Nhóm 3 thực hành chẩn Đoán thực vật bằng shpt

KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN TRONG MẪU DNA LY TRÍCH BẰNG PRIMER TRÊN BÀI BÁO...13 6.1.. Mục tiêu nghiên cứu Xác định sự hiện diện của vi khuẩn Pantoea stewartii trong mẫu.. Khi các

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC THỰC HÀNH CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nhóm thực hiện: Nhóm 3 sáng thứ 6 Niên khóa: 2021 - 2025

TP Thủ Đức, 12/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC THỰC HÀNH CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT

1126337

Võ Thị Mộng Huỳnh 21126078Phạm Minh Thư 21126201

TP Thủ Đức, 12/2024

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

DÁNH SÁCH CÁC HÌNH iv

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung 1

Chương 2 TỔNG QUAN 2

2.1 Tổng quan về Pantoea stewartii 2

2.2 Vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh xơ đen trên mít 2

2.3 Điện di 3

2.4 Gel agarose 4

2.5 PCR 16s 4

Chương 3 LY TRÍCH DNA VI KHUẨN PANTOEA STEWARTII 5

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 5

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 5

3.2.1 Vật liệu 5

3.2.2 Mẫu 5

3.2.3 Hoá chất 5

3.2.4 Thiết bị và dụng cụ 5

3.3 Phương pháp thực hiện 5

Chương 4 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG DNA VÀ PHẢN ỨNG 16S RNA 7

4.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 7

4.2 Nội dung thực hiện 7

4.3 Vật liệu và phương pháp 7

4.3.1 Điện di DNA tổng số 7

4.3.2 Phản ứng 16s rRNA 7

4.4 Kết quả và thảo luận 9

4.4.1 Điện di tổng số 9

4.4.2 Phản ứng 16s rRNA 9

Chương 5 KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN TRONG MẪU DNA LY TRÍCH BẰNG PRIMER LAB THIẾT KẾ 10

5.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 10

5.2 Nội dung thực hiện 10

5.3 Vật liệu và phương pháp 10

5.3.1 Vật liệu 10

5.3.2 Hóa chất 10

5.3.3 Dụng cụ và thiết bị 11

5.4 Phương pháp thực hiện 11

5.4.1 PCR 11

5.4.2 Điện di 11

5.5 Kết quả và thảo luận 12

5.5.1 Kết quả 12

5.5.2 Thảo luận 12

Chương 6 KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN TRONG MẪU DNA LY TRÍCH BẰNG PRIMER TRÊN BÀI BÁO 13

6.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 13

6.3 Vật liệu và phương pháp 13

6.4 Kết quả và thảo luận 15

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Thành phần phản ứng PCR 8

Bảng 4.2 Chu trình phản ứng PCR 8

Bảng 5.1 Thành phần phản ứng PCR 10

Bảng 5.2 Thông số chu trình nhiệt 10

Bảng 5.3 Thành phần điện di 11

Bảng 6.1 Thành phần phản ứng PCR 13

Bảng 6.2 Chu trình phản ứng PCR 14

DÁNH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Mít bị bệnh sơ đen. 3

Hình 3.1 Dịch sau ly tâm 5

Hình 3.2 Dịch sau ly tâm 6

Hình 4.1 Kết quả điện di tổng số. 9

Hình 4.2 Kết quả của điện di sản phẩm PCR 16s. 9

Hình 5.1 Kết quả điện di tổng số DNA 12

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Mít là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, dễ trồng, dễ chăm sóc, khả năng thích nghitốt nên được trồng phổ biến ở khu vực Đông Nam Bộ và Đồng Bằng Sông Cửu Long

Nhưng hiện nay bệnh xơ đen ở mít do vi khuẩn Pantoea stewartii gây ra ngày càng trở nên

phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng ở các vùng trồng mít Bệnh xơ đen ở mít do vi khuẩn

Pantoea stewartii làm ảnh hưởng sinh trưởng, giảm năng suất và chất lượng trái mít, gây

khó khăn trong việc bảo quản, tiêu thụ, gây thiệt hại kinh tế cho người nông dân Hiện nay,các giải pháp phòng trừ bệnh xơ đen vẫn còn hạn chế và chưa mang lại hiệu quả cao nên cầnphải thực hiện việc chẩn đoán, nghiên cứu để đưa ra các biện pháp phòng trừ bệnh đạt hiệuquả cao hơn

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định sự hiện diện của vi khuẩn Pantoea stewartii trong mẫu.

1.3 Nội dung

Nội dung 1: Ly trích DNA vi khuẩn Pantoea stewartii.

Nội dung 2: Điện di DNA tổng số và phản ứng PCR 16S rRNA

Nội dung 3: Kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu DNA ly trích bằng primer từlab thiết kế

Nội dung 4: Kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu DNA ly trích bằng primer từbài báo

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về Pantoea stewartii

Pantoea stewartii subsp stewartii (Pantoea stewartii) là một loài vi khuẩn gây bệnh thực vật Pantoea stewartii là một vi khuẩn gram âm thuộc bộ Enterobacterales, không di

động, có sắc tố vàng hoặc trắng, nhầy, kỵ khí tùy ý, hình que ngắn, catalase dương tính, thủyphân gelatin và tinh bột nhưng không thủy phân tween 80, tạo ra axit từ glucose, sucrose vàlactose (Vo và ctv, 2023)

Pantoea stewartii gây ra bệnh héo Stewart ở ngô, cũng như bệnh xơ đen ở mít, bệnh

héo lá do vi khuẩn ở mía (Abidin và ctv, 2020).Vi khuẩn này là tác nhân gây bệnh duy nhất

được liệt kê trong danh sách tác nhân gây bệnh kiểm dịch trong chi Pantoea (Jeger M và ctv,

2018)

2.2 Vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh xơ đen trên mít

Mít (Artocarpus heterophyllus) là loài thực vật ăn quả, mọc phổ biến ở vùng Đông Nam Á và Brasil Mít thuộc chi Mít (Artocarpus), họ Dâu tằm (Moraceae), bộ Hoa hồng

(Rosales) có nguồn gốc từ Ấn Độ

Bệnh đen xơ mít được ghi nhận xuất hiện đầu tiên tại Nam và Trung Mỹ năm 2011, sau

đó lần lượt nhiều nước khác như Philippines, Mexico và Malaysia công bố sự xuất hiện và

gây hại của bệnh Bệnh đen xơ mít tại Việt Nam được xác định là do loài vi khuẩn Pantoea stewartii subsp stewartii gây ra (Vo, 2023)

Bệnh xơ đen trên mít không có triệu chứng ở hình thức bên ngoài của quả, nhưng nó cómàu vàng cam đến đỏ và các đốm gỉ sét trên phần thịt quả và xơ mít Về đợt bùng phát củacăn bệnh này ở Malaysia, triệu chứng dễ thấy khác là các đốm màu nâu đỏ rõ ràng trên phầnthịt quả (Abidin và ctv, 2020).Bệnh cũng có thể gây hiện tượng rụng trái ở giai đoạn cuối,

xuất hiện gây hại nặng ở các giống mít có độ ngọt cao (Ismail và Kaur, 2013; Gapasin và ctv,2014).

Hình 2.1 Mít bị bệnh sơ đen.

2.3 Điện di

Là sự dịch chuyển các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường Sự dịchchuyển này do phần lực điện trong lực Lorentz Điện di trên gel (gel electrophoresis) ápdụng trong sinh học phân tử DNA, RNA, Protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng nhưkích thước, hình dạng hay điểm đẳng tích (isoelectic point) Kĩ thuật này sử dụng một dungdịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điện trường đều Một bản gel đóng vai trò là thế nên đểphân tách các phân tử, và các chất chất nhuộm khác nhau (ethumdromide, xanh coomassie,bạc ) để phát hiện vị trí các phân tử gel sau khi diện di.Điện di là kỹ thuật được dùng đểphân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân tử đặc biệt là các protein và các nucleic acidtrên cơ sở kích thước khối lượng, diện tích và cấu hình của chúng

Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướngđến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo diện tích của chúng Ngược với protein, loạiphân tử có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, các nucleic acid có một điện tích âm khôngđổi nhờ khung phosphate của mình, và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương.Cácphân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn đờ (support matrix)như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel Trong đó gel củaagarose và polyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất Thông thường, gel là một khuônđúc dạng phiên mỏng có các giếng đẽ nạp (loading) mẫu Gel được ngâm trong dệm diện dicung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trịkhông đối tương đối

2.4 Gel agarose

Gel agarose có thể được sử dụng để phân tách các phân tử lớn hơn khoảng 100 bp Agarose là một dạng polymer có thể được đun hòa tan, đổ khuôn và tạo thành nhiều miếnggel với kích thước khác nhau (thường là minigel có chiều dài 10 cm) Các giếng (well) đượcđịnh hình bằng lược gel (comb) sau khi đổ gel vào khuôn Miếng gel được đặt ngập chìmtrong dung dịch điện di và DNA được thêm vào các giếng Dòng điện đi qua bồn điện di,theo chiều dài gel làm các phân tử DNA tích điện âm di chuyển về phía cực dương Agarosegel là một ma trận gồm các lỗ và các phân tử DNA có kích thước nhỏ sẽ di chuyển qua dễdàng hơn các phân tử DNA có kích thước lớn hơn Với yêu cầu độ phân giải cao hơn hayviệc tách chiết các phân tử DNA ngắn hơn nên sử dụng gel polyacrylamide

2.5 PCR 16s

Phương pháp 16S rRNA là một công cụ phân tích phân tử được sử dụng rộng rãitrong nghiên cứu vi sinh vật, để theo dõi mối quan hệ phát sinh loài giữa các vi khuẩn và xácđịnh vi khuẩn từ nhiều nguồn khác nhau, chẳng hạn như mẫu vật môi trường hoặc lâm sàng,

từ đó giúp chúng ta hiểu rõ hơn về thành phần và chức năng của các cộng đồng vi sinh vật(S Mignard và J.P Flandrois, 2006)

Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase khuếch đại gen 16S (PCR 16S) là một phươngpháp sinh học phân tử được sử dụng để phát hiện và xác định vi khuẩn Phương pháp nàydựa trên việc khuếch đại gen 16S, một gen mã hóa cho RNA ribosome 16S, có mặt trong tất

cả các vi khuẩn

Chương 3 LY TRÍCH DNA VI KHUẨN PANTOEA STEWARTII

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện từ ngày 6/12/2024 tại phòng RIBE 304, tòa nhà A1, Khoa khoahọc sinh học, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Bước 4: Thêm 300 μl CI, sau đó đảo đều Ly tâm 13,000 vòng trong 10 phút.

Bước 5: Hút 300 μl dịch nổi qua tube mới Thêm 100 μl Chloroform ( tỷ lệ 3:1) Đem

ly tâm 13,000 vòng trong 8 phút

Bước 6: Hút 200 μl dịch nổi qua tube mới Thêm 100 μl Isopropanol vào, đảo nhẹ chođồng nhất mẫu Đem ủ lạnh 60 phút, sau đó ly tâm 13,000 vòng trong 13 phút Đổ dịch nổi,thu tủa

Bước 7: Rửa tủa bằng 480 μl Ethanol 70% Ly tâm 13,000 vòng trong 10 phút Loại bỏdịch nổi, để khô tự nhiên

Bước 8: Hút lần lượt 50 μl TE buffer và 50 μl Elution buffer cho vào tube, bảo quản ở

-20oC

Hình 3.2 Dịch sau ly tâm

Chương 4 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG DNA VÀ PHẢN ỨNG 16S

RNA

4.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian: 8 giờ, ngày 13 tháng 12 năm 2024

Địa điểm: Ribe 304, phòng chuẩn đoán bệnh học – Khoa Khoa học Sinh học TrườngĐại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

4.2 Nội dung thực hiện

Điện di DNA tổng số kiểm tra sự hiện diện của DNA ly trích từ mẫu vi khuẩn và phảnứng 16S RNA

4.3 Vật liệu và phương pháp

4.3.1 Điện di DNA tổng số

Thiết bị và dụng cụ: Máy vortex, microwave, bồn điện di, micropipette

Hóa chất : DNA mẫu, agarose, gel red, loading die, dung dịch TBE 0,5x

Mục tiêu: nhằm tăng tối ưu cho phản ứng PCR

DNA sau khi thu từ ly trích sẽ tiến hành điện di tổng số để kiểm tra lượng DNA lytrích được và giúp tăng hiệu quả cao cho PCR 16S RNA Quy trình điện di được thực hiệnnhư sau:

Bước 1 Chuẩn bị gel agarose 1%: Cân 0.3 g agarose vào 30 ml dung dịch TBE 0,5x,lắc đều hỗn hợp dung dịch Đem cốc vào lò vi sóng để đun sôi, sau đó đổ vào khuôn Đưa gelvào bồn điện di

Bước 2 Chuẩn bi mẫu điện điện di: hút 0.5 l loading die, 1 l gel red vào giấy bạctrộn đều Sau đó hút thêm 3 l mẫu trộn đều và hút hỗn hợp vào giếng

Bước 3 Điện di: đậy nắp bồn điện di cẩn thận Điều chỉnh điện di ở hiệu điện thế 100

V trong 20 phút

4.3.2 Phản ứng 16s rRNA

Thiết bị và dụng cụ: Máy vortex,, micropipette, máy PCR

Hóa chất : loading die, gel red, DNA mẫu, H2O, buffer, agarose, dung dịch TBE 0,5xDNA mẫu dựa vào kết quả điện di tổng số, vì vạch mờ nên phải pha loãng mẫu 2 lần.Mục tiêu : kiểm tra trong mẫu có vi khuẩn không

Quy trình phản ứng PCR 16S được thực hiện như sau:

Kết thúc Hậu kéo dài 72 7 phút

Sau khi PCR xong tiến hành điện di sản phẩm PCR

Bước 1 Chuẩn bị gel agarose 1%: Cân 0.3 g agarose vào 30 ml dung dịch TBE 0,5x, lắc đều hỗn hợp dung dịch Đem cốc vào lò vi sóng để đun sôi, sau đó đổ vào khuôn Đưa gel vào bồn điện di

Bước 2 Chuẩn bị mẫu điện điện di: hút 1 µl gel red và 3 µl sản phẩm PCR vào giấy bạc trộn đều Hút hỗn hợp vào giếng

Bước 3 Chuẩn bị ladder và đố chứng âm: Trộn đều 1.5 µl ladder và 1 µl gel red, đưa hỗn hợp vào giếng Hút đối chứng âm và 1 µl gel red vào giếng tiếp theo

Bước 4 Điện di: đậy nắp bồn điện di cẩn thận Điều chỉnh điện di ở hiệu điện thế

100 V trong 20 phút

4.4 Kết quả và thảo luận

4.4.1 Điện di tổng số

Hình 4.1 Kết quả điện di tổng số.

Thảo luận : vạch xuất hiện mờ nên lượng DNA ít nên tiến hành pha loãng ít hơn

4.4.2 Phản ứng 16s rRNA

Hình 4.2 Kết quả của điện di sản phẩm PCR 16s.

Thảo luận : Kết quả của giếng nhóm xuất hiện vạch trắng điều đó chứng minh trong mẫu nhóm có xuất hiện vi khuẩn Để xác định vi khuẩn có xuất hiện có phải là

Pantoea stewartii cần tiến hành phản ứng cho các primer chuyên biệt cho vi khuẩn đó.

N3

Chương 5 KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN TRONG MẪU DNA LY TRÍCH BẰNG PRIMER LAB THIẾT KẾ

5.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian: 8 giờ ngày 20 tháng 12 năm 2024

Địa điểm: Tòa A1, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đạihọc Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

5.2 Nội dung thực hiện

Thực hiện quy trình chạy PCR phát hiện vi khuẩn Pantoea stewartii bằng cặp mồi

chuyên biệt do lab tự thiết kế

Bảng 5.2 Thông số chu trình nhiệt

Bước 1 Đồng nhất mẫu bằng Vortex

Bước 2 Tiến hành tạo hỗn hợp Master mix gồm: Taq polymerase, nước, primer

Bước 3 Hút 9 µL từ hỗn hợp cho vào tube

Bước 4 Cho 1 µL DNA mẫu vào

Bước 5 Tiến hành chạy PCR

5.5 Kết quả và thảo luận

5.5.1 Kết quả

Hình 5.1 Kết quả điện di tổng số DNA

Kết quả ở giếng của nhóm không xuất hiện band cho thấy mẫu N ly trích không có

DNA mục tiêu là vi khuẩn Pantoea stewartii.

5.5.2 Thảo luận

Kết quả ở giếng của nhóm không xuất hiện band cho thấy mẫu N ly trích không có

DNA mục tiêu là vi khuẩn Pantoea stewartii Ta có thể thực hiện điện di lại một lần nữa để

so sánh kết quả Hoặc chạy PCR trên cặp mồi đặt hiệu khác của Pantoea stewartii điện di để kết luận chính xác mẫu có Pantoea stewartii hay không.

N3

Chương 6 KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN TRONG MẪU DNA LY TRÍCH BẰNG PRIMER TRÊN BÀI BÁO

6.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian: 8 giờ, ngày 13 tháng 12 năm 2024

Địa điểm: Ribe 304, phòng chuẩn đoán bệnh học – Khoa Khoa học Sinh học TrườngĐại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

6.2 Nội dung thực hiện

Thực hiện quy trình phát hiện vi khuẩn Pantoea stewartii bằng cặp mồi chuyên biệt

dựa vào bài báo nghiên cứu

6.3 Vật liệu và phương pháp

Thiết bị và dụng cụ: Máy vortex,, micropipette, máy PCR

Hóa chất : loading die, gel red, DNA mẫu, H2O, buffer, ladder, agarose, dung dịchTBE 0,5x

Mục tiêu : Phản ứng giúp kiểm tra có sự hiện diện của Pantoea stewartii

Quy trình phản ứng PCR được thực hiện như sau:

Kết thúc Hậu kéo dài 72 7 phút

Sau khi PCR xong tiến hành điện di sản phẩm PCR:

Bước 1 Chuẩn bị gel agarose 1%: Cân 0.3 g agarose vào 30 ml dung dịch TBE 0,5x,lắc đều hỗn hợp dung dịch Đem cốc vào lò vi sóng để đun sôi, sau đó đổ vào khuôn Đưa gelvào bồn điện di

Bước 2 Chuẩn bị mẫu điện điện di: hút 1 µl gel red và 4 µl sản phẩm PCR vào giấybạc trộn đều Hút hỗn hợp vào giếng

Bước 3 Chuẩn bị ladder, đối chứng âm và đối chứng dương : Trộn đều 1.5 µl ladder

và 1 µl gel red, đưa hỗn hợp vào giếng Hút đối chứng âm và 1 µl gel red vào giếng Hút đốichứng dương và 1 µl gel red vào giếng

Bước 4 Điện di: đậy nắp bồn điện di cẩn thận Điều chỉnh điện di ở hiệu điện thế 100

V trong 20 phút

6.4 Kết quả và thảo luận

Hình 4.1 Kết quả điện di của sản phẩm PCR với cặp mồi trên bài báo.

Thảo luận: dựa trên kết quả điện di thì giếng của nhóm không xuất hiện vạch trắng

Mà với mẫu N của nhóm nhận có Pantoea stewartii thì kết quả trên chưa chính xác Kết hợp

với kết quả tuẩn trước chạy pcr với cặp mồi chuyên biệt của lab thiết kế cũng không có band

Ta có thể điện di thêm một lần nữa để đảm bảo quả trình điện di không có sai sót Nếu điện

di lại có band ta cần làm pcr lại rồi so sánh kết quả để so sánh với kết quả hiênh tại Nếu điện

di lại không có band ta có thể kết luận mẫu không có chứa Pantoea stewartii Nguyên nhân

có thể do DNA mẫu bị suy yếu, hoặc có thể sai sót ở mẫu lúc đầu đánh dấu sai không có

Pantoea stewartii trong mẫu như dự kiến.