Một số phương pháp chẩn đốn bệnh ghẻ ở cây cĩ múi Các phương pháp chẩn đốn bệnh ghẻ ở cây cĩ múi đã phát triển đáng kể nhằmnâng cao độ nhạy và hiệu quả phát hiện.. Để cải thiện độ chínhx
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Mẫu thí nghiệm thu hoạch cam quýt bị bệnh ghẻ cam chanh do nấm Elsinoë fawcettii gây ra, với triệu chứng điển hình là mụn mủ màu vàng nhạt và khối u giống nút bần tại vị trí nhiễm trùng.
In the PDA environment, essential chemicals such as 70-96% ethanol, recombinant enzymes, isothermal polymerase, single-strand binding proteins, specific primers, dNTPs, and RPA reaction buffers are utilized Additionally, Cas12a protein and guide RNA (gRNA) play crucial roles in the process.
Thiết bị và dụng cụ: pipette, máy ủ nhiệt, máy ly tâm, băng thử nghiệm dòng chảy bên (LFA test strips)
Phương pháp nghiên cứu
Để chuẩn bị đối chứng dương tính, sợi nấm khô của E fawcettii được cắt nhỏ và nuôi cấy trên môi trường thạch khoai tây dextrose (PDA) ở nhiệt độ 25°C trong 2 tuần Sau đó, DNA tổng số được chiết xuất bằng bộ dụng cụ chiết xuất DNA bộ gen Bioneer AccuPrep® (Seoul, Hàn Quốc) và được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng RPA cũng như PCR thông thường nhằm tạo ra đối chứng dương tính.
Chuẩn bị chiết xuất thô từ mẫu thực vật bao gồm việc lấy một gam mô bị nhiễm bệnh và một gam mô khỏe mạnh, sau đó cho vào 2 mL đệm TE để tiến hành chiết xuất.
Để chuẩn bị mẫu DNA, sử dụng dung dịch đệm 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA với pH 7,6 và Polyethylene glycol (PEG) 6% PEG 200 từ Sigma-Aldrich, Vương quốc Anh, kết hợp với 20 mM NaOH và đệm GE3 Chiết xuất chung 3 từ Agdia, Elkhart, IN, Hoa Kỳ được nghiền bằng túi lót lưới ACC 00930 Mỗi phản ứng sử dụng 2 μL chiết xuất thô làm DNA khuôn mẫu.
Xét nghiệm RPA-CRISPR/Cas12a kết hợp khuếch đại RPA và phản ứng cắt CRISPR/Cas12a trong một ống phản ứng duy nhất, bao gồm bốn bước chính Đầu tiên, axit nucleic được chiết xuất từ mẫu Tiếp theo, DNA mục tiêu của E fawcettii được khuếch đại bằng phản ứng RPA trong 20 phút ở 37°C Sản phẩm khuếch đại được chuyển vào hỗn hợp chứa Cas12a và crRNA, nơi Cas12a được kích hoạt để cắt xuyên gen nếu có amplicon mục tiêu, hoàn tất trong 25 phút ở 37°C Cuối cùng, kết quả được đọc qua tín hiệu huỳnh quang hoặc phương pháp dòng chảy bên (LFA).
DNA khuếch đại được gắn nhãn FAM hoặc FITC ở một đầu và biotin ở đầu kia, cho phép nó bị bắt giữ bởi protein liên kết biotin tại dòng dưới cùng gần miếng đệm mẫu FAM/FITC được nhận diện bởi kháng thể anti-FAM/FITC gắn hạt nano vàng, tạo ra tín hiệu màu đặc trưng Trong quy trình này, ssDNA được sử dụng làm chất báo cáo, và khi không có amplicon mục tiêu, ssDNA vẫn nguyên vẹn, tạo tín hiệu mạnh tại vạch kiểm soát (C) và tín hiệu yếu tại vạch thử nghiệm (T), biểu thị kết quả âm tính Ngược lại, khi có amplicon mục tiêu, Cas12a sẽ cắt ssDNA, dẫn đến việc các hạt nano vàng tích tụ nhiều hơn tại vạch thử nghiệm (T) và giảm cường độ tín hiệu tại vạch kiểm soát (C), biểu thị kết quả dương tính.
Phương pháp này sử dụng ssDNA, streptavidin, kháng thể từ dê và hạt nano vàng để phát hiện bệnh E fawcettii Vạch C và T lần lượt là vạch kiểm soát và vạch thử nghiệm, cho thấy thiết kế này cung cấp một công cụ phát hiện nhanh, nhạy và dễ sử dụng, phù hợp cho cả điều kiện thực địa và phòng thí nghiệm đơn giản.
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình phát hiện bệnh (ghẻ) cam chanh đơn giản và nhanh chóng bằng xét nghiệm RPA-CRISPR/Cas12a-LFA.
Trình tự đặc hiệu loài của các đoạn đệm phiên mã nội bộ (IST) 1 và 2 giữa các locus gen rRNA 16S và 23S được sử dụng để nhận dạng vi khuẩn ở cấp độ loài và phân loài ITS1 và ITS2 từ E fawcettii được tải xuống từ NCBI và dùng làm khuôn mẫu cho thiết kế mồi Một số bộ mồi xuôi (F) và ngược (R) ứng viên đã được thử nghiệm, với các trình tự chi tiết được liệt kê trong Bảng 3.1 Các cặp mồi được sàng lọc về hiệu suất khuếch đại trong các phản ứng RPA bằng phương pháp điện di; kích thước của các amplicon có thể phân biệt được Tổng DNA của E fawcettii được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng RPA Kết quả cho thấy hầu hết các cặp mồi cho các dải đặc hiệu rõ ràng, nhưng một số cặp cũng cho dải không đặc hiệu Trong mẫu không có khuôn mẫu, một số cặp hình thành dải dimer mồi Cuối cùng, cặp mồi EF ITS F2/R2 được chọn làm ứng cử viên để phát hiện E fawcettii do tính đặc hiệu và không hình thành dimer mồi.
Bảng 3.1 Các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng RPA và RNA hướng dẫn CRISPR
(crRNA) trong phản ứng Cas12
EF ITS R2 GGGGCTTGATTGGTGAAATGACGCTCGAACAGG 33 crRNA UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAACGCACAUGCGCCC
Hình 3.2 Sàng lọc cặp mồi bằng xét nghiệm RPA.
Tên các cặp mồi được ghi ở trên cùng, với kích thước các dải thang DNA hiển thị bên phải (bp) EF ITS bao gồm các đoạn đệm phiên mã nội bộ của Elsinoë fawcettii, với các mồi xuôi (F), mồi ngược (R), mẫu có khuôn (P), mẫu không có khuôn (N), đối chứng âm tính và đánh dấu kích thước (M) Các phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 37°C trong thời gian 20 phút.
Phản ứng RPA được thiết lập theo hướng dẫn của Bộ TwistAmp Basic (TwistDX) với một số điều chỉnh Hỗn hợp phản ứng bao gồm 2 μL DNA mẫu, 1 μL mồi xuôi, 1 μL mồi ngược và 29,5 μL đệm bù nước (TwistDX), được hoàn thiện thành 47,5 μL bằng nước cất hai lần Trước khi bắt đầu phản ứng, thêm 2,5 μL magie axetat (MgOAc) Các phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 37 °C trong 20 phút.
Kỹ thuật RPA hoạt động dựa trên việc sử dụng hai mồi oligonucleotide đơn giản, có thể kèm theo một probe, để kích thích phản ứng bắt cặp Đầu tiên, enzyme recombinase liên kết với mồi, tạo thành phức hợp nucleoprotein recombinase, sau đó phức hợp này sẽ tìm kiếm trình tự tương đồng trên ADN mạch kép để hình thành cấu trúc D-loop Trong quá trình này, protein bám sợi đơn ADN (SSB) sẽ ổn định mạch bổ sung Enzyme polymerase sẽ tổng hợp sản phẩm từ vị trí mồi đến đích, liên tục tạo ra nhiều bản sao của đoạn DNA mục tiêu Năng lượng ATP và enzyme creatine kinase hỗ trợ duy trì vòng lặp tự tái tạo của RPA Khi quá trình tổng hợp DNA hoàn tất, các enzyme tái tổ hợp sẽ được tháo rời, giải phóng các đoạn DNA khuếch đại (amplicon).
Hình 3.3 Các bước cơ bản của chu trình RPA.
Recombinase, ba protein cốt lõi, SSB và polymerase thay thế sợi cho phép khuếch đại DNA mà không cần chu trình nhiệt hay bước hóa học phức tạp Quá trình này diễn ra ở một nhiệt độ duy nhất từ 25 đến 42°C, tùy thuộc vào công thức bộ dụng cụ RPA, mang lại hiệu quả cao trong việc khuếch đại DNA (Clin Chem, 2016).
3.2.2 Phát hiện CRISPR/Cas12a-LFA
Trình tự RNA (crRNA) được sử dụng để nhận diện các trình tự amplicon RPA như được chỉ ra trong Bảng 3.1 Để phát hiện dòng chảy bên trong quá trình cắt ssDNA bởi enzyme Cas12a, ssDNA được đánh dấu bằng biotin ở đầu 5’ và FAM ở đầu 3’ (5’-/6-FAM/TTATT/biotin/-3’) CrRNA và ssDNA được tổng hợp bởi Bioneer (Seoul, Hàn Quốc) Enzyme EnGen Lba Cas12a (NEW ENGLAND BioLabs, NEB, Ipswich, MA, Hoa Kỳ) được ủ ở nồng độ 1 μM với 1 μM crRNA trong 1× NEBuffer 2.1 ở 37°C trong 10 phút để tạo phức hợp ribonucleoprotein (RNP) Hỗn hợp phản ứng bao gồm 20 μL Cas12a với 1 μL Lba Cas12a (1 μM), 2 μL NEBuffer 2.1, 1 μL crRNA (1 μM), 2 μL sản phẩm RPA, 1 μL đầu dò FAM–biotin (10 μM) và 13 μL nước, được ủ ở 37°C trong 30 phút Sau đó, hỗn hợp phản ứng được trộn với 100 μL đệm thử nghiệm HybriDetect (Milenia Biotec, Giessen, Đức) trong ống 1,5 mL Một dải dòng chảy bên (Milenia Biotec) được đặt thẳng đứng trong ống ở nhiệt độ phòng và các dải xuất hiện trong vòng 2–3 phút.
Nguyên lý của xét nghiệm RPA-CRISPR/Cas12a-LFA được mô tả qua việc khuếch đại vùng duy nhất của E fawcettii bằng phản ứng RPA, sau đó sản phẩm phản ứng được đưa vào phản ứng CRISPR/Cas12a Amplicon với trình tự đặc hiệu sẽ được Cas12a nhận diện và kích hoạt, dẫn đến việc cắt trình báo cáo ssDNA gắn nhãn kép Kết quả đọc dòng bên (LFA) phụ thuộc vào sự cắt của trình báo cáo (FAM/FITC–biotin), với sự hiện diện của nhiều trình báo cáo giúp các liên hợp hạt nano vàng–kháng thể kháng FAM (Au-NP) tập trung tại vạch C (kiểm soát) Khi CRISPR/Cas12a cắt chất báo cáo, cường độ dải trên dòng T (thử nghiệm) tăng lên đáng kể trong khi giảm trên dòng C Thời gian ủ tối ưu của phản ứng CRISPR/Cas12a đã được kiểm tra với bảy điểm thời gian khác nhau.
Trong nghiên cứu, tín hiệu trên vạch T của mẫu đối chứng dương tính tăng dần trong khi tín hiệu trên vạch C mờ dần theo thời gian ủ (10, 15, 20, 25, 30 phút) Phân tích cường độ cho thấy tỷ lệ cường độ giữa dải thử nghiệm và dải đối chứng lớn hơn một sau 15 phút ủ.
Sau 25 phút, tỷ lệ này tăng gấp 30 lần so với đối chứng âm tính (không có khuôn mẫu) (Hình 3.4 A).
Phương pháp RPA-CRISPR/Cas12a-LFA cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện gDNA, với các thử nghiệm được thực hiện bằng cách pha loãng gDNA theo chuỗi mười lần từ 1 ng đến 1 ag Thời gian ủ tối ưu cho phản ứng RPA là 20 phút và cho phản ứng CRISPR/Cas12a là 25 phút, cả hai đều ở nhiệt độ 37 °C Kết quả cho thấy tín hiệu rõ rệt tại vạch T khi nồng độ DNA đạt 10⁻⁶ ng (1 fg), và khi nồng độ vượt quá 10³ ng (1 pg), tín hiệu tại vạch T mạnh hơn so với vạch âm Các thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác, với các thanh lỗi thể hiện độ lệch chuẩn.
