Phần 2 cuốn sách cung cấp cho người học các kiến thức: Phương pháp làm tiêu bản sinh học hiển vi điện tử quét, phương pháp miễn dịch hiển vi điện tử, xử lý thông tin trong ảnh hiển vi điện tử sinh học. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
Trang 1Chương 4
Kính hiển vi điện tử quét
Kính hiển vi điện tử quét (SEM) được cấu tạo từ một số hệ
thống chức năng khác nhau gồm:
«— Hệ thống quang điện tử dùng để hội tụ và điều khiển chùm
tia điện tử
« Buồng mẫu dé dat va thao tác mẫu
»« Các đầu dò dùng để thu ghi các loại bức xạ Các tín hiệu thu được này sẽ được xử lý tiếp qua hệ thống các mạch điện tử để
hiện thị thành ảnh trên thiết bị quan sát và phân tích
© Hệ thống chân không để tạo chân không trong cột kính, đảm
bảo sự hoạt động an toàn của các hệ thống trên
Hình 4.1 Kính hiển ví điện tử quét JEOL - JSM5410LV
Trang 2Trên hình 4.1 là ảnh một kính hiển vi điện tử quét (SEM) kiểu JSM5410LV do hang JEOL Nhat Bản sản xuất, lắp đặt và sử dụng
tại Viện 69 Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh
Sơ đồ nguyên lý cấu tạo và hoạt động của một kính hiển vi
điện tử quét (SEM) điển hình được trình bày ở hình 4.2 Sáng điện tử 'Thấu kính hội tụ Cl Thấu kính ity C2 tư Nguồn nuôi mạch quét hội tụ C3 iN “thấu kính vật) Hình 4.2
Sơ đồ nguyên lý cấu tạo của kính SEM
4.1 Hệ thống quang điện tử của SEM (4,22)
Hệ thống này bao gồm súng điện tử, các thấu kính điện từ, các cuộn quét chùm tia điện tử và bộ chống loạn thị tham gia vào việc điểu khiển và làm sắc nét chùm điện tử khi đi ra khỏi súng và
trước khi đập lên:mẫU: + „\¡¿- 02 (v 007 t6 G05
4.1.1 Súng điện tử
Cũng giống như ở kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM),
chùm tia điện tử của SEM được phát ra từ súng điện tử Súng điện
tử cũng được chia thành hai loại gồm: súng phát xạ nhiệt và súng
phát xạ trường Súng phát xạ nhiệt được cấu tạo từ ba bộ phận:
112
Trang 3catốt ống trụ Wehnelt và anốt như đã miêu tả ở chương hai Các điện tử nhiệt phát xạ từ catốt được gia tốc nhờ điện thế đặt giữa catốt và anốt để tạo thành chùm điện tử năng lượng cao Trong quá trình chuyển động về anốt, chùm điện tử bị thu hẹp lại đến
đường kính khoảng 50m tại điểm "thiết diện thất" nhờ diện thế
lưới tác dụng giữa một điện cực lưới và ống trụ Wehnelt, Đây
chính là đốm hội tụ bạn đầu của các điện tử Có hai loại catốt
thường được dùng trong SEM là: catốt vonphram dạng chữ V va
catốt LaB¿ Catốt LaB, cho thiết điện thất nhỏ và tạo ra độ sáng
cao SEM được lắp súng điện tử phát xạ trường có thể tạo ra độ
sáng cao hơn và độ phân giải cao hơn
4.1.2 Hệ thống thấu kính hội tụ
Hệ thống thấu kính hội tụ bao gồm một loạt hai hoặc ba thấu kính được sử dụng để làm nhỏ đốm hội tụ ban đầu đi nhiếu lần, có
khi chỉ còn 2nm hoặc nhỏ hơn nữa Kích thước đốm nhỏ là rất quan trọng vì nó cho ta độ phân giải tốt hơn khi cần tạo ảnh với độ
phóng đại cao
Thấu hính hội tụ 1 uà thấu binh hội tụ 2
Như có thể thấy trên hình 4.9, thấu kính hội tụ thứ nhất C, có
tác dụng làm giảm kích thước đốm hội tụ ban đầu đã tạo thành ở
vùng súng điện tử của chùm tia điện tứ Khi đòng điện chạy qua
thấu kính hội tụ thứ nhất C, tăng thì tiêu cự của thấu kính bị ngắn lại và đốm hội tụ ban đầu của chùm điện tử trở nên nhỏ hơn
Thấu kính €; có tiêu cự ngắn sẽ làm cho chùm điện tử khi đi ra
khỏi thấu kính có độ phân tán rộng và như thế chùm điện tử sẽ mất đi một số lướng lớn các điện tử sẽ trước khi đi đến thấu kính kế tiếp C; Nhờ đó, độ phân giải ảnh được cải thiện nhưng cường độ tín hiệu toàn phần (tức là số các điện tử thứ cấp) đi từ mẫu ra sẽ bị giảm đi vì số điện tử của chùm tỉa đập lên mẫu khi đó chỉ có rất ít
Các khẩu độ đặt gần thấu kính do loại trừ các điện tử ở
vùng ngoại biên nên có thể giúp làm nhỏ kích thước đốm và làm
Trang 4giảm cầu sai Các thấu kính hội tụ của SEM đều có chức năng
như nhau và các khẩu độ thường đặt trong cột kính ở những
kích thước cố định hoặc có thể thay đổi nhờ sử dụng các bộ phận
điều khiển trên cột kính
Thấu kính hội tụ cuối cùng
Hình 4.3 biểu diễn tác dụng làm giảm kích thước đốm và hội
tụ ảnh quan sát trên màn hình Nếu gọi Dạ là kích thước đốm
chùm điện tử hội tụ ban đầu, D; là kích thước đốm chùm điện tử
quét trên mẫu và Xí, M„ M; là độ phóng đại của các thấu hội tụ GG¿G4 B1 dị = do-M,.-M;-M; Gi Các thấu kính hội tụ C2 M: Thấu kính vật C3 Miu M3 Hinh 4.3
Hội tụ chùm điện tử bằng các thấu kính C;, C;, C;
Thấu kính hội tụ cuối cùng C; còn được gợi là thấu kính vật, là thấu kính hội tụ mạnh nhất của SEM và tạo ra sự thu hẹp cuối
cùng kích thước của đốm sáng (tức là đường kính của chùm điện tử)
Trong khi một trong những chức năng chính của các thấu kính hội
tụ thứ nhất và thứ hai là điều khiển cường độ chùm tia bằng cách
điều chỉnh số các điện tử đi vào thấu kính tiếp theo thì thấu kính 114
Trang 5thứ ba tức là thấu kính cuối
lại được sử dụng trước tiên dể tình chỉnh kích thước của đốm sáng
mà không làm mất bớt các điện tử của chùm tỉa Thấu kính cuối
cùng được sử dụng để hội tụ ảnh quan sát trên màn hình hay vào ong thu tia catét (CTR)
‘ang trong hé quang dién tu cua SEM
4.1.38 Nguyén tắc tạo ảnh trong SEM Cuộn dây quét
Như vậy là đốm của chùm tia điện tử phát ra từ súng điện tử
qua hệ thống ba thấu kính được hội tụ chiếu lên mẫu với độ sắc nét cao Nhờ một cuộn dây được gọi là cuộn quét thiết kế nằm
trong thấu kính cuối cùng nuôi bằng dòng điện từ một máy phát
xung quét mà đốm sáng của chùm tia điện tử có thể được dịch chuyển (quét) ngang qua toàn bộ bề mặt mẫu dưới đạng một mạng
lưới Như vậy, việc quét này làm chùm tỉa điện tử dịch chuyển
theo từng đường thẳng lần lượt quét ngang qua mặt mẫu, tức là
mặt mẫu được quét theo cả phương z (dọc) lẫn phương y (ngang)
(xem trên hình 4.4) Các điện tử thứ cấp và điện tử tán xạ rgược
phát ra từ mỗi vị trí trên mặt mẫu bị quét bởi chùm điện tử tới
được thu lại trong các đầu đồ Các điện tử này nhờ các đầu đò được biến thành tín hiệu điện Bằng cách khuếch đại các tín hiệu này và phối hợp chúng với việc điều chế độ sáng màn quan sát hoặc CRT
mà ta thu được ảnh SEM của mẫu A fa | A A a c Cc B B' E E c Cc 8“ —= D hộ 8 8 E E 9 5 F F G G š Hình 4.5 Hình 4.4 Kiểu phóng đại kép
Chùm lia điện tử hội tụ quét thành mạng lưới - Đường (A-AI, C-C' ) quét trên mẫu
trên mặt mẫu Quét theo hang ngang, lẫn'iẩu với cùng một độ dài Đường kế tiếp
ES : o chuyển động xuống dưới và lại quét (g.p/, D-D/ ) quét vdi dé dai ngan hon
115
Trang 6Độ phóng đại ảnh của SEM
Sự phóng đại ảnh của SEM được biểu hiện bằng sự khác nhau
về kích thước của mẫu và kích thước của ảnh trên màn hình quan sát Nếu gọi M là độ phóng đại ảnh mẫu của SEM, L là độ dài hiện trên màn hình, ? là độ đài quét trên mẫu thì
a, I
Độ phóng đại ảnh có thể thay đổi bằng cách thay đổi độ dai
mà chùm tia quét ngang qua mẫu Thí dụ nếu chùm điện tử quét
ngang qua mẫu 10mm và làm hiện trên màn quan sát một độ dài là 10em thì độ phóng đại là 10x Nếu như độ dài quét là 1m ứng
với độ dài trên màn quan sát là 10em sẽ có độ phóng đại cuối cùng 100.000x
Kiểu phóng đại kép
Kiểu phóng đại kép được thực hiện bằng cách quét luân phiên theo những độ phóng đại khác nhau trên mẫu Thí dụ như lần quét
thứ nhất trên mẫu được thực hiện với độ phóng đại 100x trong khi
lần quét kế tiếp với độ phóng đại 1000x Nếu tất cả những lần quét số lẻ được hiện lên trên vùng diện tích 100x và những lần quét số chăn
hiện lên trên vùng diện tích 1000x thì cùng một lúc người ta nhìn
thấy hai độ phóng đại khác nhau (xem hinh 4.5)
Nhờ kiểu phóng đại trong một số SEM là kiểu phóng đại kép, cho nên người ta đồng thời nhìn thấy ở hai màn hình khác nhau hoặc trên cùng một màn hình chia thành hai phần hai ảnh với hai
độ phóng đại khác nhau Tính chất này rất có lợi để định vị nhanh vùng diện tích đáng quan tâm của mẫu ở độ phóng đại thấp và sau
đó có thể quan sát chỉ tiết ở độ phóng đại cao
4.1.4 Bộ chống loạn thị
Thiết bị chống loạn thị là một bộ phận nằm trong thấu kính
hội tụ Ca, được sử dụng để điều chỉnh lại độ méo của đốm tròn do chùm điện tử quét tạo ra trên mẫu Vì phần tử ảnh (pixel) trên màn quan sát có dạng tròn nên đòi hỏi chùm điện tử thứ cấp từ
116
Trang 7diém tương ứng trên mẫu cũng phải phát ra từ một đốm tròn Thí
dụ như nếu đốm của chùm tía điện tử không tròn mà có dạng elip
thì sẽ có thêm thông tin (tức là những điện tử thứ cấp) bổ sung vào
đốm tròn trên màn quan sát (hình elip đặt tương ứng vào hình
tròn) Những đốm không tròn của chùm tia sẽ phát ra ảnh trên màn hình quan sát bị mờ theo một hướng Hiện tượng này (còn gọi là loạn thị) là một trong những lý do chính làm hạ thấp độ phân
giải của SEM Nguyên nhân chính của loạn thị là sự nhiễm bẩn ở
các khẩu độ kính (thường là khẩu độ cuối cùng) gây ra sự méo và
mất đối xứng của trường điện từ Hình 4.6 trình bày các sơ đổ
miêu tả chùm tia điện tử hội tụ khi bị loạn thị (A) và khi đã chỉnh loan thi (B) Một tù đúc, = Oco+0O A Dạng chùm tia khi bị loạn thị B Dạng chùm tia khi đã chỉnh loạn thị Hình 4.6
So dé chim tia điện tử hội tụ
Bộ chống loạn thị thường có 6 đến 8 cuộn đây điện từ nhỏ nằm
ở phía trong lỗ khoan của thấu kính hội tụ cuối cùng Bộ chống loạn thị dùng để chỉnh lại sự méo lệch và mất đối xứng của trường điện từ bằng cách đưa vào một trường tác dụng ngược lại có cường độ (biên độ) tương ứng theo một hướng (phương vị) thích hợp để
cân bằng trường bị móo Việc điều chỉnh này thường được thực
hiện bằng tay Tuy nhiên những SEM mới nhất đã được trang bị
những bộ phận tự chống loạn thị, cho phép điều chỉnh nhanh và chính xác độ loạn thị, tiết kiệm thời gian và đảm bảo sự chống loạn
thị chính xác
117
Trang 84.2 Buồng mẫu và chế độ chân không
trong buồng mâu
4.2.1 Buồng mẫu
Buồng mẫu nằm dưới cột kính là nơi đặt mẫu, các đầu dò diện
tử, đầu đò tia X và được duy trì ở chế độ chân không cao như ở cột
kính hoặc chân không thấp
Hình 4.7 giới thiệu ảnh buồng mẫu (hình 4.7A) và ảnh các đầu
đò trong buồng mẫu (hình 4.7B)
EDS Detector
Hinh 4.7
Ảnh buồng mẫu và các đầu dò
Mẫu thường được giữ chắc trên một giá kim loại và được tiếp đất để ngăn chặn sự tích điện một chiều do các điện tử của chùm
tia đập lên mẫu Do cần thiết phải định hướng mẫu một cách
chính xác đối với chùm điện tử và đầu dò nên hầu hết các SEM
đều có những điều khiến để quay và dịch chuyển mẫu theo các phương x, y và z Ngoài những điều chỉnh quay tròn, ngang dọc và theo chiều eao, còn có thể làm nghiêng mẫu để thu được nhiều điện tử bằng các đầu đò riêng Việc điều chỉnh đúng những chuyển động này, không chỉ cho phép định vị chính xác những vùng mẫu cần nghiên cứu mà còn giúp thu được những thông số chính xác về
độ phóng đại, độ tương phần, độ sâu của trường nhìn và độ phân giải
118
Trang 94.9.9 Chế độ chân không trong buồng mẫu (22)
Khi SEM hoạt động, cột kính và buồng mẫu cần luôn luôn trong trạng thái chân không vì các lý do nêu trong chương 1 Độ
chân không trong SEM thường đạt tới giá trị 10ˆPa nhờ có bơm cơ
học và bơm khuếch tán
Hiện nay cùng với loại SEM thông thường còn có một loại
SEM khác gọi là LV- SEM mà trong đó buồng mẫu có thể nằm
trong chân không cao hoặc chân không thấp Trong LV- SEM người ta lắp thêm một hệ thống bơm riêng biệt để có thể giữ buồng
mẫu ở trạng thái chân không thấp trong khi cột kính vẫn có ở chân không cao (Trong hình 4.8, RP2 là bơm tạo chân không thấp cho buồng mẫu (màu tối) còn cột kính ở chân không cao (mau sang)
*Trong những điều kiện đó, các phân tử khí bao quanh mẫu bị ion hoá bởi chùm điện tử tới và điện tử phát ra từ mẫu và kết quả làm trung hoà sự tích điện trên mặt mẫu Do đó những mẫu không dẫn điện cũng có thể quan sát được hoặc có thể tiến hành phân tích nguyên tố
mà không cần phun phủ kim loại lên mặt mẫu Mẫu ngậm nước hoặc
Trang 104.3 Sự tương tác của chùm tia điện tử với mẫu
và cách ghi nhận và phân tích (4,8,22)
Khi các điện tử trong SEM được gia tốc với hiệu điện thế
khoảng 15 đến 25kV dap lên mẫu, chúng sẽ tương tác với mẫu Tuỳ thuộc vào tốc độ của các điện tử cũng như khối lượng riêng của mẫu mà chùm tỉa điện tử có thể đi vào trong mẫu tới những độ sâu khác nhau Vùng đầu tiên ở bề mặt mẫu mà các điện tử đi
vào chỉ là một đốm đường kính 2nm, nhưng sau đó các điện tử
tán xạ hỗn độn khắp nơi trong mẫu cho tới khi năng lượng của chúng bị mất vì tương tác với các nguyên tử của mẫu Hình vẽ (hình 4.9) có dạng tiết diện của một giọt nước, mỉnh hoạ vùng mẫu mà từ đó các loại tia được tạo ra và lan truyền khi có chùm điện tử chiếu vào
Như ta đã biết, có nhiều loại tia hình thành trong quá trình
tương tác, nhưng để nhận biết được những thông tin về cấu trúc hình thái và cấu trúc thành phần các mẫu nghiên cứu trong SEM,
đặc biệt là các mẫu sinh học, người ta thường sử dụng ba loại bức xạ, đó là các điện tử thứ cấp, các điện tử tán xạ ngược và tia X —— — Chùm điện tử -~~ Điện tử thứ cấp {vùng nm) Điện tử tán xạ ngược (vùng 0.I1nm-100am) Điện tử Auger Tia X liên tục - ~_ Những tia X đặc trưng Tia X huỳnh (ving pm) quang Hinh 4.9
Sơ đồ biểu hiện vùng các loại bức xạ lan truyền
4.3.1 Điện tử thứ cấp và đầu dò điện tử thứ cấp
Các điện tử thứ cấp bị bật ra khỏi mẫu do quá trình ion hoá Việc thu được những điện tử này phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác
Trang 11nhau như nắng lượng của chùm tỉa điện tử tới (tức là hiệu diện thế
gìa tốc), nguyên tử số của nguyên tố có trong mẫu và quan trọng
nhất là độ nghiêng của bề mặt mẫu đối với hướng chùm điện tử tới, Chùm điện tử thứ cấp là bức xạ chính được sử dụng để tạo ảnh
trong SEM Do phụ thuộc nhiều vào góc tới của chùm tia tới nên
độ tương phản của ảnh hình thái mặt mẫu rất cao Như vậy,
những mặt thô như mặt gẫy hoặc mặt mẫu kim loại bị ăn mòn sâu
đều có thể nghiên cứu và kiểm tra một cách chỉ tiết bằng cách dùng những điện tử thứ cấp này lộ tiền khuếch đãi Miu ~=~= + 4® :Điện tử thử cấp ——8:Điện tử tần xã ngược |
À- Dà điện tử thử cấp B Đầudò điện tỲthứ cấp
A: Cách sắp xếp đầu dò B: Minh hoạ sự hoạt động
điện tử thứ cấp trong SEM của đầu dò và các mạch phụ trợ
Hình 4.10
Sơ đồ đầu dò điện tử thứ cấp
Đầu do điện tử thứ cấp được sử dụng ở SEM để biến đổi chùm điện tử thứ cấp thành tín hiệu điện, xử lý chúng và hiển thị trên màn quan sát Thông thường người ta đùng một đầu đò nhấp nháy để thu ghi các điện tử thứ cấp này
Hình 4.10A là sơ đồ bố trí đầu dò điện tử thứ cấp trong SEM
Theo đó chỉ có những điện tử thứ eấp 8 đi vào đầu dò còn những điện tử tán xạ ngược R thì không
Hình 4.10B là sơ đồ nguyên lý hoạt động của hệ mạch gồm
đầu dò điện tử thứ cấp — ống nhân quang diện — mạch tiền khuếch đại Ở đây tín hiệu điện tử thứ cấp thu được từ đầu đò đi vào ống
nhân quang điện để nhân biên độ tín hiệu và bộ tiền khuếch đại để 121
Trang 12khuếch đại tiếp tín hiệu trước khi đi vào bộ khuếch đại chính của SEM Nhờ hiệu điện thế lối ra từ tiền khuếch đại tăng lên mà độ
sáng chung của ảnh trên màn quan sát tăng lên (cả những vùng
sáng nhất lẫn những vùng bị che khuất)
4.3.2 Điện tử tán xạ ngược và đầu dò điện tử
tần xạ ngược
Điện tử tán xạ ngược là những điện tử bị tán xạ một hoặc nhiều lần trong mẫu và quay ngược ra khỏi mặt mẫu Việc thu được
những điện tử này phụ thuộc chủ yếu vào những yếu tố như đã mô tả với những điện tử thứ cấp, nhưng quan trọng nhất là phụ thuộc
vào nguyên tử số Người ta có thể nhận được ảnh thể hiện những thay đổi về cấu trúc trên bề mặt tạo mẫu bang cách dùng những
điện tử tán xạ ngược, khi đó độ tương phản về cấu trúc tăng lên
Đầu dò điện tử tán xạ ngược là những đầu dò có thiết kế đặc
biệt, có thé lap dat trong SEM để thu những điện tử tần xạ ngược
Tất cả những đầu dò này đều thiết kế và bố trí để làm tăng tín hiệu thu được như tăng điện tích mặt của đầu dò, đặt cao ở phía trên mẫu để các điện tử tán xạ ngược có thể đi vào được Một số
loại đầu đò khác nhau được sử dụng, nhưng loại chính sử dụng
trong sinh học vẫn là đầu dò chất rắn
Đầu đò chất rắn là loại đầu đò điện tử tán xạ ngược được sử
dụng phổ biến nhất vì rẻ, có độ nhạy hợp lý, đễ dàng bảo dưỡng và
chiếm một không gian nhỏ trong buồng mẫu Loại đầu đò chất rắn
điết silicon 1a mét dia tròn chia thành hai hoặc bốn phần, được đặt
trực tiếp dưới thấu kính hội tụ cuối cùng (hình 4.11) Những điện tử tán xạ ngược đập lên điốt làm bật ra những điện tử trong silicon và phát ra đòng điện tỷ lệ với số các điện tử đập lên nó Tiếp đó
đồng điện nhỏ này được khuếch đại bằng mạch điện tử và cuối
cùng tín hiệu được đưa tới màn hình Tại đây, các dòng điện được
hiển thị như những đốm sáng trên màn hình Hình 4.12 là ảnh của
đầu đò chất rắn
122
Trang 13Chúm diện tử tối —_ Hình 4.11 Hình 4.12 Hình vẽ đầu dò chất rắn Ảnh của đầu dò chất rắn 4.3.3 Tia X và phổ kế EDS
Khi chùm tỉa điện tử va chạm với các nguyên tử trong mẫu nó có thể làm một điện tử liên kết từ một lớp như lớp K bật ra khỏi
mẫu Nếu một điện tử khác từ mức năng lượng cao hơn như mức L chuyển vào vị trí trống này thì một tia X phát ra có năng lượng bằng hiệu năng lượng giữa hai lớp này (hình 4.13) Vì những mức
năng lượng của những lớp vỏ này khác nhau từ nguyên tố này đến
nguyên tố khác nên tia X phát ra có năng lượng đặc trưng và có thể xác định được chính xác các nguyên tố theo những tia X phát
ra Bằng cách thu những tia X phát ra từ mẫu người ta có thể tiến
hành phân tích định tính hoặc định lượng thành phần các nguyên
tố cấu tạo lên mẫu Tính ưu việt nhất của SEM là sự phân tích có
thể tiến hành ở một vùng rất nhỏ có đường kính cỡ 1 m (phân tích
điểm) trong khi những phương pháp phân tích tia X thông thường
Không thể làm được
Có hai phương pháp để phân tích những tia X đặc trưng:
Phương pháp phổ kế tia X tán sắc bước sóng (WDS) và phương
pháp phổ kế tia X tán sắc năng lượng (EDS) WDS được D
Castaing chế tạo ra từ những năm 1960 để lắp vào máy vi phân
Trang 14tích đầu dò điện tử EDS được J.C Russ ché tao va hién nay được dùng rộng rãi vì đễ sử dụng và cho phép tiến hành phân tích định
tính mẫu trong một thời gian ngắn
Hinh 4.13
Sơ đồ giải thích nguyên lý phát xạ tia X đặc trưng
Hình 4.14 trình bày sơ đồ mô tả phổ kế tia X tán sắc năng lugng (EDS)
Trong phương pháp EDS, tia X được thu bằng một đầu đò loại
bán dẫn Si(L) đặt tại đỉnh của đầu dò Biên độ của những xung đồng phát ra bởi chùm tia X tỷ lệ với năng lượng của những tia X
tới Bằng cách chuẩn lại bộ vi phân tích đa kênh với mẫu chuẩn ta có thể đo được những tia X đặc trưng từ mẫu chưa biết để nhận
biết các nguyên tố và hàm lượng của chúng
Blah Nite Sag HG dit khiển và hiến tị Chim digo tử Bộ phân tích đạ kênh Sơ đồ khối hệ thống EDS
Trang 154.3.4 Xử lý tín hiệu và ghi lại ảnh Xử lý tín hiệu
Những tín hiệu phát ra khi chùm tỉa điện tử đập lên mẫu
dược sử dụng để ghi nhận những thông tin về mẫu và đó là
những tín hiệu thực Nhưng trong thực tế, ngoài Lín hiệu thực
còn có những tín hiệu ngoại lai được gọi là nhiễu bắt nguồn từ
một số yếu tố khác Thí dụ như trong trường hợp các điện tử thứ
cấp (hình 4.15) SE1 và S8E2 đại điện cho tín hiệu thực phát ra từ
mẫu Còn nhiễu đại diện bằng các điện tử SE3 và SE4 phát sinh
ra do các điện tử tán xạ ngược BS1 và B83 đập lên những bề mặt kim loại khác của SEM Đầu dò SE Hình 4.15
Hình vẽ thể hiện câc loại tia thu được bằng đầu dò SE
Nhiễu thường biểu hiện trên ảnh như “tuyết” trống rỗng Nhiễu cũng có thể sinh ra khi chùm tia đập lên những chỉ tiết, bộ
phận của cột kính hiển vi (các khẩu độ cuối cùng) phát ra những
điện tử thứ cấp Các mạch điện tử bị hỏng cũng có thể tạo ra nhiễu
trong quá trình xử lý tín hiệu Để biểu điễn mối tương quan giữa
tín hiệu thực và tín hiệu ngoại lai người ta dùng một đại lượng đo
bằng tỷ số giữa cường độ tín hiệu thực và cường độ tín hiệu nhiễu
125
Trang 16Khi nhiễu tăng tới mức độ không chấp nhận được (ảnh có chất
lượng kém) thì người La nói tỷ số này thấp Khi đó người ta cần
giảm mức độ nhiễu hoặc tăng tín hiệu để thu được ảnh tốt Vì rất
khó khăn để giảm mức độ nhiễu nên hầu hết những nhà nghiên
cứu đều tăng lượng tín hiệu phát ra từ mẫu
Ghi anh
Việc ghi lại ảnh hiện lên từ ống tia catốt hoặc màn quan sat
cua SEM khae véi trong TEM Khong giống như ở TEM, ở đó các điện tử tương tác trực tiếp với môi trường ảnh, còn các ảnh của
SEM thường được chụp trực tiếp từ màn quan sát qua thấu kính
cua may anh loại phim cuộn 35mm hoặc máy ảnh phim tấm loại lớn 4” x 5” Khi chụp cái chắn sáng của máy ảnh mở và duy trì
trong khi chùm điện tử quét chậm qua mẫu
Các loại phim dùng trong SEM
Một số loại phim đen trắng thông thường có thể được sử dụng
để ghi lại ảnh như những phim cuộn 35mm Pan kỹ thuật hay
Kodak 2415 Thông thường nhất, các nhà nghiên cứu sử dụng phim chụp lấy ngay loại 4 * 5 như Polaroid 55, gồm có cả hai loại
positiv và negativ chất lượng cao
Gần đây, những ảnh số của SEM rất thuận lợi, nó có thể lưu
giữ ảnh trên đĩa hoặc in ra từ những máy in khác nhau Mặc dầu
những ảnh này chất lượng không cao như những ảnh chụp phim,
nhưng những cải tiến công nghệ trong những năm gần đây đã làm cho nó có thể thay thế những ảnh chụp trên phim
4.4 Ảnh hưởng của khẩu độ thấu kính C3 và khoảng cách làm việc lên chất lượng ảnh của SEM
Chất lượng của ảnh được đánh giá bằng nhiều thông số khác nhau, nhưng ở đây ta chỉ bàn tới độ sâu của trường và độ phan giải
126
Trang 174.4.1 Ảnh hưởng của khẩu độ thấu kính C3 và khoảng
cách làm việc lên độ sâu của trường nhìn
Độ sâu của trường nhìn
Ta đã biết độ sâu của trường nhìn Ð, là độ sâu ở trong mẫu mà ảnh hiện lên hội tụ và dược biểu diễn bằng công thức: d D,=— a O đây đ: năng suất phân giải của thấu kính œ: bán góc khẩu độ
Hình 4.16 biểu diễn ảnh hưởng của khẩu độ thấu kính hội tụ
tới độ sâu của trường
| Khoắng cách làm việc SÀN Ý Khoảng cách làm việc
¬ n sa YO đâu cổa trường
Hình 4.16
Độ sâu của trường tăng lên khi dùng những khẩu độ nhỏ hơn
Độ sâu của trường đã tăng lên khi dùng những khẩu độ thấu
kính nhỏ hơn
Thấu kính hội tụ cuối cùng C3 thường có những khẩu độ điều
chỉnh từ bên ngoài để thay đổi đường kính Thông thường những khẩu độ nhỏ nhất Cä cỡ 50-70um dùng để tạo ra những đốm có
năng lượng thấp để phát ra các điện tử thứ cấp và tạo ảnh Những
khẩu độ có kích thước 200m hoặc lớn hơn được dùng để tạo ra
những đốm lớn với số điện tử lớn hơn Những đốm lớn có một năng
Trang 18lượng lớn có thể làm tổn hại tới những mẫu không bền, nhưng lại được sử dụng để thu được tia X dùng trong phân tích nguyên tế
thay vì mục đích tạo ảnh
Như vậy các khẩu độ của C3 là những bộ phận quan trọng của SEM vì chúng không chỉ ảnh hưởng tới độ sâu của trường mà cồn ảnh hưởng tới kích thước đốm chùm tia điện tử
Hình 4.17 biểu diễn ảnh hưởng của khoảng cách làm đến độ sâu của trường ở đây khoảng cách làm việc là khoảng cách từ thấu
kính hội tụ cuối cùng tới vị trí đặt mẫu
Vì bán góc khẩu độ sẽ bị giảm khi tăng khoảng cách làm việc
nên độ sâu của trường sẽ tăng lên khi tăng khoảng cách làm việc
Ì) Thu kính bội tụ caối cũng a m G mee — Kifu 05 A Khoảng cách lâm việc \ ` Thấu i hội tụ cuối cùng I—Khẩu độ A Khoáng cách làm việc Y- Độ Mu của trường Hình 4.17
Độ sâu của trường tăng lên khi khoảng cách làm việc tăng lên
4.4.2 Ảnh hưởng của khẩu độ thấu kính C3 và khoảng
cách làm việc lên độ phân giải của ảnh
Độ phân giải của ảnh
Cũng như bất kỳ một dụng cụ phóng đại nào độ phân giải
anh của SEM là khả năng tạo ra ảnh của hai đối tượng nằm gần
Trang 19Kích thước của đốm cuối cùng ảnh hướng tới độ phân giải của
SIM hấu kính cuối cùng dược sử dụng để hội tụ đốm cuối cùng
eua cham tia cho phù hợp với độ phóng đại sử dụng, Khi dém
chùm tỉa điện tử đập lên mẫu thì những điện tử thứ cấp phát ra
được tổng hợp lại và hiện lên như một vết có kích thước cố định
(thường khoảng 100uwm) trên màn hình nên đường kính của đốm chùm tỉa không được vượt quá một kích thước nhất định và tuần theo công thức sau:
100 jum
Kích thước đốm cực đại = —————— Độ phóng đại
Thí dụ nếu ta đang làm việc tại độ phóng đại 10x thì kích thước đốm chùm tia không được vượt quá 10um Độ phóng đại
100.000x yêu cầu kích thước đốm chùm tia cỡ 1nm hoặc nhỏ hơn
Nếu kích thước đốm chùm tia vượt quá những kích thước này thì
sẽ có các điện tử thứ cấp phát ra từ những vùng nằm ngoài vùng
dang tổng hợp thành những phần tử ảnh (pixel), do đó làm ảnh
không sắc nét vì thông tin bên ngoài sẽ có mặt ở đốm sáng hiện
trên màn Như vậy là kích thước của đốm chùm tỉa càng nhỏ thì độ
phân giải càng tốt và thấu kính cuối cùng có thể được sử dụng để
làm giảm đốm chùm tia và do đó để “hội tụ” ảnh Tuy nhiên thấu kính hội tụ cuối cùng chỉ có thể tiếp tục giảm đốm chùm tia khi
những thấu kính hội tụ trước đó giảm độ phóng đại
Từ đó ta thấy những khẩu độ nhỏ hơn không chỉ cho độ phân
giải tốt hơn vì làm giảm cầu sai và kích thước đốm mà còn làm
tăng độ sâu của trường, nhưng tín hiệu phát ra từ mẫu lại giảm vì
chỉ có một số ít điện tử của chùm tia đập lên mẫu
Bảng 4.1
Kích thước khẩu độ và độ phân giải của ảnh
Đường kính khẩu độ (um) 30 100 500
Độ phân giải tốtnhẩt - » xấu nhất
129
Trang 20
Mối liên hệ giữa kích thước khẩu độ và độ phân giải của ảnh
được trình bày trong bảng 4.3
Trên hình 4.16 có thể thấy khi tăng khoảng cách làm việc thì
khẩu độ thấu kính C3 sẽ bị giảm và do đó độ sâu của trường sẽ
tăng lên Chính việc tăng độ sâu của trường đã làm mất một phần
độ phân giải và các thấu kính có tiêu cự đài dễ bị ảnh hưởng bởi
hiện tượng sắc sai hơn
Mối liên hệ giữa khoảng cách làm việc và độ phân giải của
ảnh được thể hiện trong bảng 4.2 Bảng 4.2 Khoảng cách làm việc và độ phân giải của ảnh Khoảng cách làm việc (mm) | 5 10 20 35 Độ phân giải | tết y— xấu nhất
4.5 Cac chế độ vận hành chủ yếu của SEM
C6 thé van hành SEM theo hai cách chính là vận hành với độ
phân giải cao và vận hành với độ sâu của trường nhìn Các cách
vận bành này yêu cầu các thông số trái ngược nhau nên không có thể tối ưu hoá đồng thời hai cách này
4.5.1 Độ phân giải cao
Độ phân giải cao yêu cầu đốm chùm điện tử có độ kết hợp cao và kích thước nhỏ với các quang sai tối thiểu, đồng thời tỷ số giữa
tín hiệu và nhiễu phải tương đối thích hợp Dưới đây trình bày
tổng hợp một số điều kiện cần thiết để thu được độ phân giải cao C6 thé thu dược kích thước của đốm nhỏ bằng cách cung cấp một năng lượng tối ưu cho các thấu kính Thấu kính hội tụ đầu tiên được điều chính để cho đốm nhỏ lại và đốm sẽ được thu nhỏ tiếp nhờ các thấu kính còn lại Cần thận trọng để không cung cấp năng lượng
quá mức cần thiết cho thấu kính hội tụ đầu tiên (cần theo chỉ dẫn
của nhà sản xuất)
130
Trang 21Khẩu độ nhỏ cần được sử dụng để làm giảm kích thước của
đốm sáng của chùm điện tử cũng như để giảm đến tối thiểu hiện tượng cầu sai Tuy nhiên khau độ nhỏ sẽ làm giảm số điện tử trong
chum tĩa và dẫn tới làm giảm cường độ tín hiệu
'Tỷ số thích hợp giữa tín hiệu và nhiễu là yếu tố căn bản để
làm hiện lên những chi tiết có ở trong những vết nhỏ của mẫu Nguyên tắc vận hành ở đây là tạo ra số lượng cao nhất có thể được
các điện tử thứ cấp phát ra từ mẫu Điều này có thể thực hiện bằng cách:
¢ Tao ra mat độ chùm tỉa điện tử lớn hơn bằng cách tăng
cường độ phát xạ điện tử của súng điện tử (thay đổi thế lưới,
chuyển filament gần tới lỗ mở của lưới, chuyển anốt gần tới
filament, sử dụng catốt BaOse hoặc catốt phát xạ trường)
e Thực hiện tốc độ quét chùm tia trên mẫu chậm hơn Thời gian đừng của chùm tia trên mẫu đài hơn sẽ phát ra nhiều
hơn điện tử thứ cấp từ vết Khi chụp ảnh, tốc độ quét chậm
được sử dụng một cách tự động để đạt được cường độ cực
đại của quá trình phát xạ điện tử thứ cấp
Tuy nhiên cần phải nhớ rằng việc làm tăng mật độ dòng của
chùm tia điện tử có thể làm tổn hại các mẫu sinh họe nhạy cảm
Điện thế gia tốc thích hợp sẽ được lựa chọn dựa trên bản chất
của mẫu Nguyên tắc ở đây là sử dụng hiệu điện thế gia tốc thấp
nhất có thể được để bảo đảm tỷ số giữa tín hiệu và nhiễu ở mức độ chấp nhận được Vì sự xuyên sâu của chùm tia và sự phóng đại
kích thước đốm là kết quả của việc sử dụng điện áp gia tốc cao nên
người ta thường cố gắng lựa chọn điện áp đủ cao để giảm tới tối
thiểu hiện tượng sắc sai trong khi không làm giảm độ phân giải
Nếu mẫu đặc thì nên hạ thấp thế gia tốc vì các điện tử của chùm tỉa có khuynh hướng trải rộng gần mặt của mẫu làm tăng kích
thước của vết Hầu như tất eä các mẫu sinh học không quá đặc nên người ta thường sử dụng diện áp gia tốc trong khoảng từ 10 đến
15kV Riêng đối với một số mẫu dễ gãy thì có thể sử dụng điện thế
gia tốc thấp hơn Tuy nhiên, điểu này đòi hỏi những yêu cầu chặt
131
Trang 22chẽ về độ sạch và độ chân không của SEM để làm giảm tối thiểu sắc sai Cần sử dụng khoảng cách làm việc ngắn để thu được đốm
nhỏ cũng như làm giảm tối thiểu sắc sai
Chống loạn thị đốm là điều rất cần thiết Bất kỳ một sự bẩn
nào, đặc biệt ở khẩu độ thấu kính hội tụ cuối cùng cũng gây nên loạn thị và làm giảm độ phân giải Các điện thế gia tốc thấp hơn
đễ bị ảnh hưởng bởi loạn thị cũng như sắc sai hơn nên kính cần lau sạch và có độ chân không tốt để chống loạn thị ở những thế gia
tốc thấp hơn Vì loạn thị luôn xảy ra nên cần phải liên tục kiểm tra và chỉnh loạn thị trong quá trình sử dụng SEM
Độ sâu lớn của trường nhìn
Có thể thu được chế độ độ sâu lớn của trường nhìn bằng cách
dùng các khẩu độ nhỏ, khoảng cách làm việc dài và độ phóng đại
thấp Vì độ phân giải bị giảm do hai điều kiện sau đây nên người
ta có thể tăng kích thước đốm để thu được tỷ số tín hiệu và nhiễu
tốt hơn Cách vận hành này thường được dùng để quan sát những
mẫu có cấu trúc bể mặt phức tạp Về cảm giác, người ta nhận thấy
rằng có thể chỉ để vùng đang quan tâm được hội tụ tốt còn những vùng xung quanh bị mất hội tụ nhẹ
Trang 23Chương ð
Phương pháp làm tiêu bản sinh học
hiển vi điện tử quét
5.1 Mở đầu
Trước khi nghiên cứu những phương pháp làm tiêu bản, ta đã
biết kính hiển vi điện tử quét chỉ sử dụng những chùm tia phat ra
từ mặt mẫu khi có chùm điện tử tới chiếu lên Những chùm tia đó mang thông tin về cấu trúc hình thái, cấu trúc hoá học của mật
mẫu Chùm điện tử thứ cấp cho phép quan sát cấu tric mat mau,
chùm điện tử tán xạ ngược cho phép quan sát thành phần mặt
mẫu và chùm tia X cho phép phân tích nguyên tố của mẫu (23,29)
Vì lý do đó mặt tiêu bản phải là mặt thực của mẫu
Cũng giống như TEM để nghiên cứu cấu trúc hình thái bằng
SEM người ta phải làm sao giữ cho được mẫu nguyên vẹn khi nằm
trong cột kính dưới điều kiện chân không Điều kiện này sẽ làm
cho việc làm khô mẫu khó khăn hơn bởi tiêu bản là một khối có
kích thước milimét hoặc lớn hơn chứ không phải là một lát cắt
móng kích thước nanomét
Khác với các mẫu kim loại, các mẫu sinh học được nghiên cứu là
những mẫu không dẫn điện nên khi chùm điện tử chiếu lên sẽ tích tụ
trên mặt tiêu bản tạo ra một điện trường không mong muốn Để giải
quyết vấn đề này, mẫu cần được phủ một lớp dẫn điện
Trong mười năm gần đây một loạt kính hiển vi điện tử quét
loại mới ra đời như kính LVSEM của hãng JEOL (Japan), L SEM của FBI (Holand) Đây là những kính hiển vi điện tử quét có lắp thêm một hệ thống bơm chân không để có thể duy trì riêng buồng
mâu ở chân không thấp (1-100Pa) trong khi cột kính ở chân không cao (10Pa) Trong điều kiện đó, các phân tử khí bao xung quanh
Trang 24mẫu bị ion hoá bởi chùm điện tử tới Chính điều đó đã làm trung
hoà sự tích tĩnh điện trên mặt mẫu Nhờ đó cả những mẫu không
dẫn điện có thể quan sát được hoặc phân tích nguyên tố có thể tiến
hành mà không cần phủ kim loại lên mặt mẫu Những mẫu ngậm
nước hoặc mẫu chứa dầu cũng có thể quan sát được bằng SEM-LV
Việc dùng SEM để quan sát cấu trúc hình thái, để ghi lại phổ
cấu trúc hoá học của mẫu một cách trung thực không có ảnh giả và
không có các giá trị sai là điều mong muốn của tất cả các nhà
nghiên cứu Trong thực tế, chỉ có một số trường hợp là có thể đưa
trực tiếp các mẫu sinh học vào trong kính để quan sát chẳng hạn
như một số côn trùng Để dùng SEM trong nghiên cứu sinh học,
người ta phải xử lý mẫu một cách phù hợp để thu được thông tin đúng và chính xác về mẫu nghiên cứu
Trước tiên vì SEM dùng để nghiên cứu bể mặt mẫu nên mặt
ngoài của mẫu phải sạch không dính bẩn hoặc mặt mẫu sau khi cắt hoặc bẻ không còn phủ những chất dịch hoặc chất bẩn phủ
trên mặt cắt
Tiếp đó những mẫu sinh học này phải trải qua một loạt các
quá trình xử lý như cố định, rửa, nhuộm kim loại nặng, khử nước
giống như trong kỹ thuật làm tiêu bản cho TEM
Điểm quan trọng cuối cùng là mẫu cần được làm khô và phủ kim loại dẫn điện
Như vậy là để có một tiêu bản cho một mẫu sinh học dùng
cho việc quan sát bằng SEM, người ta cần tiến hành hoặc là theo một qui trình đã biết trước nếu mẫu là loại đã quen thuộc hoặc là
phải thử nghiệm kiểm tra đối chiếu trong quá trình nghiên cứu Mẫu động vật thực vật, rất đa dạng, do đó phương pháp làm mẫu
bao gồm nhiều bước và có thể sử dụng những kỹ thuật khác
nhau Khi tiến hành nghiên cứu, cần tìm ra được phương pháp tối
ưu nhất
Từ những điều bàn ở trên :húng ta thấy việc làm tiêu bản sinh học cho SEM là quá trình gồm nhiều bước, từ lấy mẫu đến xử
lý mẫu cho đủ điều kiện quan sát được trong SEM Mẫu sinh học
cần quan sát cũng có nhiều loại, từ mô của động thực vật lớn đến
134
Trang 25
các loại tế bào nuôi cấy, ví khuẩn Môi loại mẫu có cấu trúc hình
thái và cấu trúc hoá học riêng những điều đặc biệt chung nhất là hàm lượng nước cao có trong những tổ chức sống
Biểu đồ chung về qui trình làm tiêu bản sinh hoe cho SEM
gồm nhiều bước chính được dưa vào trong hình 5.1 " 1 L Thực vật Đông vật | vị khuẩn, vi rút Lấy mô và lau mặt mô Ly tâm lấy cặn Đông lạnh nhanh Đông khô Khô trong không khí
Dung môi chuyển tiếp
Đông khõ tại điểm tới hạn Đặt lên giá có băng dính Phủ lớp dẫn điện Mẫu không dẫn điện Mẫu dẫn điện Hình 5.1
Qui trình làm tiêu bản cho SEM
"Theo qui trình này ta thấy có những bước chính như sau: làm
sạch mặt mẫu, cố định mẫu, khử nước, làm khô mẫu, đặt mẫu lên
giá, phủ lớp dẫn điện cho mẫu và quan sát
135
Trang 265.2 Qui trình làm tiêu bản sinh học cho SEM (29) 5.2.1 Làm sạch mặt mẫu
Vì mặt của mẫu thường là những vùng cần quan sat bang
SEM nên người ta cần phải làm sạch những chất bẩn, lạ nằm trên
mặt mẫu che các cấu trúc của mặt Các chất nhầy, chất bài tiết,
các hồng cầu, vi khuẩn, lymphô bào, các mảnh vỡ của tế bào, nhựa,
sắp, chất bùn, bụi và những chất khác cần phải làm sạch khỏi mặt mẫu trước khi mẫu được cố định Cách lau mặt mẫu phụ thuộc vào bản chất của mẫu, sự pha trộn hoá học trên mặt mẫu và môi trường mà ở đó mẫu được lau Ở điều kiện lý tưởng, mẫu được rửa
rất nhanh trong những dung địch đệm có độ pH, nhiệt độ và độ
thẩm thấu giống như điều kiện tổn tại trong tự nhiên của nó Trong thực tế, đa số những chất bám trên mặt mẫu có thể loại bỏ bằng cách rửa hoặc phun dung dich muối đệm hoặc nước cất Mặt
mẫu có thể làm khô, sạch bằng cách thổi không khí hoặc khí trơ
Phương pháp truyền dịch có thể được sử dụng để rửa máu khỏi các mạch máu
Đối với chất khó làm sạch, ta cũng có thể lau đi khỏi mặt mẫu
bằng cách rửa cẩn thận mặt mẫu nhiều lần với dung dịch đệm
Dùng pipet, lọ nhựa bóp hoặc bình phun nước rửa răng để trực tiếp
tạo ra những dòng dung dịch rửa trên mặt mẫu Khi nghiên cứu
cấu trúc những tế bào biểu mô nằm dọc theo mạch máu, trước tiên
người ta cần bơm vào mạch động vật những dung dịch muối sinh lý
để lọai bỏ những hồng cầu, huyết thanh và sau đó truyền rửa
mạch động vật bằng chất cố định Đối với những lớp phủ khó rửa,
người ta có thể dùng những chất tẩy nhẹ mặt để rửa trước khi cố
định Với những mẫu cứng và khô thì có thể dùng bàn chải lông để làm sạch dưới kính hiển vi stereo (ảnh nổi) hoặc thổi không khí để
loại những mảnh vỡ Trong mọi tình huống, người ta cần xử lý mặt ngoài của mẫu càng nhẹ nhàng càng tốt để tránh tạo ra
Trang 275.2.2 Cố định mẫu
Cũng giống như trong phương pháp làm tiêu bản cho TEM, cố
định mẫu cũng là một bước quan trọng trong qui trình làm mẫu cho SEM nhằm bảo toàn cấu trúc mẫu Ở đây những tiêu chuẩn lựa chọn chất đệm và chất cố định cho TERM cũng dược dùng cho
SEM Mac di một số nhà nghiên cứu cảm thấy rằng những chất
đệm đùng trong SEM cần nhược trương một ít so với những đệm dung trong TEM
Để có dược một qui trình làm tiêu bản cho một mẫu mới, ta
cần dựa trên những qui trình đã biết áp dụng cho SBM để thí
nghiệm lựa chọn cho đến khi phù hợp Nếu những qui trình cho
SEM không dùng được thì những chất cố định sử dụng trong những nghiên cứu TEM sẽ thích hợp của SEM trong mọi trường
hợp Đó là qui trình cố định chuẩn với aldehyde tiếp theo với
osmium-tetroxide nồng độ thấp đã đạt được những kết quả mãn nguyện với TEM trong nhiều năm Dưới những điều kiện nhất
định có thể dùng một số loại chất cố định đặc như đã được dùng trong hiển vi quang học
Cũng giống như trong TEM, người ta cần xem xét độ pH, nồng
độ chất cố định, độ thẩm thấu, loại chất đệm, nhiệt độ và thời gian
cố định Kích thước mẫu có thể ít phải chú ý hơn khi cố định mẫu
cho SEM, vi néi chung người ta chỉ quan tâm tới cấu trúc mặt
ngoài nơi mà thuốc nhuộm tiếp xúc trước tiên và được cố định ngay
lập tức Tuy nhiên, người ta cũng cố gắng để thu được kích thước
vùng cố định cỡ 1mm theo mỗi chiều Điều này sẽ dam bảo không chỉ cho những mô nằm đưới mặt được cố định đồng đều và chống
đỡ cho mặt mẫu mà còn làm cho những bước khử nước tiếp theo sẽ
có hiệu quả hơn Bảng 5-1 đưa ra những chất cố định điển hình thường được sử dụng
Bảng ð.1 cho thấy các chất cố định và chất đệm khác nhau có
thể kết hợp để cố định những loại mẫu sinh học khác nhau Ngoài
ra có thể cho thêm những chất hoá học (như tannie aeide, lysine,
ferrocyanide) hoặc các muối (MgCI,, CaCl,) vào chất cố định để tăng hiệu quả cho việc bảo quản mẫu
187
Trang 28Bảng 5.1 Những chất cố định thưởng sử dụng trong SEM vật - OsO4 -glutaraldehyde/ formaldehyde - glutaraldehyde hoặc glutaraldehyde/formaldehyde tiép theo bang OsO4 = FAA Mau Chất cố định Hệ thống đệm
Sinh vật - glutaraldehyde - cacodylate, phosphate
khéng nhan | _ osmium tetroxide ~ veronal-acetate
~ FAA(10% formalin, 85% ethanol,
5% glacial acetic acide)
Nấm - glutaraldehyde / OsO4 - cacodylate, phosphate
tiếp theo bằng OsO4
~ hơi OsO4 ~ không
- glutaraldehyde tiép theo bằng uranyl | - cacodylate acetate/H2O
Sinh vật -glutaraldehyde/ formaldehyde - cacodylate, collidine
trong nước ~ Parducz (6 phan của 2% của OsO4_ | - không
(nguyên sinh | trong nuớc cộng với 1 phần của HgCI;
động vật, tươi mới
động vật đa BH,
bào) - glutaraldehyde - phosphate, cacodylate
tiếp theo bằng OsO4 nước biển hoặc ao
Thực vật bậc | - glutaraldehyde - dém phosphate
cao tiếp theo bằng OsO4
-FAA duy nhất hoặc tiếp theo bằng - phosphate,s- collidine
OsO4
- Formaldehyde tiếp theo bằng đông | - không
khô
- Hơi OsO4 ~ không
Trang 295.2.3 Rửa và khử nước mẫu
Sau khi cố định, mẫu dược rửa một số lần để loại bỏ những muối đệm và khử nước trước khi làm khô mẫu bằng những phương
pháp khác nhau
Qui trình khử nước cho SEM cũng giống như cho TEM bao
gầm các bước như sau:
(30% ethanol (hoặc aeeton) trong nước cất 3-10 phút, 9 lần
50% ethanol (hoặc aceton) trong nước cất — 3-10 phút, 9 lần
70% ethanol (hoặc aeeton) trong nước cất — 3-10 phút, 9 lần
80% ethanol (hoặc aeeton) trong nước cất 3-10 phút, 2 lần
90% ethanol (hoặc aeeton) trong nước cất 3-10 phút, 2 lần
95% ethanol (hoặc aceton) trong nước cất 3-10 phút, 2 lần
100% ethanol (hoặc aceton) trong nước cất 3-10 phút, 2 lần
Chú ý
Sau khi cố định với Osmium tetroxide, các tiêu bản đã có một
độ dẫn điện nào đó Để cho tiêu bản có độ dẫn điện cao hơn, người ta có thể tiến hành nhuộm dẫn điện tiêu bản ở bước này Quá trình
này cũng làm cho tiêu bản cứng và chống được mẫu bị eo lại trong
quá trình khử nước và làm khô về sau
Qui trình thực hiện như sau:
Rửa —*[ 1%tanicacd | x| Rửa Lal 1% Os04 Rửa |
Quá trình này có thể lặp lại nhiều lần
5.2.4 Làm khô mẫu
Trong thực tế có rất ít mẫu sau khi cố định và rửa có làm thể khô trong không khí và giữ được cấu trúc, vì đa số mẫu sinh học sẽ bị hỏng và phẳng ra hoặc bị nhăn nhúm Một số mẫu mô như mô
phổi sẽ bị nhăn nhúm chỉ còn một nửa thể tích ban đầu khi khô trong không khí
139
Trang 30Vấn đề chính ở đây là sự chuyển tiếp mặt ranh giới giữa pha
lỗng và pha khí qua mẫu Khi khô trong không khí, những lực căng mặt ngoài tại mặt ranh giới này vào khoảng 3,000psi Hầu
hết những mẫu sinh học sẽ bị phẳng ra bởi những lực này
Để ngăn chặn sự sụp đổ cấu trúc, cần phải tránh mặt ranh giới này đi qua mẫu khi khô
Muốn vậy, người ta có thể dùng các kỹ thuật như khô tại
điểm tới hạn, đông lạnh khô hoặc những qui trình làm khô khác trong chân không
5.9.4.1 Làm khô mẫu tại điểm tới hạn
Làm khô mẫu sinh học tại điểm tới hạn (CPD) để nghiên cứu bằng SEM đã được sử dụng từ trước đây hai mươi năm
Mẫu sinh học khi khô luôn luôn tổn tại ranh giới pha lỏng và pha khí Nếu nhiệt độ tại ranh giới này tăng lên thì lực căng mặt ngoài của pha lỏng tại đó giảm đi Khi lực căng mặt ngoài giảm
hơn nữa thì mặt chất lỏng trở nên không ổn định và cuối cùng bị
biến mất Đây chính là điểm tới hạn của chất lỏng trong mô Khi đó mặt ranh giới có thể đi qua được từ pha lỏng tới pha khí mà
không có sự thay đổi trạng thái đột ngột Sự đạt được điểm tới hạn
cla carbon dioxide léng (LCO,) (lA chất lỏng chuyển tiếp thường
dùng) bằng cách làm nóng thể tích chất khí tới khi nhiệt độ tới hạn
đạt được (31,1°C) Trong quá trình làm nóng, áp suất của LCO, tăng lên cho đến khi áp suất tới hạn đạt được (72,8 kg/cm?)
Đa số những mô sinh học mềm được làm khô bằng phương
pháp này vì nhanh và đáng tin cậy, không kèm theo những ảnh
giả Theo qui trình này, mẫu được khử nước trong ethanol có nồng độ tăng dần và truyền vào buồng áp suất lạnh (buồng chứa khí
nén) Sau khi đóng kín buồng, chất khử nước (thường là ethanol)
được thay thế bằng chất lỏng chuyển tiếp (như earbon đioxide hoặc Freon nén) Tiếp theo, những thay đổi của chất lỏng chuyển tiếp để đảm bảo thay thế hoàn toàn chất khử nước, buồng được bịt lại
hoàn toàn và nhiệt độ của chất lỏng chuyển tiếp được tăng lên dân
140
Trang 31dan nhờ điều chỉnh nhiệt độ của buồng áp suất bằng bể nước hoặc yếu tố nhiệt khác
Ap suất phía trong buồng bất đầu Lãng tương ứng với nhiệt độ Cuối cùng chất lông chuyển tiếp sẽ đạt tới điểm tới hạn (là
điểm kết hợp giữa nhiệt độ và áp suất riêng phần đặc hiệu của
chất lỏng truyền) mà tại điểm đó khối lượng riêng của pha long
bằng khối lượng riêng của pha khí và sự truyền xây ra
Một số chất khử nước, chất lỏng chuyển tiếp làm khô mẫu tại điểm tới hạn được đưa ra ở bảng 5.2
Bảng 5.2
Các chất khử nước, chất lỏng chuyển tiếp làm khô mẫu tại điểm tới hạn
Chất khử nước Chat long | Nhiệt độ tới hạn® € | Áp suất tới hạn PSI chuyển tiếp ÍEthanol, Amyl acetate |Chất lỏng CO, 31,1 1,073 Acetone Freon116 19,7 432 Ethanol Freon 23 25,9 701 Ethanol/Freon Freon 13 28,9 561
Các nhà nghiên cứu có thể lựa chọn một số những chất lỏng
chuyển tiếp dựa trên điểm tới hạn Carbon dioxide lỏng thường
hay được dùng hơn so với freon lỏng các loại
Nước (HO) không thích hợp để dùng như một chất lỏng
chuyển tiếp vì nó có nhiệt độ tới hạn là 374°C và áp suất tới hạn là 3,184psi (mẫu sinh học sẽ bị phá huỷ ở những điều kiện này)
Kỹ thuật làm khô tại điểm tới hạn là một kỹ thuật hoàn
chỉnh và tốt vì tại điểm tới hạn, mẫu bị ngâm hoàn toàn trong pha
khí đặc, tránh được sự nguy hiểm của mặt phân cách giữa pha
lỏng và pha khí Sau khi đạt tới điểm tới hạn, nhiệt độ được giữ tại nhiệt độ tới hạn (để ngăn sự tích tụ của khí quay trở lại thành chất
lồng) và khí bị thoát đần dần cho tới khi buồng đạt tới áp suất khí
quyển Khi ấy mẫu khô có thể được đặt lên giá mẫu phủ kim loại
để dẫn điện và quan sát trong SEM
Trang 32Tuy nhiên kỹ thuật làm khô tại điểm tới hạn nhiều khi
cũng không thích hợp với một số mẫu Một số mô có thể bị co
rúm lại như mô thần kinh (từ 10% đến 15% thể tích), mô phổi
(tới 60% thể tích) Ngoài ra những chất lỏng truyền còn là
những dung môi có thể làm thoát ra các chất như steroid carotenoid, porphyrin và actin
Sơ đồ của máy làm khô tại điểm tới hạn được trình bày trên hình 5.2
Đâu đo Van - Đấuớo
bình ẤP*uất lối vào áp suất le | da Cửa số Văn xả Điều chỉnh nhiệt đội Ệ Ea đà, JÌ——- = Đo nhiệt độ Hình 5.2
Sơ đồ của máy làm khô tại điểm tới hạn
Hình 5.3 là ảnh một máy làm khô tại điểm tới hạn của hang JEOL
142
Trang 33
Hình 5.3
Máy làm khô tại điểm tới hạn
Những điều chú ý khi làm khô tại điểm tới hạn
Vì có áp suất cao trong buồng nên có một số trường hợp nắp
buồng bị vỡ Những thiết bị hiện đại có những đĩa bảo vệ, chúng sẽ
bị vỡ trước khi áp suất ở trong buồng tăng Cửa đậy buông bằng
thuỷ tỉnh hoặc thạch anh đặc biệt cần được kiểm tra trước khi
dung May làm khô tại điểm tới hạn nên đặt trong tủ hốt hoá hoặc
nằm phía sau cửa sổ bảo hiểm Cần để phòng, tránh nhìn trực tiếp
vào buồng có áp suất cao Phòng cần thoáng gió vì các chất khí thoát ra có thể làm người làm mẫu ngạt thở hoặc chóng mặt
5.2.4.2 Làm khô mẫu bằng đông khô
Phương pháp thứ hai để tránh mặt ranh giới giữa pha lỏng và pha khí trong quá trình làm khô mẫu là làm đông mẫu nhanh khi
còn có nước Mẫu đã làm đông lạnh được truyền vào một buồng đặc
biệt có nhiệt độ thấp hơn -80°C và hút nhanh khí trong buồng
xuống còn áp suất 10Pa hoặc thấp hơn Trong khi lạnh, nước hoá bang sé bi thang hoa dan dan thành pha khí và bị hấp thụ bởi chất
chống ẩm nằm trong buồng hoặc bị hút ra bằng hệ thống chân
không Tuỳ thuộc vào kích thước của mẫu, nhiệt độ sử dụng và độ chân không đạt được mà quá trình này có thể diễn ra trong một vài giờ đến một vài ngày mới hoàn thành Mặc dù có thể làm lạnh
Trang 34các mô chưa cố định và sau đó làm đông khô, nhưng quá trình đông khô bắt đầu ngay sau khi những mô này được cố định và rửa
kỹ để loại những chất cố định còn bám lại Đôi khi mẫu được ngâm vào những chất bảo vệ lanh nhu sucrose, glucose, glycerol, ethanol,
DMSO hoặc dextran để làm giảm sự tạo thành tỉnh thể băng làm
tổn hại tới cấu trúc Tuy nhiên một số chất này lại không bị thăng
hoa và sẽ lưu lại về sau che khuất mặt mẫu Ethanol có thể là chất
bảo vệ lạnh thường dùng nhất vì nó bị hút đi qua máy bơm chân
không Cần tiến hành thí nghiệm để xác định có cần hay không chất bảo vệ lạnh khi có ý định làm đông khô mẫu lần đầu tiên
Qui trình đông khô
Theo qui trình chuẩn, sau khi mô tươi đã được cố định hoặc
được khử nước bằng axeton thì có thể ngâm trong chất chống lạnh rồi được nhúng vào trong chất bị làm lạnh bằng nitơ lỏng như
isopentane, freon lỏng hoặc propane lỏng (gọi là chất làm lạnh
trung gian) Những chất làm lạnh trung gian này thường được
dùng trước khi nhúng mô trực tiếp vào nitơ lỏng Nếu không có các
chất làm lạnh trung gian này thì pha khí tạo ra do nitơ lông sôi
làm cách nhiệt mẫu và làm chậm tốc độ làm lạnh mẫu gây nên sự kết tỉnh nước trong mẫu
Chú ý:
Tốc độ làm lạnh cao là rất quan trọng để tránh sự tạo thành những tỉnh thể nước Khi tốc độ làm lạnh cao hơn 140°K/giây, nước bị biến đổi hoá rấn ở đạng vô định hình
Chất làm lạnh trung gian làm ướt các mặt mẫu nên nhiệt
thoát ra khỏi mẫu rất nhanh và có tác dụng làm lạnh nhanh mẫu
Tuy nhiên tốc độ làm lạnh chỉ lớn tới độ sâu khoảng 10-15im con
những mô nằm đưới đó sẽ bị phá huỷ do có các tỉnh thể băng lớn
hình thành từ trong lòng tế bào
Sau khi mẫu đã được làm lạnh bằng chất làm lạnh trung gian,
chúng có thể lưu giữ lâu dài trong nitơ lỏng hoặc có thể chuyển vào
giá lạnh của máy đông khô để thực hiện tiếp qui trình Giá này có
thể làm lạnh trước bằng nitơ lỏng hoặc làm lạnh bằng điện nhiệt
144
Trang 35"Trên hình 5.4 là một máy đông khô điển hình thường được sử
đăng trong việc tao mau cho SEM
Hinh 5.4
May dong khé JFD-310 (JEOL)
Sau khi các mẫu được chuyển nhanh vào trong giá đã làm
lạnh (để tránh sự kết tụ của hơi nước) máy được đậy lại và hút
chan không tới khoảng 10 Pa và giữ dưới điều kiện chân không và
lạnh càng lâu càng tốt để làm khô mẫu Sau khi làm khô, giá mẫu
được làm ấm đần tới nhiệt độ phòng, không khí khô được đưa vào
trong buồng và mẫu có thể đặt lên giá để phủ và quan sát trong
S5M Nếu mẫu khô cần được giữ trong một khoảng thời gian trước khi phủ và quan sát thì cần giữ trong thiết bị chống ẩm
Chú ý:
Có thể tạo ra máy đông khô đơn giản bằng cách làm lạnh một
khối đồng lớn có lỗ ở giữa trong nitơ lỏng Đặt mẫu đã làm lạnh bằng chất làm lạnh trung gian vào trong lỗ của khối đồng; Đậy lỗ này bằng một khối lạnh khác và đặt cả hệ thống đã làm lạnh này
vio trong may bốc bay chân không Hệ thống này sẽ giữ lạnh trong
ckan không trong một thời gian đủ để những mẫu nhỏ đông khô 145
Trang 36Việc đậy mẫu là quan trọng với thiết bị này để ngăn cần sự tích tụ
nước hoặc không cho dầu bơm chân không bám trên mặt mẫu
Một ưu điểm của đông khô là mẫu bị nhãn nhúm rất ít so với
làm khô tại điểm tới hạn Nhược điểm của phương pháp liên quan
tới việc làm đông nhanh, chuyển vào trong máy, thời gian để làm
khô mô qua dài
Déng khé bang t-butyl alcohol
Nhu trên đã nói, khi một miếng mô bị làm đông lạnh và đặt
trong chân không thì băng (nước) ở dạng vô định hình có thể bị
thăng hoa ra khỏi ranh giới giữa pha rắn và pha khí Kỹ thuật này
có thể được sử dụng như là một phương pháp để làm khô các mẫu trước khi quan sát bằng SEM
Có ba hiệu ứng trong đông khô có thể làm triệt phá hình thái và siêu cấu trúc các mẫu như sau:
(a) Các tình thể băng lớn lên trong quá trình làm đông mẫu ban đầu
(b) Hiệu ứng sức căng mặt ngoài khi ranh giới chuyển qua mẫu
(e) Sự kết tinh của nước (băng) ở trong mẫu khi quá trình làm khô
diễn ra tại nhiệt độ đã cho
Tuy nhiên, nếu ta sử dụng t-butyl aleohol như là môi trường
làm đông khô thì điểm nóng chảy của né 1a 25,5°C Sau khi khử nước, môi trường khử nước trong mẫu bị thay thế bằng t-butyl
alcohol Mau bj lam lanh trong tu lanh va sau đó bị đông khô trong
buồng chân không
Qui trình của phương pháp đông khô với t-buty] aleohol như sau:
Khử nước + nam mau trong t-butyl cohol —>
Bay hơi t-butyl alcohol
Trang 375.2.4.3 Một số phương pháp làm khô mẫu đơn giản
Lam kho trong khong khi
Dưới những điều kiện xác định có thể làm khô mẫu sinh học trong không khí khi được làm khô trong không khí các mẫu nằm
trong nước, aceton, hoặc các loại aleohol thường bị nhắn nhúm,
rách và các siêu cấu trúc thường bị phá võ Tuy nhiên một số dung
môi như ethanol và hexamethyldisilazane có thể được sử dụng để
làm khõ trong không khí một số mô nhất định như vi khuẩn
Những mẫu vi khuẩn nằm Lrên giấy lọc có thể chuẩn bị bằng cách
cố dịnh trong glutaraldehyde tiếp theo trong OsO, Sau khi rửa
nhanh trong nước cất và khử nước liên tiếp trong ethanol (35, 45,
5ã 65, 70, 85, 95 và 100% trong 5 phút mỗi lần) người ta ngâm
mẫu trong hexamethyldisilazane trong 5 phút Tiếp đó những
miếng lọc được làm khô tại nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi
đặt lên giá đỡ của SEM để phủ với Pd/Au và kiểm tra trong SEM
Thực nghiệm chứng tỏ rằng qui trình này có thể dùng rất tốt cho
những tế bào, những vi khuẩn
Làm bhô bằng ƒfluoroearbon
Theo phương pháp này, những mẫu được cố định trong
glutaraldehyde tiếp theo bằng OsO,, rửa trong nước cất và khử
nước liên tiếp trong axeton Fluoroearbon là một chất rắn tại nhiệt
độ phòng, được làm nóng lên tới 40°C và trộn với một thể tích axeton tương đương Sau khi đậy lọ và trộn nhẹ, mẫu được đặt tại
nhiệt độ phòng để bắt đầu sự trao đổi của axeton với fluorocarbon trong mâu Sau khoảng 1 giờ, hỗn hợp của axeton/fluorocarbon bị loại và thay vào bang chat long fluorocarbon tinh khiét Lo dude
đậy, đặt tại nhiệt độ phòng để chất lỏng fluoroearbon cùng mẫu
cứng lại Tiếp đó mở lọ đựng fluoroearbon rắn cùng mẫu và đặt vào
trong thiết bị làm khô trong chân không hoặc chuông thuỷ tỉnh và
hút chân không bằng bom co hoc cho dén khi tat ca fluorocarbon
thăng hoa kết (thường trong một vài ngày) Những mẫu đã khô
này có thể được xử lý như những mẫu khô thông thường Ưu điểm
Trang 38của kỹ thuật này là không cần những thiết bị đông khô hoặc máy
làm khô tại điểm tới hạn đắt tiền
5.2.5 Dat mau trên giá đỡ
Sau khi mẫu đã được cố định khử nước và làm khô với một qui
trình thích hợp, người ta có thể gắn mẫu lên giá đỡ bằng kim loại
(thường làm bằng nhôm) và sau đó phủ với kim loại trước khi đưa
vào trong SEM Hầu hết các mẫu sinh học cần được phủ với các
kim loại dẫn điện hoặc cácbon để ngăn ngừa sự tích điện làm hạ
thấp chất lượng ảnh của SEM
Mặc dầu mẫu thường được gắn trực tiếp lên giá đỡ bằng các chất dính, nhưng một số mẫu trước tiên được gắn lên các đế
khác nhau như lam kính hiển vi, kính đậy, lá mica, giấy lọc, lá
kim loại nhôm, thép không rỉ mài nhẫn v.v và sau đó mới gắn lên giá đö
Vì có nhiều cách đặt mẫu nên cần phải lựa chọn cách thích hợp đối với mỗi loại SEM
Do các loại aleohol hoặc các dung môi có trong keo dán nên
cần phải để khơ hồn tồn trước khi phủ kim loại để quan sát
Bước quan trọng đầu tiên để chọn loại giá đỡ và keo dán là xác
định loại tín hiệu cần ghi Theo cách quan sát thông thường khi
đùng đầu dò điện tử thứ cấp thì người ta sử dụng những giá đỡ có
dang tru bằng nhôm Ngược lại, khi dùng tia X hoặc các điện tử tần xạ ngược để nghiên cứu thì các giá đỡ cácbon, chất gắn cácbon
và các lớp phủ cácbon được dùng là phù hợp Mặt của giá đỡ hoặc đế cần càng nhăn càng tốt để đễ quan sát Giá đỡ cần được lau
sạch bằng dung môi hữu cơ để loại bỏ dầu mỡ lẫn vào Hình 5.5 là
một số những giá đỡ mẫu sinh học phù hợp cho việc lắp đặt trong
SEM Loại chuẩn là a và b, còn những loại khác là loại cải biên để giữ hoặc để gắn các loại mẫu khác nhau
148
Trang 39L “Ly <® co `” C2 Hình 5.5 Hình ảnh một sổ giả đỡ mẫu sinh hoc ding trong SEM Lựa chọn chất dán mẫu
“Trong thực tế có rất ít những chất keo dán trên thị trường là phù
hợp cho SEM, vì chúng thiếu một số tiêu chuẩn quan trọng Những loại kee gắn thích hợp là phải thoả mãn những yêu cầu sau:
- Không làm tổn hạo mẫu;
- Không làm bẩn kính hiển vi;
- Cung cấp cho độ gắn kết tốt và đễ dàng sử dụng;
- Bền với chùm tia điện tử, nhiệt, và chân không;
- Tạo được độ nhẫn không lẫn với nền,
Đối với những mẫu lớn hơn có thể sử dụng keo và băng dính
cũng tốt Polyvinyl chloride, alpha-eyanerylate và cellulose nitrate
kết hợp với một lượng tương đương của sơn dẫn điện chứa bạc hoặc
cácbon được sử dụng rất tốt Cần chú ý không dùng quá nhiều chất
kết tỉnh vì nó sẽ kéo đài thời gian hút chân không và có thể ngấm
149
Trang 40vào mẫu và làm hỏng mẫu Các băng đính đặc biệt là băng đính hai
mặt cũng được sử dụng để gắn mẫu vào đế Tuy nhiên, các băng
đính này không tốt như các loại keo vì chúng có khuynh hướng thải khí và sẽ bị gây đưới tác dụng của chùm tia điện tử mạnh
Đa số các mẫu sinh học đã làm khô là rất đòn và dễ bị hỏng
trừ khi thao tác cẩn thận Trong số những dụng cụ có thể dùng để
câu và đặt mẫu lên đế hoặc giá đỡ thì kẹp có đầu nhọn, kim phẫu
tích, mieropipet v.v là rất thích hợp
5.2.6 Tạo màng dẫn điện cho mẫu
Việc quan sắt các mẫu không dẫn điện luôn luôn tạo ra những
khó khăn cho người nghiên cứu bằng SEM và họ không thể chụp
được ảnh chỉ tiết theo yêu cầu do mẫu bị tích điện
Để khắc phục vấn đề này, người ta thường phủ lên mẫu
một màng mỏng vật liệu dẫn điện như vàng hoặc platin Kỹ
thuật phủ mẫu bằng màng mỏng đã được trình bày trong phần
trước (bay hơi kim koại tạo màng bằng chùm tia điện tử, bằng
phún xạ và bằng nhiệt điện trở); Theo đó kỹ thuật nhằm tạo ra một màng dẫn điện bao phủ hoàn toàn mặt mẫu cả những mặt
thô Lớp phủ kim loại có khả năng loại bỏ sự tích điện trên mặt
mẫu bằng cách dẫn điện tích xuống đất Ngoài ra các lớp phủ
kim loại như vậy cũng giúp làm tan nhiệt cho mẫu
5.2.6.1 Phương pháp tạo màng bằng máy phún xạ
Phương pháp thông thường nhất để phủ màng mỏng kim loại lên các mẫu sinh họe trong SEM là phương pháp phún xạ plasma hoặc với thuật ngữ thường dùng là phương pháp tạo màng phún
xạ Máy thường dùng nhất là máy phún xạ dòng trực tiếp như
trên hình 5.6
150