng EM có độ phân giải d, xấp xỉ 20um nên độ phóng đại ảnh tối thiểu 3, là 5x và được tính như sau: d, M n (6 Độ phóng đại ảnh lớn hơn ðx sẽ lợi hơn vì sẽ cho phép dat d, thấp hơn

1.2.2 Nguyên lý của thấu kính điện tử

Vì EM sử dụng chùm tia điện tử nên các thấu kính điện tử

được sử dụng để hội tụ và chiếu chùm tia điện tử lên mẫu đồng thời tạo thành ảnh để quan sát Các thấu kính điện tử thường

được chia thành các loại thấu kính từ, thấu kính tĩnh điện (sử dụng từ trường và điện trường đối xứng trục tương ứng) và các

thấu kính điện từ với mục đích đặc biệt, chẳng hạn như thấu kính tứ cực (bốn cực) Tuy nhiên, EM thuờng chủ yếu sử dụng các thấu kính điện từ nên dưới đây chỉ mô tả nguyên lý cấu tạo và hoạt

động của các thấu kính loại này

Nếu như khi đi qua một từ trường, phương chuyển động của điện tử trùng với phương của từ trường thì điện tử không chịu bất

kỳ một lực tác dụng nào Ngược lại nếu phương chuyển động của

điện tử (phương của véctơ vận tốc) vuông góc với phương của từ

9

Trang 16

trường thì điện tử sẽ chịu một lực Lorentz làm cho nó chuyển động

trên một mặt phẳng vuông góc với mặt phẳng tạo giữa véctơ vận

tốc của điện tử và véctơ cường độ từ trường Hơn nữa, nếu cường

độ của từ trường là đồng nhất thì quĩ đạo của điện tử trên mặt phẳng đó sẽ là một cung tròn Trong trường hợp này, bán kính z của cung tròn quỹ đạo đó có thể tính được như miêu tả ở dưới đây

Vì lực tác dụng lên điện tử chuyển động với vận tốc 0 lAevB 2 và lực hướng tâm là (xem trên hình 1.2a) nên: r pe (7) eB nB trong đó m: khối luợng của điện tử; 0 : vận tốc của điện tử; e: điện tích của điện tử; B: mật độ từ thông; 7: điện tích riêng của điện tử = SS m

Phương trình (7?) cho thấy, nếu cường độ từ trường là đồng nhất thì véctơ bán kính quĩ đạo tròn của các điện tử sẽ tạo với

Trang 17

Khi một chùm nhiều điện tử đồng thời phát ra từ một điểm P

trên mặt phẳng vuông góc với từ trường đông nhất của thấu kính với các vận tốc và hướng khác nhau thì mỗi điện tử sẽ chạy trên một quĩ đạo tròn với bán kính tỷ lệ với vận tốc của nó và chúng quay trở lại điểm P như mô tả trên hình 1.2b

Thời gian cho các điện tử chuyển động hết một vòng quỹ đạo

tròn này là:

_= 2 ®

Như vậy, mật độ từ thông đồng nhất của từ trường tạo ra chu kỳ không đổi z của các quỹ đạo tròn và tất cả các điện tử phát ra

vào cùng một thời điểm từ điểm P sẽ quay trở về điểm P ban đầu

vào cùng một lúc Điều đó có nghĩa là vận tốc góc của các điện tử là một hằng số Khi điện tử phát ra theo một phương nghiêng một góc nào đó với phương của từ trường đều thì chúng sẽ phải chuyển

động trên một quï đạo kiểu xoắn elip Đó là do chuyển động của các điện tử trong trường hợp này là sự tổng hợp của hai chuyển

động thành phần: một thành phần chuyển động thẳng đều dọc

theo các đường sức của từ trường và một thành phần chuyển động

tròn theo phương vuông góc với các đường sức đó Như được minh

hoạ ở hình 1.3, khi các điện tử phát ra từ điểm P với một tốc độ 0 và ở một góc # so với hướng của từ trường đều Eƒ thì chúng đi theo

một quĩ đạo xoắn elip ø Quï đạo này là quï đạo tổng hợp của

chuyển động đều với thành phần vận tốc v, và chuyển động tròn

với thành phần vận tốc 0„ Sau đó, điện tử đi qua điểm P nằm trên chính đường sức từ trường chứa điểm P ban đầu Vì uy = 0sinø,

Trang 18

vận tốc của điện tử song song với những lực từ trường có thể xác

định như sau:

v, =v cosa@=v

Khi hai điện tử phát ra đồng thời từ điểm P dưới những góc

khác nhau thì chúng chuyển động theo nhiing qui dao a va b khác nhau nhưng sẽ đi đến điểm P cùng một lúc Như vậy, với một

chùm điện tử thì có thể tạo ảnh trong từ truờng đều Khoảng cách

đ giữa các điểm P và P nằm trên cùng một đường sức từ trường là khoảng cách giữa những điểm nút và được tính như sau:

đ=uz= — q1)

Hình 1.3

Quï đạo của các điện tử phát ra nghiêng với từ trường đều

Khi so sánh phương trình này với phương trình (7) ta thấy

rằng ở bằng chu vi của quï đạo tròn của điện tử có vận tốc vuông góc với đường sức của từ trường

12

Trang 19

Hình 1.4 miêu tả quï đạo của một chùm các điện tử trong chân không Tất cả các điện tử phát ra từ cùng một điểm P sẽ hội tụ tại

cùng một điểm P` qua những quï đạo tương ứng Hiện tượng này

tương tự với hiện tượng ở một thấu kính hội tụ quang học, nhưng

khác nhau ở chỗ những tia sáng song song đi vào một thấu kính quang học không có quang sai sẽ hội tụ tại mặt phẳng hội tụ phía sau Trong khi đó những điện tử chuyển động trong từ trường đều lại không hội tụ

Hình 1.4

Chùm điện tử đi qua từ trường đều

€ó ba loại thấu kính điện từ thường được sử dụng là: e - Cuộn dây nhiều lớp rỗng lõi (xem hình 1.ða);

« Cuộn dây được bọc bởi những tấm sắt từ chứa khe từ (để tập

trung trường cảm ứng) (xem hình 1.5b),

¢ Cuộn dây bọc bởi những tấm sắt từ chứa đầu cực từ bằng vật

liệu sắt từ ở bên trong (để đảm bảo thu được trường từ có cường

độ cao) (xem hình 1.5c)

Hầu như tất cả kính hiển vi điện tử hiện đại đều sử dụng các

đầu cực từ để thu được công suất phân gải cao và độ phóng đại cao Chức năng của những thấu kính điện từ như vậy cũng giống như

những nam châm hình móng ngựa đối xứng quanh một trục Theo

đó tất cả những tia điện tử song song đi tới từ trường không đồng nhất của các thấu kính điện từ này sẽ bị hội tụ tại một điểm

Trang 20

Hinh 1.5 Các kiểu thấu kính điện từ Hình 1.6

Điện tử đi qua thấu kính từ

Hình 1.6 biểu diễn quï đạo của một tia điện tử đi qua một từ trường như vậy Mặc dù quï đạo của chùm tia điện tử đi trong

thấu kính từ không giống như qui đạo chùm tia ánh sáng đi trong

thấu kính quang học nhưng kết quả hội tụ là như nhau Như hình 1.6 chỉ rõ, các điện tử chuyển động thẳng cắt trục, đi qua từ trường theo một quĩ đạo xoắn elip để cắt trục một lần nữa và lại chuyển

động thẳng Điều này giống như cách hội tụ của các thấu kính hội tụ quang học và nếu như quá trình chuyển động tương đối của

điện tử với quang trục bị bổ qua thì cách hội tụ của thấu kính điện

tử có thể được khảo sát như là của thấu kính quang học

Thấu kính từ có những đầu cực từ bị từ hố gần tới bão hồ để

tập trung từ trường trong một không gian rất hẹp tạo ra một thấu

kính mỏng Sự phân bố từ trường và sơ đồ tạo ảnh được minh hoạ

trên hình 1.7 Tiêu cự ƒvà góc quay Ø được xác định như sau 14

Trang 21

= = [8 war (12a) ø= de [Ba (12b) G day, U la hiệu điện thế gia tốc Hình 1.7

Sơ đồ hình tạo ảnh và sự phân bố trường từ

Phương trình (12) cho thấy, tiêu cự ƒ càng ngắn thì mật độ từ

thơng Ư u cầu càng cao Hơn nữa vì Ö tỷ lệ với N-1 (tích số giữa

cường độ dòng điện và số vòng dây) nên cần phải tăng dòng qua cuộn dây để thu được tiêu cự ngắn Vì thấu kính điện tử như đã

nói trên có hiệu ứng giống như thấu kính hội tụ quang học mỏng

Trang 22

1,2.3 Độ nét chiều sâu của trường nhìn và độ sâu

hội tụ của thấu kính

Độ nét chiều sâu của trường nhìn

Độ nét chiều sâu của trường nhìn là độ sâu trong vùng mẫu

vật mà vẫn thu được ảnh rõ nét Độ sâu của thấu kính điện từ là khoảng cách nằm trên trục ở phía mẫu vật mà trong phạm vi đó

thấu kính có thể hội tụ cho ảnh rõ nét (1,8)

Hình 1.8

Sơ đồ biểu diễn độ nét chiều sâu của trường nhìn

Giả thiết O, và O; là những điểm vật cách nhau bằng giới hạn năng suất phân giải ở của thấu kính (hình 1.8) Các chùm tia song song đi qua O; và O; cắt trục của thấu kính tại A và B và những

điểm bất kỳ trong khoảng cách AB sẽ biểu hiện độ nét như nhau

trên ảnh Khoảng cách AB được định nghĩa là độ sâu của trường nhìn D¿ với bán góc khẩu độ là ø 6 day: z 2 D, 2 tga 6 do dé Do = a d (14) và giá trị của Dạ là rất nhỏ

Với d=lnm và ø =5x10” radian thì D, =200nm Gia trị này

lớn hơn đáng kể so với độ dày của bất kỳ mẫu nào được kiểm tra

18

Trang 23

dưới kính hiển vi điện tử 190 kV ở độ phân giải này và do đó mẫu

luôn biểu hiện có độ nét như nhau theo độ đày của nó Tuy nhiên,

cần chú ý rằng độ sâu của trường nhìn không phải là tuyệt đối Với độ phân giải 0,5nm và bán góc khẩu độ thấu kính vật 10? radian thì độ nét chiều sâu của trường nhìn sẽ giảm xuống còn 50nm và

đó là điều cần tính đến với một số mẫu dày

Độ sâu hội tụ

Hiệu ứng độ nét chiều sâu của trường nhìn thể hiện tại mặt phẳng vật Tuy nhiên khi xét trên mặt phẳng ảnh thì nó được gọi

là độ sâu hội tụ Một thấu kính phóng đại có độ sâu hội tụ lớn có nghĩa là ảnh cuối cùng vẫn giữ được độ hội tụ trong một khoảng

cách dài dọc theo quang trục (18,17) Khi đó 6 “II De MH (15) a Ở đây M là độ phóng đại chung, ở là năng suất phân giải của thấu kính và ø là bán góc khẩu độ Với M = 10!; đ = 1,5nm; z= 10? thì D,=B0m

Do đó, việc màn huỳnh quang và phim chụp ảnh trong TEM nằm ở các mặt phẳng khác nhau là điểu không quan trọng vì khoảng cách đó không đáng kể so với độ sâu hội tụ Tuy nhiên, cần

phải biết chính xác khoảng cách do được giữa thấu kính chiếu,

màn huỳnh quang và phim chụp ảnh vì độ phóng đại ở những vị

trí khác nhau như vậy là khác nhau Trong thực tế, cần phải biết rằng những phép chuẩn độ phóng đại của hầu hết kính hiển vi

điện tử là thuộc về độ phóng đại của ảnh chụp tại phim ảnh nằm

đưới màn quan sát nên độ phóng đại của ảnh tại màn quan sát

thường nhỏ hơn 20% so với giá trị tính được

Sự liên quan giữa độ tết ae at của trường nhìn và độ sâu hội

tụ với góc khẩu độ khẩu độ nhỏ hơn

sẽ làm tăng cả độ né oft ACCA Gann AH độ sâu hội tụ

Trang 24

Mặt phẳng ảnh

Hình 1.9

Sơ đồ biểu diễn D, va D,, tang khi góc khẩu độ giảm

1.3 Chân không trong kính hiển vi điện tử (4,24)

Hệ thống chân không là tập hợp của các bơm, các công tắc, các

van và các ống có liên quan tới việc hút không khí Trước tiên là ở đường chuyển động của chùm tia điện tử và sau đó là ở những vùng khác của kính hiển vi điện tử được lựa chọn Hệ thống ống được thiết kế để nối các bơm chân không tới những nơi cần được

hút chân không (mẫu, buồng máy ảnh, súng điện tử, cột kính) So với các hệ thống chân không điều khiển bằng tay ở những kính

hiển vi cũ, các thiết bị chân khơng hồn toàn tự động và chuẩn hoá

trong những kính hiển vi điện tử thế hệ mới cũng chỉ thay đổi rất ít Ngoài việc sử dụng thuận lợi, ưu điểm chính của các hệ thống

chân không hiện nay là có bộ phận an toàn nằm ở nhiều vị trí để

chống bẩn và bảo vệ thiết bị trước các sự cố bất ngờ và lỗi lầm của

người sử dụng quên đóng van, mất nước và điện

1.3.1 Yêu cầu chân không trong hiển vi điện tử

Cùng với hệ thống quang điện tử, hệ thống chân không cũng

là bộ phận được đặc biệt chú ý trong kính hiển vi điện tử cũng như

các thiết bị làm mẫu hiển vi điện tử Điều này do một số lý do sau:

1 Chùm điện tử phát xạ từ catốt, được gia tốc tới anốt và

chuyển động thẳng theo quang trục của cột kính Môi trường

chân không cần có để làm tăng quãng đường tự do trung bình

18

Trang 25

của các điện tử mà trên đó khi chuyển động, điện tử không va

chạm với các phân tứ khí và môi trường chân không cũng

ngăn cản sự phóng điện cao thế giữa các điện cực như sợi đốt,

lưới màn, anốt Sự phóng điện là một trong những nguyên nhân chính làm hỏng sợi đốt Các sợi đốt làm từ LaB; và đặc

biệt là loại phát xạ trường có năng suất phân giải rất cao nhưng lại rất nhạy cảm với sự oxy hoá và cần được bảo vệ

Chân không có tác dụng loại bỏ các khí bẩn (đặc biệt là hơi nước và các dung môi hữu cơ thường có trong các phòng thí nghiệm) vì chính các chất này sẽ bị phá vỡ khi bị các điện tử

năng lượng cao bán phá tạo ra các chất làm bẩn và làm hỏng siêu cấu trúc của mẫu

2 Các thiết bị bốc bay kim loại tạo bóng, tạo màng phủ mẫu

cũng làm việc trong chân không Sự va chạm của các nguyên tử, các hạt kim loại hoặc eacbon với các phân tử khí cũng làm

giảm chất lượng màng và do đố cả chất lượng ảnh thu được

3 — Với SEM ngoài việc quan sắt mẫu ở chân không cao người ta

còn quan sát mẫu ướt ở chân không thấp Khi đó súng phóng

điện tử được duy trì ở chân không cao nhưng buồng mẫu lại

nằm ở chân không thấp Lúc này, việc khống chế chính xác

và duy trì các bộ phận khác nhau của thiết bị ở những chế độ

chân không khác nhau là điều quan trọng

1.3.2 Don vi do chan không

Vùng chân không của TEM thay đổi từ chân không cao (10' - 10” Pa) tới chân không rất cao (101-107 Pa) và chân không siêu cao

(107-109 Pa) Điều đáng quan tâm là ngay cả khi kính hiển vi điện

tử vận hành ở chân không cao 10 Pa thì vẫn còn trên 10'' phân tử không khí trong thể tích không gian 1mm Tuy nhiên, quãng đường tự do trung bình của điện tử đưới những điều kiện như vậy

là trên 50m

Trang 26

Hiện nay người ta thường dùng các đơn vị đo áp suất là Torr,

Pascal, Bar và Atmosphere Tương quan giữa các đơn vị đo áp

suất này đưa ra trong bảng 1-1

Bảng 1-1 Tương quan giữa các đơn vị đo áp suất Đơn vị Pascal Torr Millibar 1 Torr = 1mmHg 133 1 1,33 1 Millibar 100 0.75 1 1At 1.01 x 10° 760 14.01 x 10°

1.3.3 Các phương pháp đo chân không

Việc xác định độ chân không của kính hiển vi điện tử là

một điều cần thiết, không những để biết chế độ chân không hiện tại của cột kính, của buông ảnh mà còn cho phép ta điều

khiển tự động hoàn toàn chế độ làm việc của kính hiển vi điện

tử Hiện nay có nhiều phương pháp đo chân không nhưng phổ

biến vẫn là phương pháp dùng đầu đo Pirani, đầu đo ion hoá

và đầu đo catốt lạnh

Phuong phap Pirani

Đầu đo Pirani gồm một sợi đốt có điện trở giữ ở mức không đối

bằng cách đặt lên đó một điện áp thích hợp Điện trở được thiết lập ở một giá trị xác định bằng cách đốt nóng sợi đốt với một điện áp xác định Các phân tử không khí dẫn nhiệt đi khỏi sợi đốt làm giảm nhiệt độ và điện trở của nó Do đó, một mạch cầu Wheatstone đáp ứng sự hạ thấp nhiệt độ này sẽ bị lệch khỏi vị trí cân bằng và

đưa vào sợi đốt một điện áp cao hơn để giữ cân bằng cho nhiệt độ

tức là điện trở của sợi đốt không đổi Von kế được sử dụng để đo

giá trị điện áp đưa vào mạch Thang chia độ của von kế có thể thay bằng một thang chuẩn theo đơn vị đo chân không để đọc trực tiếp

giá trị của số đo chân không Theo phương pháp đo Pirani, nhiệt

20

Trang 27

độ và điện trở được giữ không đổi trong khi đo được điện áp thay đổi (và chuẩn hoá thành số do đơn vị chân không)

Phương pháp đo Pirami chỉ xác định được áp suất tới giá trị 107 Pa nên để do được áp suất thấp hơn, tức là chân không cao

hơn, người ta phải dùng phương pháp do ion hoá bằng catốt nóng hoặc dùng catốt lạnh

Phương pháp lon hoá

Phương pháp ion hóa ctốt nóng để đo áp suất chân không được

xem là một trong những phương pháp chính xác nhất Đầu đo là

một ống có thể bằng thuỷ tỉnh có sợi đốt F, điện cực anốt thu điện tử A và điện cực catốt thu các ion đương I (hình 1.10) Cổ ống có

đạng thon nhỏ để nối với hệ chân không tại vị trí cần đo chân

không Khi cấp vào sợi đốt một dòng điện, đồng thời điện thế

đương và âm được đặt vào các điện cực A và I tương ứng thì các

điện tử phát xạ từ sợi đốt (ở điện thế âm) bị đốt nóng sẽ được gia tốc và chuyển động về điện cực thu anốt A tích điện dương Tuy

nhiên, trên đường đi các điện tử va chạm với các phân tử khí du trong môi trường và kết quả là làm chúng bị ion hoá Các ion tích

điện dương bị hút ngay về điện cực I Số lượng những ion dương

nay 6 I được xác định như là một đòng ion đo được trên Ampe ké I; (dòng ion tỷ lệ với số lượng ion, tức là số lượng các phần tử khí dư còn lại trong khoảng không gian, ứng với độ chân không ở đó) Hơn

nữa, số lượng các ion phát ra do sự va chạm nói trên lại tỷ lệ thuận

với số lượng điện tử phát ra từ sợi đốt và số lượng các phân tử khí Nói một cách khác, áp suất của chất khí có thể tính theo công thức:

P=1/S-T/I,

Ở đây, I, 1A déng ion, J, 1a dòng điện tử và § là một hằng số

được xác định bởi cấu trúc các điện cực, chất lượng vật liệu sử

dụng, bản chất của chất khí cùng điện áp đặt vào

Phương pháp ion hóa catốt nóng đo được chân không trong

phạm vi từ 10” tới 10” Pa Hình 1.10 miêu tả sơ lược cấu tạo của một đầu đo loại này

Trang 28

Hinh 1.10 Hình 1.11

Sơ đồ đầu đo lon hoá Sơ đồ đầu đo catốt lạnh

Phương pháp đo ion hoá dùng catốt lạnh (Đầu đo Penning)

Đầu đo iôn hoá dùng catốt lạnh (còn gọi là đầu do Penning) la

đầu đo được sử dụng phổ biến nhất để đo chân không cao trong các

kính hiển vi điện tử Cấu tạo của đầu đo này (xem hình 1.11) gồm

một catốt hình trụ (có thể là một tấm kim loại cuộn lại) bao quanh

một sợi dây kim loại làm anốt đặt ở giữa lòng một nam châm hình

chữ U Một điện áp cao đặt vào giữa hai điện cực sẽ làm bật các

điện tử từ catốt và gia tốc các điện tử này về phía anốt Các điện tử

này sẽ va chạm với các phân tử khí còn dư lại trong môi trường và

ion hoá chúng Các ion dương sẽ chuyển động tới catốt còn các điện

tử sẽ chuyển động tới anốt làm tăng dòng điện đi qua giữa anốt và

catốt Sự va chạm của các điện tử với các phân tử khí sẽ tăng lên nhờ tác dụng của từ trường do nam châm hình chữ U gây ra Khi đó, các điện tử chuyển động từ catốt tới anốt theo một quỹ đạo

xoắn ốc nên có độ dài đường đi của chúng trong không gian tăng

lên Kết quả là sự ion hoá các phân tử khí tăng lên tại áp suất

thấp cho phép đo được đòng điện một cách chính xác với sự phát xạ

rất nhỏ của các điện tử từ catốt lạnh Đầu đo này được dùng để đo chân không trong phạm vi từ 10” tới 10° Pa

1.8.4 Các bơm sơ cấp và bơm khuếch tán (4,25)

Đa số các kính hiển vi điện tử đạt được những điều kiện chân

không làm việc bằng cách sử dụng hai loại bơm: bơm sơ cấp (cơ

học) uà bơm khuếch tán Bơm sơ cấp được sử dụng trước tiên để hạ

Trang 29

thấp áp suất trong khoảng tù 10” tới 10' Pa (chân không sơ cấp),

và sau đó bơm khuếch tán được sử dụng để đạt được chân không

cao trong khoảng từ 10° tdi 10 Pa Những bơm này hoạt động

theo những nguyên lý và cơ chế khác nhau và có thể tạo được độ

chân không đặc trưng của chúng

Bơm sơ cấp

Bom sơ cấp là tên gọi chung cho các loại bơm, chẳng hạn như

bom cơ học hay các loại bơm khác được sử dụng để tạo chân không

thấp ban đầu (cũng còn gọi là chân không sơ sấp) cho bơm khuếch tần hoạt động Nguyên lý cấu tạo và hoạt động của một bơm sơ cấp

cơ học có rôtô quay điển hình được chỉ ra trên hình 1-12 Một trục quay với những van trượt có lò xo lắp lệch tâm ở bên trong một không gian trụ lớn hơn Khi rôto quay theo chiều kim đồng hề từ vị

trí A đến vị trí B, một vùng thể tích lớn được tạo ra với áp suất bị hạ thấp kéo không khí vào vùng B Khi rôto tiếp tục quay, vùng B bị bịt lại và trở nên nhỏ hơn vì rôto chuyển các chất vào trong vùng

C Các chất khí ở vùng C bị nén lại tới một giới hạn mà van một

chiều bị ép phải mở để khơng khí thốt ra khỏi hệ thống Bằng

cách đó, bơm đã chuyển một lượng không khí từ phía trong hệ

thống đóng kín của kính hiển vi ra môi trường bên ngoài Các phán tử đu dite ia te ti tốc đó lên bơn T®0 mộ: ‘ =r Đơm cơ học Hình 1.12 Hình 1.13

Sơ đồ cắt dọc mình hoạ nguyên lý hoạt động Sơ đồ cắt dọc minh hoạ nguyên lý

của bơm cơ học hoạt động của bơm khuếch tán

Vì ma sát sẽ xuất hiện khi mặt của lá gạt cọ xát vào mặt trụ

lớn nên cần thiết phải đánh bóng và bôi trơn hệ thống Điều này

được thực hiện bằng cách ngâm môdun bơm trong chậu dầu để đầu

thường xuyên phủ trên những mặt cọ xát này Dầu được sử dụng

23

Trang 30

không chỉ để bôi trơn hệ thống và bịt kín chân không giữa hai mặt

mà còn có tác dụng thải nhiệt ra vỏ bọc ngoài của bơm Ở các bơm

cơ học sử dụng nhiều, độ bịt kín giữa rôto và mặt trụ lớn sẽ kém

dần và độ chân không thu được sẽ giảm Hơn nữa, dầu cũng hấp

thụ hơi nước và các dung môi hữu cơ khác trong phòng thí nghiệm

trong quá trình hoạt động sẽ làm hiệu suất của bơm bị giảm dần Tuy thuộc vào sự làm việc của bơm và độ ẩm của môi trường không

khí xung quanh mà bơm cần được đều đặn thay dầu sau một

khoảng thời gian nhất định (1 đến 4 lần trong một năm)

Bom khuéch tan

Ngược lại với bơm cơ học, bơm khuếch tán, như mô tả trên

hình 1.13, không có bộ phận hay chỉ tiết nào thực hiện chuyển động cơ học Bộ phận chính của bơm bao gồm một dãy các tháp

hình trụ đồng tâm có nón xếp chồng lên nhau với bề mặt phía

trong được đánh bóng Bình trụ (buồng bơm) với các tháp trụ đặt bên trong được làm lạnh bằng nước từ phía ngoài còn miệng bình

phía trên được nối với cột kính hiển vi điện tử để hút chân không

cho cột kính Lối thoát khí của bơm nằm ở một bên gần đáy Một

bếp điện nằm ở phía ngoài dưới đáy bình dùng để đun nóng dầu

khuếch tán Loại đầu đặc biệt nằm ở đáy buồng bơm bị sôi khi bếp

được đốt nóng Khi đó, hơi đầu bị nén tạo nên áp suất bay lên phía

trên và được phun xuống phía dưới theo phương nghiêng qua tập

hợp các lỗ mở ở thành ống, thiết kế ngay phía dưới các nón chụp Các phân tử hơi dầu nóng va chạm vào mặt nhẫn phía trong buồng

bơm tích tụ lại trên mặt đã bị làm lạnh bằng nước và chảy xuống

đáy của bơm rồi lại sôi và chu trình bay hơi và ngưng tụ của dầu được lặp lại liên tục Vì các phân tử đầu chuyển động với tốc độ cao

nên các phân tử không khí từ cột kính khuếch tán vào luồng hơi dầu trong bơm cùng bị phun đập vao thành bơm và bị đẩy xuống phía dưới Trong khi luồng hơi dầu do có độ nhớt cao nên bám vào

thành bơm và bị ngưng tụ chảy xuống đáy của buồng bơm thì các phân tử khí bị bật ra khối thành bơm và thốt ra ngồi nhờ được bơm cơ học hút đi Bơm khuếch tán không thể hoạt động được trừ

khi được nối uới một bơm cơ học đang làm uiệc ở chân không 24

Trang 31

khoảng 1 Pa để hút các phân tử khong khi tích tụ ra ngoài Để làm giảm dòng hơi đầu đi ngược vào cột kính, người ta thường lắp đặt

các tấm kim loại tiếp xúc và dược làm lạnh với nitơ lông hoặc nước

lạnh tại miệng của bơm khuếch tán để ngưng tụ luồng hơi đầu này và bẫy bắt các chất bẩn khác Các bẫy lạnh như vậy không chỉ tạo

ra môi trường chân không sạch hơn mà còn hoạt động như những

bơm lạnh, cải thiện đáng kể hiệu suất bơm của bơm khuếch tán

Số

và mỗi tầng có thể hạ thấp áp suất xuống gần một Pascal Do d6

bơm khuếch tán ba tầng sẽ có thể tạo độ chân không 10° Pa Nếu

hệ thống chân không ban đầu đã đạt tới 10' Pa thì độ chân không

cuối cùng sẽ trong khoang 10 Pa

ác tháp hình nón xác định số các tầng của bơm khuếch tần

Các bơm khuếch tán ít đồi hỏi bảo dưỡng và có thể hoạt động

trong nhiều năm mà không gặp sự cố Tuy nhiên, nếu áp suất ở lối vào bơm khuếch tán cao hơn 1 Pa thì quá trình khuếch tán sẽ rất kém, thậm chí luồng hơi dầu từ bơm khuếch tán có thể bị ơxy hố và cháy Nếu như áp suất trong cột kính cao hơn quá nhiều áp suất ở lối ra của bơm khuếch tán, một lượng dầu từ bơm khuếch táếmc thể đễ dàng bị thổi đồn vào trong bơm cơ học Khi mức dầu

bơm khuếch tán quá thấp thì hiệu suất bơm bị hạ thấp và bình

quá nóng, bếp có thể bị cháy Do đó cần kiểm tra mức dầu nếu như

hiệu suất bơm sụt giảm nhiều Bơm cần được tháo đỡ, đổ bỏ dầu

cũ, lau chùi bằng dung môi thích hợp, để khô và nạp dâu mới với

một lượng dầu chính xác theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

1.4 Sự tương tác của chùm tia điện tử với mẫu

Cần phải hiểu thấu đáo về tương tác của các điện tử với tiêu

ban trong EM vì chính trên cơ sở các tương tác này mà người ta thu được những thông tin về cấu trúc hình thái và cấu trúc hoá

học của mẫu

Các điện tử trong IM mang năng lượng va chạm với mẫu và

một loạt những tương tác khác nhau có thể xảy ra (4,8) như chỉ ra

trong hình 1-14

Trang 32

Chùm điện tử tới Điện tử tấn xạ Catdt phát quang E2 Hy tử thứ cấp _ ` aS TEM Mẫu Điện tử tấn xạ không đản hỗi Điện tử không tín xạ † Điện từ truyền qua Hình 1.14 Sơ đồ về sự tương tác của điện tử Điện tử tấn xạ đàn hổi „ Chùm điện tử Điện từ thđ cấp 100Ä | wy Auger 10A tdi 304 pan tấn xạ nEƯỢC Vũng ta X-L

` * Vùng xuyên của điện tử

Tại điện thế gia tốc 20 KV và Z=28

Hình 1.15

Sơ đồ vùng tạo thành các loại tia khi

với mẫu điện tử tương tác với mẫu

Hình 1.15 minh hoạ độ sâu của mẫu mà từ đó các hiệu ứng

đặc trưng có thể quan sát thấy từ sự tương tác giữa chùm tia điện

tử và vật liệu mẫu

1.4.1 Tương tác của chùm tia điện tử với mẫu dày (sử

dụng trong SEM)

Điện tử tán xạ ngược

Điện tử tán xạ ngược là những điện tử tương tác với hạt nhân

nguyên tử của mẫu và đã tán xạ một hoặc nhiều lần trong mẫu

Chúng có thể đi ngược lại và thoát ra khỏi mặt mẫu với năng lượng

gần bằng năng lượng của điện tử tới Sự tạo ra các các điện tử tán

xạ ngược liên hệ chặt chẽ với nguyên tử số của các nguyên tố cấu thành trong mẫu Các điện tử tán xạ ngược có thể được thu lại để

tạo ảnh khi dùng một đầu đò đặc biệt trong kính hiển vi điện tử

truyền qua hoặc kính hiển vi diện tử quét Những đầu đò như vậy

được sử dụng để nhận biết những nguyên tố có nguyên tử số khác nhau Những nguyên tố có nguyên tử số cao hơn sẽ làm bật ra

nhiều hơn điện tử tán xạ ngược và thể hiện sáng hơn so với những

nguyên tố có nguyên tử số thấp hơn trên ảnh điện tử tán xạ ngược

26

Trang 33

Điện tử bị hấp thụ

Điện tử hấp thụ là những điện tử bị mất năng lượng khi đi

qua mẫu Do bị mất năng lượng, chúng bị hấp thụ và qua đó làm

các nguyên tử và hạt nhân nguyên tử của mẫu bị kích thích Chính điều này làm một loạt hiệu ứng xảy ra như mẫu bị nóng lên, bị ion hoá, bị từ hoá, phát các bức xạ thứ cấp (điện tử thứ cấp, điện tử Auger, tia X va catét phdi quang) va dao déng plasma Mac du

phát nhiệt và ion hoá là những hiện tượng làm tổn hại mẫu trước tiên nhưng có thể giảm các hiệu ứng này bằng cách tăng năng

lượng của điện tử tới

Những tương tác xảy ra ở bể mặt mẫu được dùng để nghiên cứu mẫu dạng khối hoặc mẫu day (SEM)

1.4.2 Tương tác của chùm tia điện tử với mẫu mỏng (sử

dụng trong TEM)

Điện tử không tán xạ

Điện tử không tán xạ là những điện tử khi đi qua tiêu bản chỉ bị lệch hướng rất ít hoặc mất mát năng lượng rất ít Chúng hầu

như xuyên thẳng qua vật liệu mẫu

Điện tử tán xạ đàn hồi

Điện tử tán xạ đàn hồi là những điện tử xuyên qua vùng gần hạt nhân nguyên tử của mẫu, bị hút bởi lực hut Coulomb va bi

lệch khỏi hướng chuyển động ban đầu Tuy nhiên, chúng vẫn giữ

nguyên năng lượng ban đầu Số điện tử tán xạ đàn hồi tăng lên theo độ dày của mẫu Góc tán xạ của các điện tử càng lớn khi

nguyên tử số của nguyên tố càng cao và điện áp gia tốc càng thấp

Việc sử dụng khẩu độ thấu kính vật trong hệ thống tạo ảnh của hiển vi điện tử truyền qua là để loại bỏ những điện tử tán xạ đàn hồi cao Khẩu độ càng nhỏ thì tỷ lệ những điện tử bị loại bỏ

càng lớn Những điểm sáng, tối trên màn quan sát chính là do đã

loại bỏ những điện tử này và tạo ra ảnh cuối cùng Hiệu ứng này

Trang 34

được biết đến như là sự tương phan biên độ hoặc nói một cách khác là sự tương phản khối lượng và độ dày

Trong kính hiển vi điện tử truyền qua, các hiệu ứng từ tương

tác này tạo ra sự tương phản của ảnh (đặc biệt đối với những tiêu bản phủ kim loại nặng) đều bắt nguồn từ những điện tử tán xạ

đàn hồi

Điện tử tán xạ không đàn hồi

Điện tử tán xạ không đàn hồi là những điện tử va chạm với điện tử quï đạo nguyên tử của mẫu Vì khối lượng của các điện tử

giống nhau nên những điện tử chùm tia bị làm chậm lại Năng

lượng của nó truyền cho điện tử của lớp vỏ Vì góc tán xạ tương đối nhỏ nên hầu như mọi điện tử tán xạ không đàn hồi đều đi tới màn và tạo ra nền ảnh và làm giảm độ tương phản của ảnh điện tử

Hiện nay một số kính hiển vi điện tử truyền qua được trang bị các bộ lọc năng lượng Các điện tử có năng lượng khác so với năng

lượng điện tử tới có thể bị lọc bỏ Chính điều đó cho phép loại bỏ

nền ảnh do các điện tử tán xạ không đàn hồi sinh ra và làm tăng

đáng kể độ tương phản

1.5 So sánh kính hiển vi điện tử với kính hiển vi

quang học

Hình 1.16 biểu diễn cấu tạo của kính hiển vi quang học LM),

kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kính hiển vì điện tử quét

(SEM) (4)

e - Với LM, chùm ánh sáng khả kiến từ nguồn sáng (bóng đèn) đi

qua thấu kính hội tụ, qua tiêu bản mỏng và bị hấp thụ ở mức

độ khác nhau tuỳ theo bước sóng khác nhau, phóng đại ảnh

tiêu bản bằng các thấu kính thuỷ tỉnh và quan sát được các

ảnh truyền qua

e V6i TEM, chim dién tử đi xuyên qua tiêu bản, bị tán xạ và

phóng đại ảnh tiêu bản qua các thấu kính điện từ và do đó

Trang 35

những lát cắt rất mỏng cắt từ mẫu khối sinh học được dùng dé

quan sát h này cho phép ta thu được những thông tin bên

trong của mẫu,

s - Với SEM, các điện tử tới được hội tụ lại thành tia mảnh nhờ các

thấu kính diện từ và quét trên bề mặt mẫu Các tia phát ra từ

mặt tiêu bản (điện tử phát xạ thứ cấp, điện tử tán xạ ngược )

được thu lại tại đầu dò rồi truyền đến bộ biến đổi và khuếch đại

tín hiệu Độ sáng của màn hình được điều chế bằng tín hiệu đã khuếch đại này Do đó SEM được sử dụng để quan sát bể mặt các mẫu khối và ảnh thu được biểu hiện hình thái bể mặt của

chúng Với những mẫu có bề mặt gồ ghề, hình thái của chúng

có thể thay đổi tuỳ thuộc vào hướng quan sát

Khác với kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử sử dụng chùm điện tử và các thấu kính điện từ nên cần duy trì một chân không cao trong kính hiển vi điện tử Tiêu bản sử dụng phải khô

và rất mỏng (với TEM) hoặc khô và có thể có hình khối (với SEM) Độ phóng đại của EM có thể đạt tới hàng triệu lần trong khi độ

phóng đại của LM cao nhất cũng chỉ tới hai nghìn lần

Bảng 1-2 So sánh các đặc trưng của TEM và SEM Các đặc trưng | SEM TEM m ke

Độ phân giải cao nhất | 0.5nm (5 A) 0.1nm (1 A)

Hiệu điện thế gia tốc | 0.2-50kV 20-1250kV =

Dạng mẫu | Khối | Mang mỏng

Anh thu duge | Anh bé mat Ảnh cấu trúc bên trong mẫu

| k& ảnh | Anh néi Ảnh có độ phân giải cao

29

Trang 36

nguồn điện tử súng điện tử thấu kính trung gian mẫu thấu kính chiếu khuéch dai anh cuộn làm lệch CRT độ phân giải 20¿nm 0.1nm 0.5nm độ phóng đại ~ x2000 x 50 ~ x 1.500.000 x10 ~ 1.000.000 Hinh 1-16

Sơ đồ so sánh cấu tạo va hoạt động của kính hiển vi điện tử TEM, SEM với kính hiển vi quang học LM

30

Trang 37

Chuong 2

Kính hiển vi điện tử truyền qua

2.1 Cấu tạo của kính hiển vi điện tử truyền qua

Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) là một hệ thống các bộ

phận chức năng tạo thành một thiết bị dùng chùm tia điện tử

xuyên qua để quan sát và chụp ảnh cấu trúc của những mẫu rất

mồng Đó là hệ thống chiếu sáng (súng điện tử và các thấu kính

hội tụ) buồng mẫu, hệ thống tạo ảnh (thấu kính vật, thấu kính trung gian, thấu kính chiếu) và hệ thống chân không

Hình 2.1 Kính hiển vi điện tử truyền qua JEM1011

Hình 2-1 giới thiệu ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền qua JEOL- JEM-1011, Nhật Bản, lắp đặt tại Học Viện Quân Y, Bộ Quốc phòng (91)

31

Trang 38

Hình 2-2 trình bày sơ đồ các bộ phận chính của cột kính hiển:

vi điện tử truyền qua (4) tt: ————— co Ề ch i Ống trụ Wehnelt Anôt ————_—xmm NÉN———_— Cuộn dây chuẩn Khẩu độ Ue ne thẳng súng cố định Thấu kính ——— 4 héi tu 1 Dei Khẩu độ a6 ¬ I ———— Bộ chống loạn thị cố định của thấu kính hội tụ Thấu kính L | hội tụ 2 Oumum: I: — Khẩu độ của | | thấu kính hội tụ Cuộndây _ ——N a lam léch I LT———— bB@mmghộitụ Thấu kính vật a Giá đỡ mẫu

3N re (lối vào phía bên)

Khẩu độ của “ / I —— Bộ chống loạn thị

Trang 39

2.1.1 Súng điện tử và các thấu kính hội tụ

Súng điện tử

Súng điện tử nằm trên đỉnh của cột kính bao gồm sợi đốt - catốt, lưới màn và anốt Nó có chức nàng tạo ra một chùm điện tử

với độ chiếu sáng cao, kích thước đếm nhỏ và độ ổn định cao (bao

gồm cả độ ổn định trong mật độ đòng và tốc độ chuyển đông của

các điện tử phát xạ) Hình 2.3 vẽ sơ lược cấu tạo của một súng điện tử Nguồn điện cao thế âm được nối trực tiếp với lưới màn, nối gián

tiếp với sợi đốt qua biến trở VR (để thay đổi giá trị điện cao thế

âm) và qua hai điện trở bù trừ BR

Catốt fa

Wehnelt

Thiét dién that

Hình 2.3 Sơ đồ cấu tạo súng điện tử

Sợi đốt (Catốt)

Trong súng điện tử, sợi đốt (tức là catốt) là nguồn phát điện

tử Sợi đốt chuẩn (hình 2.4) được làm bằng một dây vonfam đường kính cỡ 0.1mm, uốn thành hình chữ V Vonfram là kim loại mà các

33

Trang 40

điện tử hoá trị nằm lớp vỏ ngoài có thể đễ dàng bị bật ra khỏi bể

mặt khi có một điện trường ngoài đủ lớn tác dụng Để khởi động

catốt, trước hết người ta đặt một điện thế âm (thí dụ như - 50kV, -

75kV hoặc -100 kV) tác dụng lên catốt, sau đó tăng dần giá trị

đồng một chiều chạy qua sợi đốt để đốt nóng tới khi đạt được sự

phát xạ điện tử (phát xạ nhiệt Khi sợi đốt bị đốt quá nóng (dòng

đốt quá cao), số các điện tử phát xạ tăng lên mạnh, sợi đốt có thể bị

nóng chảy và bay hơi trong chân không cao của kính Tại một

nhiệt độ tối ưu, súng đạt được sự phát xạ điện tử tốt nhất và sẽ có thời gian làm việc (thời gian sống) dài đến mức chấp nhận được

Người ta gọi đó là điểm bão hoà

Đồ thị trên hình 2.5 cho thấy hiệu suất thu điện tử tốt nhất là khoảng 2600 K và khi đó thời gian sống của sợi đốt vào khoảng 100 giờ Khi bị đốt nóng vượt quá điểm bão hoà khoảng 200 K thì thời gian sống của sợi đốt bị giảm nhiều Nguyên nhân chủ yếu làm sợi đốt hỏng sớm là quá trình đốt nóng vượt quá điểm bão hoà, sự phóng điện thế cao do nhiễm bẩn ở các chỉ tiết của súng xuất

phát từ chân không kém, từ sự đò khí từ bên ngồi hồ

thốt khí từ các chất bẩn bên trong buồng súng Vì vậy, cần luôn

luôn kiểm tra, theo dõi điện áp gia tốc (kV, HV, HT) va dòng phát

xạ hoặc dòng bão hoà ngay từ khi trong cột kính bắt đầu có chùm điện tử được tạo ra I1 & ZI 2 < 5 3 g) VỊ 10 5 x Sy \ 3 E š Si ` 3 6 K x 5 r —+o 2000 789 240 200 — 2800

Nhiệt độ sợi đốt (filamen!)

Hình 2.4 Sợi đốt vonfram chuẩn Hình 2.5 Lựa chọn điểm bão hoà thích hợp

hình chữ V của sợi đốt trên hai đường cong

34