Nhóm 6 chẩn Đoán bệnh thực vật bằng shpt

MỤC LỤCDANH SÁCH HÌNH.... Phương pháp Metagenomic.... Ly trích DNA.... Phân tích metagenomic..... DANH SÁCH HÌNHÌNHTrangHình 4.1... Mục tiêu đề tài ng d ng MinION trong ch n đoán b nh tr

B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Ộ Ụ Ạ

TR ƯỜ NG Đ I H C NÔNG LÂM THÀNH PH H CHÍ MINH Ạ Ọ Ố Ồ

KHOA KHOA H C SINH H C Ọ Ọ

BÁO CÁO MÔN HỌC CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG

MỤC LỤC

DANH SÁCH HÌNH

DANH SÁCH B NGẢ

Chương I M Đ UỞ Ầ

1.1 Đ t v n đặ ấ ề

1.2 M c tiêu đ tàiụ ề

1.3 N i dung th c hi nộ ự ệ

Chương II T NG QUAN TÀI LI UỔ Ệ

2.1 T ng quan v cây cà chuaổ ề

2.2 T ng quan v vi khu n gây b nh trên cây tr ngổ ề ẩ ệ ồ

2.3 Phương pháp Metagenomic

Chương III V t li u và phậ ệ ương pháp

3.1 V t li uậ ệ

3.2 N i dung nghiên c uộ ứ

3.2.1 Chu n b v t li u ly tríchẩ ị ậ ệ

3.2.1.1 Ch ng b nh trên cây cà chua in vitroủ ệ

3.2.1.2 L a ch n các cây cà chua nhi m b nh t nhiênự ọ ễ ệ ự

3.2.2 Ly trích DNA

3.2.3 Xây d ng th vi n DNAự ư ệ

3.2.4 Gi i trình t ả ự genome Illumina và l p ghépắ

3.2.5 Phân tích metagenomic

Chương IV K t qu và th o lu nế ả ả ậ

4.1 Xác đ nh m m b nh khi ch ng b nh đ nị ầ ệ ủ ệ ơ

4.2 Xác đ nh m m b nh khi ch ng b nh h n h pị ầ ệ ủ ệ ỗ ợ

4.3 Nh n di n m m b nh d a trên l p ráp metagenomeậ ệ ầ ệ ự ắ

Chương V K T LU N VÀ KI N NGHẾ Ậ Ế Ị 5.1 K t lu n và ki n nghế ậ ế ị TÀI LI U THAM KH O Ệ Ả

DANH SÁCH HÌNHÌNH

TrangHình 4.1 Cây cà chua b b nhị ệ ………10

Hình 4.2 nh ch p màn hình đ u ra t công c Oxford Nanopore TechnologiesẢ ụ ầ ừ ụWIMP cho th y vi c gán phân lo i cho m u L-K40ấ ệ ạ ẫ ……….…11

Hình 4.3 Bi u đ k t qu c p đ loài b ng cách s d ng các chể ồ ế ả ở ấ ộ ằ ử ụ ương trình d aựtrên đ cọ WIMP, Sourmash và MetaMaps

Hình 4.4 Bi u đ k t qu c p đ loài b ng cách s d ng các chể ồ ế ả ở ấ ộ ằ ử ụ ương trình d aựtrên đ cọ WIMP, Sourmash và MetaMaps

Hình 4.5 T l ph n trăm b gen tỷ ệ ầ ộ ương đ i cho m i m u d a trên BLASTN số ỗ ẫ ự ử

d ng contigs làm truy v n đ i v i c s d li u b gen tùy ch nh.ụ ấ ố ớ ơ ở ữ ệ ộ ỉ

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Phát hi n s m và ch n đoán chính xác b nh th c v t là đi u ki n tiên quy tệ ớ ẩ ệ ự ậ ề ệ ế

đ ki m soát và phòng ng a b nh hi u qu (Tinivella và ctv, 2008) Dù các nhàể ể ừ ệ ệ ả

b nh lý h c th c v t giàu kinh nghi m có th ch n đoán b nh d a trên tri uệ ọ ự ậ ệ ể ẩ ệ ự ệ

ch ng, phứ ương pháp này không th xác đ nh tác nhân gây b nh c p đ ch ng Víể ị ệ ở ấ ộ ủ

d , ba ch ng khác nhau c a ụ ủ ủ Pseudomonas syringae pathovar tomato gây tri uệ

ch ng b nh đ m vi khu n gi ng nhau trên cà chua (Cai và ctv, 2011), hay b n loàiứ ệ ố ẩ ố ốthu c chi ộ Xanthomonas cũng gây tri u ch ng không th phân bi t trên lá cà chuaệ ứ ể ệ(Jones và ctv, 2004) Vi c xác đ nh tác nhân gây b nh đ n c p đ ch ng là c nệ ị ệ ế ấ ộ ủ ầthi t vì các ch ng khác nhau có th có ph m vi ký ch và yêu c u bi n pháp ki mế ủ ể ạ ủ ầ ệ ểsoát khác bi t (Yan và ctv, 2008; Williamson và ctv, 2002).ệ

Các công c phân t nh gi i trình t toàn b b gen (WGS) và metagenomicsụ ử ư ả ự ộ ộ

đã c i thi n kh năng xác đ nh tác nhân gây b nh WGS, hi n đả ệ ả ị ệ ệ ược áp d ng phụ ổ

bi n trong giám sát d ch b nh th c ph m (Nadon và ctv, 2017), cho phép xác đ nhế ị ệ ự ẩ ịtác nhân c p đ ch ng mà không c n PCR, h tr b i c s d li u b gen nhở ấ ộ ủ ầ ỗ ợ ở ơ ở ữ ệ ộ ưLINbase (Tian và ctv, 2019) Tuy nhiên, phương pháp này yêu c u các ch ng thu nầ ủ ầkhi t, làm h n ch tính ng d ng trong môi trế ạ ế ứ ụ ường th c t ự ế

Gi i trình t metagenomics vả ự ượt tr i h n WGS ch không c n nuôi c y vàộ ơ ở ỗ ầ ấ

có th phát hi n nhi u tác nhân khác nhau trong cùng m t m u, ngo i tr RNAể ệ ề ộ ẫ ạ ừvirus (Mechan-Llontop và ctv, 2019) Tuy nhiên, vi c phân tích d li u DNAệ ữ ệmetagenomics g p thách th c b i s l n l n gi a DNA cây ch và vi khu n khôngặ ứ ở ự ẫ ộ ữ ủ ẩgây b nh, đòi h i các thu t toán và c s d li u chuyên bi t đ x lý (Loit và ctv,ệ ỏ ậ ơ ở ữ ệ ệ ể ử2019)

Hi n nay, gi i trình t nanopore b ng thi t b MinION (Oxford Nanoporeệ ả ự ằ ế ịTechnologies) n i lên nh m t công c đ y h a h n MinION có th cung c p k tổ ư ộ ụ ầ ứ ẹ ể ấ ế

qu nhanh chóng, v i các quy trình chu n b ng n và kh năng ho t đ ng linh ho tả ớ ẩ ị ắ ả ạ ộ ạtrong nhi u môi trề ường (Jain và ctv, 2016; MinION brochure 2019) Tuy nhiên, tỷ

l l i gi i trình t cao (kho ng 10%) và gi i h n tái s d ng là các h n ch l nệ ỗ ả ự ả ớ ạ ử ụ ạ ế ớ(Loit và ctv, 2019)

MinION đã đượ ử ục s d ng đ xác đ nh tác nhân gây b nh trên các cây tr ngể ị ệ ồkhác nhau nh lúa mì và cà chua, s d ng ph n m m WIMP ho c các công c như ử ụ ầ ề ặ ụ ưBLASTN và Sourmash đ phân tích (Hu và ctv, 2019; Chalupowicz và ctv, 2019).ểTrong nghiên c u c a Nhóm , thi t b này đứ ủ ế ị ược th nghi m trên cây cà chua nhi mử ệ ễ

Pseudomonas syringae và Xanthomonas, v i các c s d li u tùy ch nh và công cớ ơ ở ữ ệ ỉ ụ

nh MetaMaps và LINbase đ xác đ nh tác nhân gây b nh đ n c p đ ch ng (Tianư ể ị ệ ế ấ ộ ủ

và ctv, 2019; Dilthey và ctv, 2019) K t qu cho th y kh năng ng d ng ti m năngế ả ấ ả ứ ụ ề

c a MinION trong ch n đoán b nh th c v t v i đ chính xác cao.ủ ẩ ệ ự ậ ớ ộ

1.2 Mục tiêu đề tài

ng d ng MinION trong ch n đoán b nh trên cây cà chua nhi m

Pseudomonas syringae và Xanthomonas.

1.3 Nội dung thực hiện

N i dung 1: Chu n b v t li u ly tríchộ ẩ ị ậ ệ

N i dung 2: Ly trích DNAộ

N i dung 3: Xây d ng th vi n DNAộ ự ư ệ

N i dung 4: Gi i trình t genome Illumina và l p ghépộ ả ự ắ

N i dung 5: Phân tích metagenomicộ

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây cà chua

Cây cà chua (Solanum lycopersicum) thu c h Cà (Solanaceae), là lo i câyộ ọ ạ

tr ng có giá tr kinh t và dinh dồ ị ế ưỡng cao, ph bi n trên toàn th gi i Theo nghiênổ ế ế ớ

c u c a Rick (1978), cà chua có ngu n g c t khu v c Nam Mỹ, đ c bi t là vùngứ ủ ồ ố ừ ự ặ ệAndes, và đã được du nh p vào các châu l c khác nh kh năng thích nghi cao vàậ ụ ờ ả

ti m năng ng d ng trong m th c.ề ứ ụ ẩ ự

Cà chua là cây thân th o, s ng ng n ngày, phù h p v i khí h u ôn đ i và nhi tả ố ắ ợ ớ ậ ớ ệ

đ i Cây phát tri n t t nh t trong kho ng nhi t đ t 20–27°C, yêu c u ánh sángớ ể ố ấ ả ệ ộ ừ ầ

đ y đ và đ t t i x p, giàu dinh dầ ủ ấ ơ ố ưỡng Nghiên c u c a Peet và Willits (1998)ứ ủ

nh n m nh r ng vi c cung c p đ nấ ạ ằ ệ ấ ủ ước và ch t dinh dấ ưỡng đóng vai trò quan

tr ng trong vi c t i u hóa năng su t cây tr ng.ọ ệ ố ư ấ ồ

Qu cà chua không ch là ngu n cung c p th c ph m mà còn là ngu n dinhả ỉ ồ ấ ự ẩ ồ

dưỡng phong phú Theo nghiên c u c a Giovannucci (1999), cà chua ch a nhi uứ ủ ứ ềvitamin nh vitamin C, vitamin A, và các ch t ch ng oxy hóa m nh nh lycopene.ư ấ ố ạ ưLycopene, m t carotenoid t nhiên có trong qu cà chua chín, độ ự ả ược ch ng minh làứ

có tác d ng phòng ch ng ung th , đ c bi t là ung th tuy n ti n li t, và gi m nguyụ ố ư ặ ệ ư ế ề ệ ả

ph n vào xu t kh u, đem l i ngu n thu nh p đáng k cho nông dân Tuy nhiên,ầ ấ ẩ ạ ồ ậ ể

s n xu t cà chua cũng đ i m t v i nhi u thách th c, bao g m sâu b nh, h n hán vàả ấ ố ặ ớ ề ứ ồ ệ ạ

bi n đ i khí h u Đ c bi t, b nh do các tác nhân vi khu n là m t trong nh ng m iế ổ ậ ặ ệ ệ ẩ ộ ữ ốnguy h i l n, gây thi t h i nghiêm tr ng v năng su t và ch t lạ ớ ệ ạ ọ ề ấ ấ ượng

Nhi u nghiên c u đã t p trung vào vi c c i thi n gi ng cây và áp d ng côngề ứ ậ ệ ả ệ ố ụngh hi n đ i nh m nâng cao hi u qu s n xu t Theo FAO (2020), các gi i phápệ ệ ạ ằ ệ ả ả ấ ả

nh s d ng gi ng cà chua kháng b nh, áp d ng kỹ thu t tư ử ụ ố ệ ụ ậ ưới nh gi t và qu n lýỏ ọ ảsâu b nh theo hệ ướng sinh h c đang đọ ược khuy n khích đ hế ể ướng đ n s n xu tế ả ấ

b n v ng.ề ữ

Cây cà chua không ch là cây tr ng quan tr ng đ i v i nông nghi p Vi t Namỉ ồ ọ ố ớ ệ ệ

mà còn đóng vai trò l n trong chu i giá tr th c ph m toàn c u Do đó, vi c nghiênớ ỗ ị ự ẩ ầ ệ

c u và phát tri n kỹ thu t canh tác hi n đ i là c p thi t đ nâng cao năng su t,ứ ể ậ ệ ạ ấ ế ể ấ

ch t lấ ượng và kh năng c nh tranh trong b i c nh h i nh p qu c t ả ạ ố ả ộ ậ ố ế

2.2 Tổng quan về vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng

Các tác nhân vi khu n gây b nh trên cây tr ng là m t nhóm tác nhân sinh h cẩ ệ ồ ộ ọquan tr ng, đóng vai trò chính trong vi c làm gi m năng su t và ch t lọ ệ ả ấ ấ ượng cây

tr ng Vi khu n gây b nh có th t n công cây tr ng qua nhi u con đồ ẩ ệ ể ấ ồ ề ường khácnhau nh v t thư ế ương c h c, v t n t trên v cây, ho c qua các l khí kh ng M tơ ọ ế ứ ỏ ặ ỗ ổ ộkhi xâm nh p vào cây, vi khu n có th phát tri n và gây ra các tri u ch ng b nhậ ẩ ể ể ệ ứ ệnghiêm tr ng, t nh ng v t đ m nh trên lá, thân, đ n hi n tọ ừ ữ ế ố ỏ ế ệ ượng th i r a, héoố ữcây, làm nh hả ưởng tr c ti p đ n s phát tri n c a cây.ự ế ế ự ể ủ

Các vi khu n gây b nh cây tr ng thu c nhi u gi ng khác nhau, trong đó cóẩ ệ ồ ộ ề ố

m t s gi ng đ c bi t ph bi n nh ộ ố ố ặ ệ ổ ế ư Xanthomonas, Pseudomonas, Erwinia,

Ralstonia, và Agrobacterium Các loài vi khu n này có kh năng t n công nhi u lo iẩ ả ấ ề ạcây tr ng khác nhau và gây ra nhi u lo i b nh, nh b nh cháy lá, b nh héo xanh,ồ ề ạ ệ ư ệ ệ

th i r , hay th i thân Ví d , ố ễ ố ụ Xanthomonas gây b nh cháy lá trên nhi u lo i cây nhệ ề ạ ư

b p c i, cà chua, và tiêu ắ ả Erwinia có th gây th i r a cho nhi u lo i cây tr ng, trongể ố ữ ề ạ ồ

khi Ralstonia gây b nh héo xanh trên các cây h cà.ệ ọ

Vi khu n gây b nh có th lây lan qua nẩ ệ ể ướ ước t i, gió, côn trùng ho c các d ngặ ụ

c canh tác, và khi đã xâm nh p vào cây tr ng, chúng thụ ậ ồ ường phát tri n nhanhểchóng Vi khu n có th ti t ra các enzyme phá h y t bào cây ho c sinh ra các đ cẩ ể ế ủ ế ặ ộ

t gây h i, d n đ n các tri u ch ng b nh n ng n , nh lá vàng úa, héo, ho c th iố ạ ẫ ế ệ ứ ệ ặ ề ư ặ ố

r a M t s b nh do vi khu n gây ra còn có th làm gi m kh năng quang h p c aữ ộ ố ệ ẩ ể ả ả ợ ủcây, d n đ n gi m năng su t và làm cho cây tr ng d b t n công b i các tác nhânẫ ế ả ấ ồ ễ ị ấ ởgây b nh khác.ệ

Vi c phòng ng a và ki m soát b nh do vi khu n gây ra trong nông nghi pệ ừ ể ệ ẩ ệ

g p nhi u khó khăn M t trong nh ng lý do chính là vi khu n có kh năng phátặ ề ộ ữ ẩ ảtri n và nhân lên r t nhanh, đ ng th i có th kháng l i m t s lo i thu c b o vể ấ ồ ờ ể ạ ộ ố ạ ố ả ệ

th c v t Các bi n pháp ki m soát vi khu n bao g m vi c s d ng gi ng cây khángự ậ ệ ể ẩ ồ ệ ử ụ ố

b nh, v sinh d ng c canh tác, và s d ng thu c kháng sinh ho c các bi n phápệ ệ ụ ụ ử ụ ố ặ ệsinh h c nh ch ph m vi sinh Tuy nhiên, vi c qu n lý b nh do vi khu n gây raọ ư ế ẩ ệ ả ệ ẩđòi h i s k t h p c a nhi u bi n pháp và s giám sát liên t c đ đ m b o hi uỏ ự ế ợ ủ ề ệ ự ụ ể ả ả ệ

qu trong s n xu t nông nghi p.ả ả ấ ệ

2.3 Phương pháp Metagenomic

Metagenomics là nghiên c u v metagenomes, nh m thu v t li u di truy nứ ề ằ ậ ệ ề

tr c ti p t các m u trong môi trự ế ừ ẫ ường Lĩnh v c r ng l n này có th đự ộ ớ ể ược hi u làể

di truy n h c môi trề ọ ường, di truy n h c sinh thái hay di truy n h c qu n xã N uề ọ ề ọ ầ ế

nh di truy n h c và vi sinh v t h c truy n th ng gi i trình t b gen (genomeư ề ọ ậ ọ ề ố ả ự ộsequencing) c a vi sinh v t d a trên m u là các m u dòng đã nuôi c y, thì ngay tủ ậ ự ẫ ẫ ấ ừ

nh ng nghiên c u đ u tiên, di truy n h c môi trữ ứ ầ ề ọ ường đã nhân dòng các đo n trìnhạ

t gen đ c hi u (thự ặ ệ ường là gen 16S rRNA) đ xây d ng d li u v đa d ng sinh h cể ự ữ ệ ề ạ ọ

c a các m u môi trủ ẫ ường V i nh ng nghiên c u bớ ữ ứ ước đ u đó, ngầ ười ta đã nh n raậ

r ng n u ch ti p t c nghiên c u theo ki u truy n th ng thì sẽ không th tìm hi uằ ế ỉ ế ụ ứ ể ề ố ể ể

v s đa d ng sinh h c c a vi sinh v t đề ự ạ ọ ủ ậ ược Nh ng nghiên c u metagenomics g nữ ứ ầđây thường th c hi n b ng phự ệ ằ ương pháp Sanger ("shotgun" Sanger sequencing),

ho c song song v i phặ ớ ương pháp pyrosequencing đ có các m u c a t t c các genể ẫ ủ ấ ả

t m i cá th trong qu n xã m u Chính vì vai trò quan tr ng trong vi c khám pháừ ỗ ể ầ ẫ ọ ệ

đa d ng vi sinh v t mà metagenomics có th đạ ậ ể ược coi nh m t lăng kính giúp taư ộ

hi u h n v th gi i c a các sinh v t nh bé, đóng góp vào hi u bi t c a nhân lo iể ơ ề ế ớ ủ ậ ỏ ể ế ủ ạ

v toàn b th gi i s ng.ề ộ ế ớ ố

Thu t ng "metagenomics" đậ ữ ược gi i thi u b i Jo Handelsman, Jon Clardy,ớ ệ ởRobert M Goodman và m t s ngộ ố ười khác, và xu t hi n l n đ u trong m t bài báoấ ệ ầ ầ ộvào năm 1998 Thu t ng metagenome ph n ánh ý tậ ữ ả ưởng v b s u t m các genề ộ ư ầ

được gi i mã tr c ti p t môi trả ự ế ừ ường v i cách tớ ương t nh nghiên c u v t ngự ư ứ ề ừgenome Kevin Chen and Lior Pachter (University of California, Berkeley) đã đ nhịnghĩa metagenomics là " vi c ng d ng các kỹ thu t di truy n hi n đ i trongệ ứ ụ ậ ề ệ ạnghiên c u v qu n xã vi sinh v t m t cách tr c ti p trong môi trứ ề ầ ậ ộ ự ế ường t nhiênự

c a chúng mà không c n ph i phân l p và nuôi c y chúng trong phòng thíủ ầ ả ậ ấnghi m".ệ

Nguyên lý c a metagenomics liên quan đ n vi c nghiên c u b gen c a cácủ ế ệ ứ ộ ủ

c ng đ ng vi khu n trong các m u môi trộ ồ ẩ ẫ ường s lố ượng l n tr c ti p mà khôngớ ự ế

c n nuôi c y t ng loài Đi u này cho phép phân tích chi ti t các c ng đ ng viầ ấ ừ ề ế ộ ồkhu n và kh c ph c nh ng h n ch c a các phẩ ắ ụ ữ ạ ế ủ ương pháp nuôi c y trong phòng thíấnghi m truy n th ng Quy trình trong metagenomics bao g m thu th p các m uệ ề ố ồ ậ ẫmôi trường, trích xu t DNA t các vi sinh v t có trong m u, gi i trình t b ng cácấ ừ ậ ẫ ả ự ằcông ngh thông lệ ượng cao và phân tích d li u gi i trình t b ng các công c tinữ ệ ả ự ằ ụsinh h c đ xác đ nh và mô t các c ng đ ng vi khu n trong môi trọ ể ị ả ộ ồ ẩ ường s ng tố ựnhiên c a chúng Nghiên c u metagenomic có th đủ ứ ể ược th c hi n b ng haiự ệ ằ

phương pháp chính Phương pháp đ u tiên là gi i trình t m c tiêu d a trênầ ả ự ụ ựnguyên t c nh m m c tiêu vào các vùng c th c a b gen c a sinh v t có thắ ắ ụ ụ ể ủ ộ ủ ậ ể

đượ ử ục s d ng đ xác đ nh và mô t đ c đi m c a sinh v t Phể ị ả ặ ể ủ ậ ương pháp th hai làứ

gi i trình t shotgun d a trên nguyên t c gi i trình t ng u nhiên t t c DNAả ự ự ắ ả ự ẫ ấ ảtrong m t m u Phộ ẫ ương pháp này cung c p phân tích chi ti t v v t li u di truy nấ ế ề ậ ệ ề

t t t c các sinh v t trong m u.ừ ấ ả ậ ẫ

Hai lo i phạ ương pháp metagenomics chính là metagenomics m c tiêu vàụmetagenomics shotgun

Metagenomics m c tiêu , còn đụ ượ ọc g i là gi i trình t d a trên amplicon, baoả ự ự

g m gi i trình t các d u hi u di truy n c th ho c các vùng đồ ả ự ấ ệ ề ụ ể ặ ược b o t n trongả ồ

c ng đ ng vi khu n, ch ng h n nh rRNA 16S đ i v i vi khu n và rRNA 18S ho cộ ồ ẩ ẳ ạ ư ố ớ ẩ ặvùng phân cách phiên mã n i b (ITS) đ i v i n m Các vùng này có trình t bi nộ ộ ố ớ ấ ự ế

đ i h u ích cho vi c xác đ nh các sinh v t khác nhau có trong các m u môi trổ ữ ệ ị ậ ẫ ườngkhác nhau Tuy nhiên, vi c xác đ nh các sinh v t c p đ loài là m t thách th c v iệ ị ậ ở ấ ộ ộ ứ ớ

phương pháp này Phương pháp này thường không cung c p đ phân gi i c p đấ ộ ả ở ấ ộ

ch ng ủ

Shotgun metagenomics ho c toàn b h gen shotgun metagenomics (WGS)ặ ộ ệliên quan đ n vi c gi i trình t ng u nhiên t t c các v t li u di truy n trong m tế ệ ả ự ẫ ấ ả ậ ệ ề ộ

m u Không gi ng nh các phẫ ố ư ương pháp gi i trình t có m c tiêu t p trung vào cácả ự ụ ậ

d u hi u di truy n c th , shotgun metagenomics gi i trình t t t c các DNA cóấ ệ ề ụ ể ả ự ấ ảtrong m t m u Đi u này cung c p thông tin chi ti t v c thành ph n phân lo i vàộ ẫ ề ấ ế ề ả ầ ạ

ch c năng c a c ng đ ng vi khu n Nó cũng cho phép xác đ nh c p đ loài.ứ ủ ộ ồ ẩ ị ở ấ ộ

CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu

H t gi ng cà chua gi ng 'Rio Grande', năm cây cây cà chua có tri u ch ng c aạ ố ố ệ ứ ủ

đ m vi khu n, m t cây có tri u ch ng b nh đ m lá Septoria, và m t cây không cóố ẩ ộ ệ ứ ệ ố ộtri u ch ng đệ ứ ược thu th p vào ngày 10 tháng 8 năm 2018, t i khu v c Easternậ ạ ựShore, bang Virginia

Các ch ng vi khu n ủ ẩ Pseudomonas syringae pv tomato K40 (thuộc chủng T1), P.

syringae pv tomato DC3000 (thuộc chủng DC3000), P syringae pv syringae B728a và

P syringae 642

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Chuẩn bị vật liệu ly trích

3.2.1.1 Chủng bệnh trên cây cà chua in vitro

H t gi ng cà chua gi ng 'Rio Grande' đạ ố ố ược gieo trong đ t tr ng h n h p dấ ồ ỗ ợ ưới

đi u ki n phòng thí nghi m v i chu kỳ ngày dài (16 gi chi u sáng) và đề ệ ệ ớ ờ ế ược nhi mễ

b nh khi cây đệ ược 4 tu n tu i.ầ ổ

Các ch ng vi khu n ủ ẩ Pseudomonas syringae pv tomato K40 (thuộc chủng T1), P.

syringae pv tomato DC3000 (thuộc chủng DC3000), P syringae pv syringae B728a và

P syringae 642 được nuôi trong môi trường r n King B nhi t đ 28°C trong 24ắ ở ệ ộ

trước khi th c hi n nhi m khu n.ự ệ ễ ẩ

Dung d ch Silwet L-77 (0,025% v/v) đị ược thêm vào các h n h p vi khu n đỗ ợ ẩ ể

h tr quá trình nhi m khu n Cây đỗ ợ ễ ẩ ược đ t trong các túi nh a kín đ duy trì đặ ự ể ộ

m cao trong 24 gi tr c khi nhi m khu n Sau khi cây đ c phun dung d ch

ch a vi khu n (10 ml), chúng đứ ẩ ược đ t l i vào túi nh a trong 24 gi ti p theo.ặ ạ ự ờ ế

M u đẫ ược thu th p đ chi t xu t DNA sau 4 ngày nhi m khu n Vi c nhi mậ ể ế ấ ễ ẩ ệ ễ

v i dung d ch MgSO 10 mM đớ ị ₄ ượ ử ục s d ng nh là m t đ i ch ng.ư ộ ố ứ