Thuc hanh chan doan benh shpt

coli DH5α và sàng lọcVi khuẩn E.coli DH5α Khả nạp Vi khuẩn mang vector pGEM-T Easy Chọn khuẩn lạc màu xanh Tách chiết plasmid Tinh sạch Đoạn DNA mục tiêu cần chèn Tinh sạch Phản ứng nối

TÀI LIỆU MÔN HỌC

THỰC TẬP CHẨN ĐOÁN BỆNH THÚ Y BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

Lịch học: 17/7, 7g sáng TV102.

TRƯỜNG ĐH NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH

HỌC

TRƯỜNG ĐH NÔNG LÂM TPHCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

TÀI LIỆU MÔN HỌC CHẨN ĐOÁN BỆNH THÚ Y (Chẩn đoán phòng thí nghiệm: PCR)

I NỘI QUI PHÒNG THÍ NGHIỆM

- Mặt áo blouse và đeo bảng tên trong suốt thời gian thực tập

- Đọc kỹ tài liệu và nắm vững nguyên tắc, vật liệu, phương pháp thực hành bài thực tập trước khi vào phòng thí nghiệm

- Chỉ mang những dụng cụ tối thiểu cần cho thực tập

- Trước khi thực tập cần lau sạch mặt bàn thực tập bằng giấy lau tẩm cồn 70%

- Đối với các hoá chất sử dụng trong thực tập, cần xem rõ tên hoá chất trước khi sử dụng Không tự ý làm thử để tìm hiểu

- Sinh viên phải mang bao tay và thao tác cực kì cẩn thận khi hút các hoá chất độc như phenol, chloroform, ethidium bromide,…

- Lắng nghe và thực hiện nghiêm túc các hướng dẫn của cán bộ phụ trách hướng dẫn thực tập

- Sau mỗi buổi thực hành cần vệ sinh sạch sẽ trước khi ra khỏi phòng thí nghiệm

Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E coli DH5α và sàng lọc

Vi khuẩn E.coli DH5α

Khả nạp

Vi khuẩn mang vector pGEM-T Easy

Chọn khuẩn lạc màu xanh

Tách chiết plasmid

Tinh sạch

Đoạn DNA mục tiêu

cần chèn

Tinh sạch

Phản ứng nối (ligase)

Biến nạp vào tế bào khả nạp Chọn khuẩn lạc màu trắng

Tách chiết và tinh sạch plasmid

Cắt plasmid bằng enzyme

cắt giới hạn Phản ứng PCR với primerSP6, T7

II NỘI DUNG CHÍNH THỰC TẬP THÍ NGHIỆM

Bài 1 Tìm trình tự gen mục tiêu và thiết kế primer

1 Tìm gen mục tiêu từ bài báo khoa học và NCBI

- Dùng từ khóa: Complete genome/gene of porcine reproductive and respiratory disease virus; porcine circovirus 2

- Vào bài báo và tìm Genebank access number

- Tìm trong NCBI theo access number đã có

2 Thiết kế primer theo các yêu cầu

- Thiết kế primer để clone vào pGEM-T

- Thiết kế primer để clone vào pGEM-3, pHyg, pcDNA3.1(+) với các enzyme được chọn

Bài tập:

Thiết kế primers để clone các gen khác nhau của PEDV vào pGEM-3

Chuyển các gene này từ pGEM-3 vào pHygro hoặc pcDNA3.1(+) để biểu hiệm được bằng vùng khởi động CMV

Bài 2 Thực hành cloning, bắt vi khuẩn, cấy và ly trích DNA

1 Cloning

1 Vector

2 Insert

3 Ligase buffer

4 Ligase

5 Competent cells

6 Đá

7 Bể ủ 42oC

8 LB broth

2 Bắt vi khuẩn

1 LB broth

2 Ampicillin

3 Ly trích DNA

1 Kit

3 Cắt kiểm tra

1 Buffer 1, 2, 3, 4

2 Các loại enzyme (EcoRI, EcoRV, NotI, BamHI, SpeI, SphI, KpnI, SacI, SacII, DraIII, Bstz17I, BsiWI, PstI, AatII )

Bài 3 Thực hành chuẩn bị PCR, load gel, đọc kết quả PCR

1 PCR

1 Taq buffer

2 dNTP (10mM)

3 Primer F

4 Primer R

5 DNA mẫu

6 Taq

7 Nước

2 Load gel

1 Nước cất

2 Agarose

3 Bromophenol blue

4 Sucrose

Bài 4 Đọc kết quả đọc trình tự gen và tập hợp kết quả thành gen hoàn chỉnh

Trong phần thực hành này, sử dụng plasmid pGEM-T Easy (Promega) Plasmid này được thiết kế đặc biệt để tạo dòng những sản phẩm PCR được khuếch đại với men Taq-polymerase Taq polymerase có đặc tính gắn thêm một

deoxyadenosine ở mỗi đầu 3’ của DNA được khuếch đại Men ligase sẽ gắn T của plasmid với A của DNA

Vector pGEM-T Easy có một số đặc điểm sau (Hình 1):

- một base thymine ở hai đầu 3’ tự do

- gen bla, gen chống kháng sinh ampicillin;

- một vùng polylinker (gồm nhiều trình tự giới hạn) nằm giữa trình tự mã hóa cho –peptide của men –galactosidase Trình tự này có khả năng bổ

sung với đoan còn lại của gen lac-Z nằm trong genome của chủng E.Coli thích hợp

Gắn DNA vào pGEM-T Easy

Tỷ lệ mole của DNA mục tiêu và plasmid phải nằm trong khoảng 1-3

Kích thước của pGEM-T-Easy = 300 bp

Kích thước của DNA mục tiêu = X bp

Nếu tỷ lệ DNA plasmid/DNA mục tiêu = 1, nếu ta lấy 50 ng plasmid, ta sẽ phải lấy: (X*50)/3000 ng DNA mục tiêu để thực hiện phản ứng gắn kết

Thành phần phản ứng ligase DNA đích vào pGEM-T-Easy

+ 1 ul pGEM-T-Easy (50ng)

+ DNA mục tiêu

+ 5 uL dung dịch đệm ligase

+ 1 uL T4-DNA ligase (3U)

+ nước siêu sạch (nuclease free water) cho đủ 10 uL

Ủ phản ứng 1 – 2 giờ ở nhiệt độ phòng

Giới thiệu về pGEM-T Easy Vector (Promega)

Hình 1 Sơ đồ cấu trúc vector pGEM®-T Easy

T7 RNA polymerase transcription initiation site 1

- multiple cloning region 10–128

- SP6 RNA polymerase promoter (–17 to +3) 139–158

- SP6 RNA polymerase transcription initiation site 141

- pUC/M13 Reverse Sequencing Primer binding site 176–197

- lacZ start codon 180

- lac operator 200–216

- β-lactamase coding region 1337–2197

- phage f1 region 2380–2835

- lac operon sequences 2836–2996, 166–395

- pUC/M13 Forward Sequencing Primer binding site 2949–2972

- T7 RNA polymerase promoter (–17 to +3) 2999–3

BÀI 2 CHUẨN BỊ TẾ BÀO KHẢ NẠP E coli DH5α BẰNG PHƯƠNG PHÁP

CALCIUM CHLORIDE (5 tiết)

Mục đích: Tạo ra tế bào có khả năng dung nạp DNA ngoại lai bằng cách xử lý tế bào vi khuẩn trong dung dịch muối lạnh của kim loại hoá trị II như CaCl2, MgCl2,… Ion Ca2+ có thể gây ra những xáo trộn trên màng tế bào làm cho những phân tử DNA xâm nhập vào tế bào dễ dàng hơn

Dụng cụ - hoá chất:

- Dung dịch tế bào E coli DH5α nuôi cấy sau 4 giờ

- Dung dịch CaCl2 100 mM giữ -20oC

- Dung dịch CaCl2 85%, glycerol lạnh 15 %

- Nước cất khử ion

- Eppendorf 1,5 ml, 0,2 ml

- Máy ly tâm lạnh

- Micropipette và đầu tip các loại

Phương pháp tiến hành:

Bước 1: Hút 100 µl dịch vi khuẩn vào bình tam giác chứa 50 ml môi trường LB lỏng

Bước 2: Nuôi cấy lắc trong vòng 3 - 4 giờ ở 37oC

Bước 3: Chuyển bình tam giác chứa vi khuẩn vào thùng đá giữ lạnh trong 30 phút Bước 4: Hút 1,5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút

trong 10 phút ở 4oC

Bước 5: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dưới Lập lại từ

bước 4 thêm 2 lần

Bước 6: Cho 1 ml CaCl2 100 mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu

được Dùng pipette trộn nhẹ để hòa tan phần sinh khối trên

Bước 7: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC

Bước 8: Đổ bỏ phần dịch bên trên

Bước 9: Cho 50 µl hỗn hợp CaCl2 100 mM và glycerol lạnh (85%V CaCl2, 15%V glycerol) vào, huyền phù phần sinh khối trên và trữ ở -70oC

ý là phải chia nhỏ thể tích khả nạp đủ cho mỗi lần sử dụng.

BÀI 3 BIẾN NẠP PLASMID pGEM-T-Easy đã chèn đoạn DNA đích

VÀO TẾ BÀO KHẢ NẠP CỦA E coli DH5α (5 tiết)

Mục đích: Nhằm khuếch đại số lượng các bản sao của DNA plasmid đã chèn đoạn DNA đích nhờ vào bộ máy di truyền của tế bào vi sinh vật; đưa gen mục tiêu vào

tế bào chủ nhằm nghiên cứu sự biểu hiện chức năng của nó; sản xuất protein tái

tổ hợp…

Dụng cụ - hoá chất:

- Tế bào khả nạp E coli DH5 –

Alpha

- PGEM-T-Easy đã chèn DNA

trong thí nghiệm trước

- Bồn ủ nhiệt 42oC

- Môi trường LB lỏng

- Đá lạnh dùng để sốc nhiệt

- Ampicillin nồng độ 50 ug/ml

- Tủ lắc ổn nhiệt ở 37oC

- Pipette và đầu tip các loại Phương pháp tiến hành:

- Dịch huyền phù tế bào khả nạp đã được chuẩn bị từ bài 1, được trữ trong tủ - 70

oC Chúng ta hút 1 µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 30 phút

- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây

- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nước đá, giữ trong 2 phút

- Hút 20 µl dịch huyền phù trên cho vào 1ml môi trường LB lỏng chứa trong eppendorf 1,5 ml và ủ ở 370C từ 1 – 2 giờ

- Hút 1,5 µl ampicillin 50 µg/ml cho vào eppendorf trên và tiếp tục ủ ở 37oC trong

24 giờ

Chú ý: Mỗi sinh viên làm hai mẫu, một mẫu đối chứng và một mẫu thí nghiệm Mẫu đối chứng không

bỏ plasmid vào, còn các bước làm tương tự như mẫu thí nghiệm.

BÀI 4: CHỌN LỌC TẾ BÀO ĐÃ ĐƯỢC BIẾN NẠP (5 tiết)

Mục đích: Nhằm chọn đúng thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp chứa gen mục tiêu trong rất nhiều thể biến nạp thu được

Dụng cụ - hoá chất:

- Môi trường LB + Ampicillin

agar

- Dung dịch IPTG

- Dung dịch X-gal

- Tủ ủ 37oC

- Que cấy trang

- Đèn cồn

- Tủ cấy vô trùng

- Bịch nilon loại 0,5 kg

- Pipette và đầu tipe các loại

Phương pháp tiến hành:

Trong phần thực hành này, chúng ta sẽ chọn lọc thể biến nạp mang gen mục tiêu dựa trên khả năng kháng kháng sinh (ampicillin) và sàng lọc xanh – trắng dựa trên sự biểu hiện của β-galactosidase Sử dụng kết quả biến nạp ở bài 2, chúng ta thực hiện các bước sau:

- Pha loãng 100 lần dung dịch tế bào biến nạp ở bài 2

- Chuẩn bị môi trường LB + Amp + IPTG + X-gal

- Dùng que trang cấy phần dịch pha loãng lên đĩa môi trường LB + Amp + IPTG + X-gal, ủ ở 37oC trong 24 giờ

Thành phần hóa chất:

1 LB (Luria Bertani broth)

+ Bactotryptone 10 g/L

+ Yeast Extract 5 g/L

Bổ sung nước cất cho đủ 1 L, điều chỉnh pH=7

2 LB agar

+ môi trường lỏng LB cho đủ 1L

3 Ampicillin:

+ 100 mg/L ampicillin được chuẩn bị sử dụng nước siêu sạch, bảo quản ở -20

oC

4 X-gal

+ 40 mg/mL dimethyl formamide, bảo quản -20oC

5 IPTG

+ 200 mM (mg/mL nước siêu sạch) bảo quản -20oC

6 LB agar + ampicillin + X-gal + IPTG

LB agar sau khi hấp khử trùng, để nguội khoảng 50oC, thêm 1 μL/mL

ampicillin + 1 μL X-gal + 1μL IPTG

Hình 2 Khuẩn lạc của E coli Dh5α sau khi biến nạp plasmid đã chèn

gen đích

 Sàng lọc và chọn những khuẩn lạc màu trắng; đây là những khuẩn lạc đã

chèn được gen đích.

BÀI 5: LY TRÍCH PLASMID TỪ TẾ BÀO E coli Dh5α ĐÃ ĐƯỢC BIẾN NẠP

(5 tiết)

Mục đích: Nhằm thu được plasmid với số lượng lớn ở dạng tinh thông qua bộ máy

di truyền của tế bào chủ DH5 – Alpha Plasmid được sao chép với một số lượng lớn

và với một tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trưởng của tế bào chủ Dụng cụ - hoá chất:

- Dung dịch I

- Dung dịch II

- Dung dịch III

- TE 1X

- Rnase

- Isopropanol

- Ethanol 70%

- Chloroform:isoamyl alcolhol(24:1)

- Nước cất khử ion

- Máy ly tâm lạnh

- Eppendorf 1.5 ml

- Bồn ủ nhiệt 37oC

- Pipette và đầu tip các loại

Phương pháp tiến hành:

Bắt những khuẩn lạc màu trắng từ đĩa petri cấy sang môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid theo quy trình sau:

Bước 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1,5 ml; tiến hành ly

tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C

Bước 2: Hút bỏ dịch bên trên, lặp lại bước 1 ba lần

Bước 3: Rữa sinh khối bằng 500 μL nước cất vô trùng, ly tâm 10000 vòng/ 5 phút /

4oC

Bước3: Cho 150 μL dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi

sinh khối vi khuẩn tan ra hết

Bước 4: Thêm 200 μL dung dịch II, đảo nhanh eppendorf 5 - 6 lần, sau đó thêm

tiếp 150 μL dung dịch III, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần

Bước 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200C Thu hết dịch nổi cho vào

eppendorf mới tương ứng

Bước 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu được 1 μL RNAse, ủ ở

370C trong 1 giờ

Bước 7: Cho vào mỗi eppendorf 300 μL phenol/chloroform/isoamylalcohol

(25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng

Bước 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly

tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng

Bước 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, và ủ ở -200C trong 1 giờ,

ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200C Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa

Bước 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500 μL ethanol 70% lạnh vào mỗi

eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngược trên giấy thấm

Bước 11: Cho TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa Tùy lượng mẫu mà thêm

vào

Bước 12: Hút 4 μL chạy điện di trên agarose nồng độ 1% trong 30 phút để xem

kết quả chiết tách

Sau khi điện di kiểm tra sản phẩm chiết tách trên gel agarose, thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid tách chiết và DNA plasmid đối chứng

Thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid và DNA plasmid đối chứng bằng

enzym EcoRV, sau đó kiểm chứng bằng cách điện di trên gel agarose sẽ cho biết

DNA plasmid chiết tách được có phải là plasmid mà mình mong muốn hay không

BÀI 5 CẮT PLASMID PBLUESCRIPT II SK(+) BẰNG MEN GIỚI HẠN

EcoRV (5 tiết)

Mục đích : Kiểm chứng dung dịch DNA plasmid thu được khi khuếch đại số lượng bản sao DNA plasmid bằng bộ máy di truyền của tế bào chủ thông qua phương pháp biến nạp Mặt khác, có thể kiểm tra vector tái tổ hợp thu được sau phản ứng nối

Nguyên tắc: ??

Dụng cụ - hoá chất:

- Enzyme EcoRV; Buffer B; Plasmid pBluescript II SK(+); Nước cất khử ion

- Bồn ủ nhiệt 37oC

- Pipette và đầu tipe các loại

Phương pháp tiến hành:

Một đơn vị enzym cắt giới hạn là lượng enzym xúc tác phản ứng cắt hết một lượng DNA là 1 µg trong buffer thích hợp trong thời gian là 1 giờ ở nhiệt độ thích

hợp Thực hiện phản ứng cắt plasmid pBluescript II SK(+) bằng men EcoRV với

các thành phần như sau:

Thêm nước cho tới 25 µL

Ủ phản ứng ở 37oC trong 1 giờ, biến tính enzym ở 65oC trong 15 phút Điện di 8 µL sản phẩm cắt trên gel agrose 1%, với hiệu điện thế 100 V, trong 30 phút để kiểm tra

BÀI 6: (5 tiết) Thi cuối môn học, vấn đáp hoặc thi viết

IV.ÐÁNH GIÁ KẾT QUẢ HỌC TẬP

1 Mỗi buổi thí nghiệm đều có 2 phần kiểm tra: lý thuyết, chuẩn bị bài và kỹ thuật thực hành, kết quả thí nghiệm

2 Kiểm tra cuối môn học: vấn đáp hay viết

3 Ðiểm tổng kết: Ðiểm trung bình các buổi thí nghiệm 70%