Nhóm 1 báo cáo thực hành chuẩn Đoán bệnh thực vật bằng shpt

Kết quả phân lập cho thấy vi khuẩn hiện diện trên tất cả các mẫu bệnh có hình que, gram âm, khuẩn lạc màu vàng.. Nội dung thực hiện Nội dung 1: Ly trích DNA của Pantoea stewartii từ dịch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH

HỌC PHÂN TỬ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA

KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH

HỌC PHÂN TỬ

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

PGS TS NGUYỄN BẢO QUỐC

TP.Thủ Đức, 1/2025

i

LÊ HỒNG DUY

LÊ QUỐC ĐẠT PHẠM QUỐC HƯNG MAI CÔNG THÀNH

LÊ HOÀNG PHÚC

MỤC LỤC

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Tổng quan 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2: LY TRÍCH DNA VI KHUẨN BẰNG LYSIS BUFFER VÀ ĐIỆN DI DNA TỔNG SỐ TRÊN GEL AGAROSE 3

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3

2.2 Đối tượng nghiên cứu 3

2.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 3

2.4 Phương pháp thực hiện 3

2.5 Kết quả 3

CHƯƠNG 3: THỰC HIỆN PCR 16S VÙNG ĐẶC TRƯNG CHO SỰ HIỆN DIỆN VI KHUẨN 4

3.1 Vật liệu thí nghiệm 4

3.1.1 Đối tượng thí nghiệm 4

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 4

3.2 Phương pháp thực hiện 4

3.3 Kết quả và Thảo luận 5

3.3.1 Kết quả 5

3.3.2 Thảo luận 6

CHƯƠNG 4: THỰC HIỆN PCR VỚI CẶP PRIMER CHUYÊN BIỆT 7

4.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 7

4.2 Vật liệu thí nghiệm 7

4.2.1 Đối tượng thí nghiệm 7

4.2.2 Dụng cụ thiết bị hóa chất 7

4.3 Phương pháp thực hiện 7

4.3.1 Thực hiện PCR 7

4.3.2 Điên di sản phẩm PCR 8

4.4 Kết quả thảo luận 8

CHƯƠNG 5: CHẠY PRIMER CHUYÊN BIỆT 10

5.1.1 Vật liệu 10 5.1.2 Phương pháp 10 5.2 Kết quả 11

iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang Hình 3.1.Kết quả điện di quan sát dưới đèn UV 6 Hình 3.2.Kết quả điện di quan sát dưới đèn UV 9 Hình 3.3 Kết quả sau điện di 11

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần master mix 6

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 6

Bảng 4.1 Các thành phần phản ứng 8

Bảng 4.2 Chu kỳ nhiệt của quy trình PCR với 30 chu kỳ 9

Bảng 5.1 Thành phần master mix 10

Bảng 5.2 Chu trình nhiệt của phan ứng PCR 10

v

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Tổng quan

Cây mít là cây ăn trái quan trọng có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam Hiện nay, giống mít Siêu Sớm đang được nông dân chú trọng phát triển do cho trái sớm, dễ trồng, phẩm chất và năng suất cao cũng như có lợi nhuận cao Tỉnh Tiền Giang là một trong những tỉnh

có diện tích trồng mít lớn nhất khu vực đồng bằng sông Cửu Long với tổng diện tích hơn 6.000 ha Tuy nhiên, do quy mô diện tích và mức độ trồng tập trung thâm canh cao cùng một số yếu tố khác đã dẫn đến dịch bệnh gây hại ngày càng tăng

Trong quá trình canh tác, cây mít đang đối mặt với nhiều loại sâu bệnh, trong đó

nghiêm trọng nhất là bệnh đen sơ mít do vi khuẩn Pantoea stewartii gây ra Bệnh xơ đen

xuất hiện phổ biến và gây hại nặng trên giống mít Changai tại Tiền Giang, gây thiệt hại từ

15 đến 30% sản lượng Kết quả phân lập cho thấy vi khuẩn hiện diện trên tất cả các mẫu bệnh có hình que, gram âm, khuẩn lạc màu vàng Tiền Giang có diện tích cây ăn quả lớn nhất vùng Đồng bằng sông Cửu Long, với nhiều chủng giá trị xuất khẩu của ngành cây ăn quả Việt Nam Trong vài năm gần đây, giống mít hangai được nhà vườn quan tâm phát triển, đặc biệt tại các huyện như Cái Bè, Cai Lậy, thị xã Cai Lậy và Tân Phước

Vì đây là đối tượng dịch hại mới chưa xác định được tác nhân, nên việc đề xuất các biện pháp phòng chống còn gặp nhiều hạn chế; nhiều nhà vườn đã áp dụng nhiều biện pháp khác nhau, nhưng chưa đem hiệu quả như mong muốn hính vì thế, việc nghiên cứu xác định nguyên nhân gây bệnh xơ đen trên mít là rất cần thiết và cấp bách là cơ sở khoa học quan trọng để xây dựng các biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả và bền vững

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định sự hiện diện của vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh đen sơ trên mít bằng kĩ

thuật khuyếch đại PCR và điện di trên gel agarose

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Ly trích DNA của Pantoea stewartii từ dịch khuẩn tăng sinh và điện di tổng

số để kiểm tra sự hiện diện của chủng vi khuẩn này sau ly trích

Nội dung 2: Thực hiện PCR vùng trình tự 16s rARN vùng đặc trưng cho sự hiện diện vi khuẩn và điện di trên gel agarose quan sát band có sử dụng ladder

Nội dung 3: Thực hiện phản ứng PCR với primer thiết kế cho Pantoea stewartii và điện

di kiểm tra kết quả khuyếch đại

Nội dung 4: Thực hiện phản ứng PCR với primer tham khảo từ bài báo khoa học và điện

di kiểm tra kết quả trên gel agarose

vii

CHƯƠNG 2: LY TRÍCH DNA VI KHUẨN BẰNG LYSIS BUFFER VÀ ĐIỆN DI DNA TỔNG SỐ

TRÊN GEL AGAROSE

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện: ngày 06/12/2024

Địa điểm thực hiện: phòng RIBE 302 tòa A1, Khoa Khoa học sinh học, Trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu số 1 từ ống tăng sinh nghi ngờ có sự hiện diên của vi khuẩn Pantoea stewartii

2.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

- Dụng cụ: micropipet

- Thiết bị: Máy votex, máy ly tâm, bồn điện di, máy chụp gel UV

- Hóa chất: Gel agarose 1%, TBE bufer, Loading dye, Gel red, Chloroform, Ethanol 70%

2.4 Phương pháp thực hiện

- Hút 1 mL dịch tăng sinh khuẩn vào tube 1,5 mL

- Ly tâm 10000 vòng/ 3 phút và loại bỏ dịch nổi

- Lặp lại thao tác 2 lần

2.5 Kết quả

Không thu được cặn khuẩn do thao tác của người thực hiện không tốt hoặc do mẫu chưa mix đều hoặc mẫu tăng sinh không tốt dẫn đến thất thoát mẫu

CHƯƠNG 3: THỰC HIỆN PCR 16S VÙNG ĐẶC TRƯNG CHO SỰ HIỆN DIỆN VI KHUẨN

3.1 Vật liệu thí nghiệm

3.1.1 Đối tượng thí nghiệm

Mẫu DNA thu từ dịch ly trích vi khuẩn Pantoea stewarti

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất

Dụng cụ: pipet, đâu tuýp, eppendorf, cồn, giấy lau

Hóa chất: Free Water (H2O), Primer F, Primer R, Buffer, Tag, Agarose, TBE, Loading

Dye, Gel Red., DNA vi khuẩn Pantoea stewartii.

Thiết bị: máy vortex, máy PCR, bồn điện di

3.2 Phương pháp thực hiện

Bước 1: Đem mẫu DNA của nhóm đi vortex

Bước 2: Hút lần lượt các thành phần có trong phản ứng : Nước Buffer, Primer F, Primer R và Tag cho lần lượt vào Eppendorf, cuối cùng cho mẫu DNA của nhóm đã vortex vào Tổng 1 phản ứng là 10l

Bước 3: Đem đi phản ứng trên máy PCR với 30 chu kỳ trong 1 giờ 20 phút

Bước 4 : Chuẩn bị bồn điện di, mix 5 l mẫu với 1 l hỗn hợp Loading Dye và Gel Red theo tỉ lệ 5:1, cho hỗn hợp trên vào giếng

Bước 5: Cho ladder, đối chứng (+), đối chứng () vào trong giếng trên bồn điện di sau

đó bắt đầu điện di trong 25 phút ở 100V

ix

Bảng 3.1 Thành phần master mix

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt của phan ứng PCR

Biến tính

Bắt cặp

Kéo dài

95oC

53oC

72oC

30 giây

30 giây

30 giây

35

Hậu kéo dài

Bảo quản

72oC

10oC

7 phút

2 phút

1 1

3.3 Kết quả và Thảo luận

3.3.1 Kết quả

Qua kết qua điện di thu được, ta quan sát bằng mắt thường thấy giếng 2 không có

sự xuất hiện băng sáng hoặc băng bị mờ khó có thể qua sát được chứng tỏ DNA có ít trong mẫu, hoặc trong quá trình thao tác hút DNA chạy phản ứng PCR hút được ít DNA , mix mẫu không đều dẫn đến nồng độ phản ứng khác nhau Quan sát các giếng còn lại đa

số có sự xuất hiện băng sáng chứng tỏ có sự xuất hiện của DNA vi khuẩn trong mẫu Do

đó chứng tỏ rằng trong mẫu ly trình DNA vi khuẩn có sự hiện diện của DNA vi khuẩn

Pantoea stewatii.

Hình 3.1 Kết quả điện di quan sát dưới đèn UV.

3.3.2 Thảo luận

Qua thí nghiệm ta có thể tiến hành làm giảm nồng độ pha loãng của phản ứng để tiến hành hiệu quả hơn

11 N1

CHƯƠNG 4: THỰC HIỆN PCR VỚI CẶP

PRIMER CHUYÊN BIỆT

4.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian: Vào lúc 8h00, ngày 20 tháng 12 năm 20224

Địa điểm: BIO 305, tòa nhà A1, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

4.2 Vật liệu thí nghiệm

4.2.1 Đối tượng thí nghiệm

Mẫu DNA thu từ dịch ly trích vi khuẩn Pantoea stewarti

4.2.2 Dụng cụ thiết bị hóa chất

Thiết bị và dụng cụ: Máy vortex, Micropipet, Eppendorf, máy PCR, máy điện di, lò vi sóng

Hóa chất thí nghiệm: Free Water (H2O), Primer F, Primer R, Buffer, Tag, Agarose, TBE, Loading Dye, Gel Red

4.3 Phương pháp thực hiện

4.3.1 Thực hiện PCR

Bước 1: Đem mẫu DNA của nhóm đi vortex và kéo mẫu xuống

Bước 2: Dùng Micropipet hút lần lượt các thành phần phản ứng gồm có: Nước Buffer, Primer F, Primer R và Tag cho lần lượt vào Eppendorf, cuối cùng cho mẫu DNA của nhóm đã vortex vào Tổng 1 phản ứng là 10l

Bước 3: Đem đi phản ứng trên máy PCR với 30 chu kỳ trong 1 giờ 20 phút

Bảng 4.1 Các thành phần phản ứng

4.3.2 Điên di sản phẩm PCR

Bước 1: Chuẩn bị đổ gel 1% dùng cho điện di, cân 0,3 g Agarose và đong 30 ml TBE 0.5X cho cả 2 vào lọ đựng, cho lọ vào lò vi sóng đến khi gần sôi thì lấy ra tiến hành đổ gel vào khuôn Chờ khô gel, tháo lược

Bước 2: Chuẩn bị bồn điện di, mix 5 l mẫu với 1 l hỗn hợp Loading Dye và Gel Red, cho hỗn hợp trên vào giếng Cho ladder, đối chứng (+), đối chứng () vào trong giếng trên bồn điện di sau đó bắt đầu điện di trong 25 phút ở 100V

Bước 3: Đọc kết quả điện di, thu nhận kết quả

4.4 Kết quả thảo luận

Hình 4.1 Kết quả điện di quan sát dưới đèn UV.

13

Bảng4.2 Chu kỳ nhiệt của quy trình PCR với 30 chu kỳ

214bp

N1 +

 L

Kết quả sau khi điện di có xuất hiện band sáng của mẫu N1 trùng với band của đối

chứng dương (+) và đối chứng âm (-) không có band sáng cho thấy kết quả điện di đúng Vậy mẫu N1 dương tính với loài Pantoeja stewartii

CHƯƠNG 5: CHẠY PRIMER CHUYÊN BIỆT

5.1 Vật liệu và phương pháp

5.1.1 Vật liệu

Dụng cụ: pipet, đâu tuýp, eppendorf, cồn, giấy lau

Hóa chất: H2O, primer chuyên biệt, buffer, taq, DNA vi khuẩn Pantoea

stewartii.

Thiết bị: máy vortex, máy PCR, bồn điện di

5.1.2 Phương pháp

Bươc 1 Vortex mẫu DNA ly trích.

Bươc 2 Hút 1,5 µl DNA vào 8,5 µl master mix.

Bang 5.1 Thành phần master mix

Bươc 3 Chạy PCR.

Bang 5.2 Chu trình nhiệt của phan ứng PCR

Biến tính

Bắt cặp

Kéo dài

95oC

53oC

72oC

30 giây

30 giây

30 giây

35

Hậu kéo dài

Bảo quản

72oC

25oC

7 phút

2 phút

1 1

Bước 4 Hút 5 µl mẫu sau khi phản ứng PCR với 1 µl Gel Red theo tỉ lệ 5:1,

mix đều

Bước 5 Bơm vào giếng bồn điện di, điện di 100V trong vòng 25 phút.

15

5.2 Kết quả

Qua kết qua điện di thu được, quan sát bằng mắt thường thấy gần như tất cả các giếng đều có sự xuất hiện các băng sáng khá mờ có thể là do trong quá trình thao tác hút DNA chạy phản ứng PCR hút được ít DNA hoặc do để lâu gây giảm chất lượng của kết quả, cần có những biện pháp giải quyết việc này như trong quá trình thao tác thực hiện cẩn thận việc hút mẫu không để thiếu nồng độ dẫn đến thiếu hụt lượng DNA, thao tác các quá trình ly tâm, votex kỹ càng giúp cho tránh sai xót ngoài ý muốn Băng sáng mờ nhưng vẫn có thể quan sát được chứng tỏ DNA có ít trong mẫu, Do đó chứng tỏ rằng

trong mẫu ly trình DNA vi khuẩn có sự hiện diện của DNA vi khuẩn Pantoea stewatii.

Hình 5.1 Kết quả điện di quan sát dưới đèn UV.

N1