Nhóm 17 chẩn Đoán bệnh thực vật bằng shpt

Một số phương pháp chẩn đốn bệnh ghẻ ở cây cĩ múi Các phương pháp chẩn đốn bệnh ghẻ ở cây cĩ múi đã phát triển đáng kể nhằmnâng cao độ nhạy và hiệu quả phát hiện.. Để cải thiện độ chínhx

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO BÀI TẬP

PHÁT HIỆN NHANH CHÓNG BỆNH GHẺ TRÊN CÂY CÓ MÚI BẰNG HỆ THỐNG RPA-CRISPR/CAS12A KẾT HỢP VỚI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO BÀI TẬP

PHÁT HIỆN NHANH CHÓNG BỆNH GHẺ TRÊN CÂY CÓ MÚI BẰNG HỆ THỐNG RPA-CRISPR/CAS12A KẾT HỢP VỚI

LFA

Giảng viên hướng dẫn

PGS TS NGUYỄN BẢO QUỐC

Sinh viên thực hiện

Thủ Đức, 12/2024

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH v

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của bài tập 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu về bệnh ghẻ ở cây cĩ múi 2

2.1.1 Sơ lược về bệnh ghẻ ở cây cĩ múi 2

2.1.2 Phân loại và đặc điểm của Elsinoë fawcettii và E australis 2

2.2 Một số phương pháp chẩn đốn bệnh ghẻ ở cây cĩ múi 3

2.2.1 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt RPA 3

2.2.2 Phương pháp RPA - CRISPR/Cas12a 5

2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngồi nước 6

2.3.1 Nghiên cứu ngồi nước 6

2.3.2 Nghiên cứu trong nước 8

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

3.1 Vật liệu 9

3.2 Phương pháp nghiên cứu 9

3.2.1 Phản ứng RPA 11

3.2.2 Phát hiện CRISPR/Cas12a-LFA 13

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15

4.1 Kết quả 15

4.1.1 Sàng lọc các cặp mồi cho phản ứng RPA 15

4.2 Thiết lập phương pháp phát hiện RPA-CRISPR/Cas12a-LFA 15

4.3 Độ nhạy và đặc hiệu của phương pháp RPA-CRISPR/Cas12a-LFA 16

4.2 Thảo luận và kết quả 19

4.2.1 Thảo luận 19

4.2.2 Kết luận 21

TÀI LIỆU THAM KHẢO 22

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CRISPR/Cas : Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ associatedDAS-ELISA : Double-antibody Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent AssayDETECTR : DNA-endonuclease-targeted CRISPR trans reporter

LAMP : Loop-mediated Isothermal Amplification

PAM : Protospacer Adjacent Motif

RPA : Recombinase Polymerase Amplification

RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng RPA và RNA hướng dẫn CRISPR

Bảng 4.1 Kiểm tra tính đặc hiệu của hệ thống RPA-CRISPR/Cas12a-LFA so với phân

tích PCR thông thường với các mẫu từ đồng ruộng Nguồn: Shin và ctv (2022) 18

Bảng 4.2 So sánh giữa 2 phương pháp RPA-CRISPR/Cas12a-LFA với PCR truyền

DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình phát hiện bệnh (ghẻ) cam chanh đơn giản và nhanh chóng

Hình 3.4 Giới hạn phát hiện với RPA-CRISPR/Cas12a-LFA 14

Hình 4.1 Sàng lọc cặp mồi bằng phương pháp RPA EF ITS 15

Hình 4.2 Thời gian ủ tối ưu cho phản ứng CRISPR/Cas12a 16

Hình 4.3 Đặc hiệu của phương pháp phát hiện RPA-CRISPR/Cas12a-LFA 16

Hình 4.4 Chẩn đoán bệnh ghẻ cam trên mẫu lá (A) và mẫu quả (B) từ đồng ruộng sử

Hinh 4.5 Độ nhạy của hệ thống RPA-CRISPR/Cas12a-LFA với DNA thô chiết xuất từ

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Citrus spp (cây ăn quả có múi) thuộc họ Rutaceae, là một trong những loại cây ăn

quả quan trọng trên thế giới Người ta có rằng nó có nguồn gốc từ tiểu lục địa Ấn Độ(Sohi và Kapoor, 1990) cũng như được tìm thấy ở các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới

Citrus spp là nguồn cung cấp vitamin và khoáng chất tiềm năng (Alam và ctv, 2003) Tại

Việt Nam, Citrus spp phân bố chủ yếu ở các vùng đồng bằng và trung du với khả năng thích nghi tốt điều kiện khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới giúp Citrus spp trở thành cây phổ biến trong ngành công nghiệp cây ăn quả có múi Tuy nhiên, Citrus spp phải đối mặt

với nhiều bệnh hại như: nấm bồ hóng, bệnh ghẻ, nấm hồng, thán thư, đốm đen Trong đóbệnh ghẻ là bệnh nấm quan trọng ở cây họ Rutaceae; Chúng ảnh hưởng đến các mô noncủa cây dễ bị nhiễm bệnh, bao gồm lá, chồi và quả dẫn đến cây phát triển yếu và thậm chígây chết cây và rụng quả (Timmer và ctv, 2000) có thể gây ra tổn thất đáng kể về năngsuất và chất lượng quả Do đó, việc chẩn đoán chính xác là rất quan trọng để xác định cácbiện pháp quản lý và ngăn ngừa tổn thất về năng suất quả cũng như hiệu quả kinh tế trongtương lai Trong bài này, giới thiệu hệ thống khuếch đại polymerase Recombinase (RPA)

- CRISPR/Cas kết hợp với hệ thống đọc kết quả xét nghiệm dòng chảy bên (LFA) đểchẩn đoán bệnh ghẻ trên cây ăn quả có múi

1.2 Mục tiêu của bài tập

Tìm hiểu phương pháp chẩn đoán bệnh thực vật (RPA-CRISPR/Cas12a-LFA)nhằm đáp ứng tiêu chí chẩn đoán chính xác, đặc hiệu cao, thực hiện trong thời gian ngắn

1.3 Nội dung thực hiện

Tìm hiểu về bệnh trên cây ăn quả có múi (cam, chanh, quýt, …)

Dùng kỹ thuật sinh học phân tử RPA-CRISPR/Cas12a-LFA để chẩn đoán bệnh

So sánh kỹ thuật RPA-CRISPR/Cas12a-LFA với PCR truyền thống

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về bệnh ghẻ ở cây cĩ múi

2.1.1 Sơ lược về bệnh ghẻ ở cây cĩ múi

Bệnh ghẻ ở cây ăn quả cĩ múi (trước đây gọi là ghẻ cam chua hoặc ghẻ thường) do

nấm Elsinoë fawcettii Bitancourt và Jenkins gây ra, là một trong những bệnh nấm lá quan

trọng nhất tại nhiều khu vực sản xuất cây cĩ múi trên tồn thế giới Bệnh ghẻ ảnh hưởngđến quả, lá và cành non của nhiều giống cây cĩ múi nhạy cảm như chanh, bưởi và nhiềugiống quýt cũng như các giống lai của chúng, gây ra các vết sẹo bên ngồi và làm giảmchất lượng thương mại của quả trên thị trường trái cây tươi.Các triệu chứng điển hình củabệnh ghẻ của cây ăn quả cĩ múi là mụn mủ màu vàng nhạt với khối nút bần tại vị trínhiễm trùng Mặc dù bệnh ghẻ ở cây cĩ múi hiếm khi làm giảm năng suất, nhưng cĩ thểlàm giảm giá trị của quả lên đến 50% nếu khơng được kiểm sốt Bệnh ghẻ cam ngọt do

nấm Elsinoë australis Bitancourt và Jenkins gây ra, chỉ ảnh hưởng đến quả mà khơng ảnh hưởng đến lá của hầu hết các giống cam ngọt (C sinensis (L.) Osbeck) và một số giống quýt (C reticulata Blanco) Elsinoë australis phổ biến ở các khu vực trồng cây cĩ

múi ẩm ướt ở Argentina, Bolivia, Brazil, Ecuador, Paraguay và Uruguay, nhưng chưa

được xác nhận ở các nơi khác Việc du nhập và thiết lập E australis tại khu vực mới cĩ

thể gây ra các vấn đề về kiểm dịch đối với việc xuất khẩu trái cây tươi

2.1.2 Phân loại và đặc điểm của Elsinoë fawcettii và E australis

Cả Elsinoë fawcettii Bitancourt và Jenkins (dạng vơ tính: Sphaceloma fawcettii Jenkins), gây ra bệnh ghẻ ở cây cĩ múi, và E australis Bitancourt và Jenkins (dạng vơ tính: S australis Bitancourt và Jenkins), gây ra bệnh ghẻ cam ngọt, đều thuộc giới Fungi,

ngành Ascomycota, lớp Dothideomycetes, phân lớp Dothideomycetidae, bộMyriangiales và họ Elsinoaceae

Tác nhân gây bệnh "ghẻ Tryon" từng được mơ tả là Sphaceloma fawcettii var.

scabiosa và sau đĩ đã được xếp lại vào S fawcettii (Timmer và ctv, 1996) Giai đoạn hữu

tính (giai đoạn sinh sản hữu tính) của cả hai lồi Sphaceloma chỉ được tìm thấy ở Brazil

(Bitancourt và Jenkins, 1936a, b), và vai trị của nĩ trong việc khởi phát bệnh vẫn chưa

được hiểu rõ Elsinoë fawcettii (5 – 6 µm × 10 – 12 µm) tạo ra bào tử hữu tính

(ascospores) nhỏ hơn so với E australis (12 – 20 µm × 15 – 30 µm) Cả hai lồi đều tạo

ra các bào tử vơ tính (conidia) đơn bào, khơng màu, hình bầu dục với kích thước khoảng

3 – 4 µm × 4 – 8 µm Bào tử vơ tính cĩ thể phát triển thơng qua nảy chồi Elsinoë

fawcettii, nhưng khơng phải E australis, cũng tạo ra các bào tử vơ tính cĩ sắc tố đen và

hình thoi trên các vết ghẻ, cĩ thể nảy mầm để tạo thành bào tử vơ tính khơng màu

(Timmer và ctv, 1996; Whiteside, 1975) Elsinoë fawcettii được ghi nhận cĩ khả năng tạo

thành các sợi nấm bên trong các sợi nấm khác, gọi là sợi nấm nội tại hoặc sợi nấm bên

trong (Kim và Hyun, 2007) Trong mơi trường nuơi cấy thuần, cả E fawcettii và E.

australis đều phát triển chậm, khơng cĩ nhiều sợi nấm khơng khí và tạo ra các khuẩn lạc

thường cĩ sắc tố đỏ hoặc nâu Các khuẩn lạc và sắc tố của nấm thay đổi đáng kể giữa các

mẫu, khơng cung cấp đặc điểm đáng tin cậy để phân biệt E fawcettii và E australis.

2.2 Một số phương pháp chẩn đốn bệnh ghẻ ở cây cĩ múi

Các phương pháp chẩn đốn bệnh ghẻ ở cây cĩ múi đã phát triển đáng kể nhằmnâng cao độ nhạy và hiệu quả phát hiện Một trong những phương pháp sớm nhất là xétnghiệm miễn dịch liên kết enzyme DAS-ELISA, cho phép phát hiện nhanh virus qua tínhiệu màu, tuy nhiên chi phí cao và độ nhạy thấp khi virus ở nồng độ thấp hoặc trong giaiđoạn ngủ đơng của củ (Kumar và ctv, 2019; Onozuka và ctv, 2020) Để cải thiện độ chínhxác, phương pháp RT-PCR đã được phát triển, sử dụng kỹ thuật phiên mã ngược đểkhuếch đại RNA của virus, mang lại kết quả nhạy cảm hơn qRT-PCR, một biến thể củaRT-PCR, cịn cung cấp khả năng định lượng virus, tuy nhiên yêu cầu thiết bị phức tạp vàđắt tiền IC-RT-PCR kết hợp kháng thể miễn dịch với RT-PCR, gia tăng độ nhạy nhưngcũng làm tăng độ phức tạp của quy trình Một giải pháp đơn giản hơn là RT-LAMP cĩ thểthực hiện phát hiện PLRV bằng hình ảnh (dựa trên thuốc nhuộm) trong các lá và củ bịnhiễm, một phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt với tốc độ nhanh và khơng cần máy mĩcđắt tiền, phù hợp cho các điều kiện thực địa (Halabi và ctv, 2022; Kumar và ctv, 2020)

2.2.1 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt RPA

Khuếch đại đẳng nhiệt (RPA - Recombinase Polymerase Amplification), RPA đượcgiới thiệu lần đầu tiên vào năm 2006 Đây là phương pháp khuếch đại đằng nhiệt ở nhiệt

độ thấp từ 37 – 42°C và trong thời gian ngắn 5 – 20 phút nên cĩ tính ứng dụng cao chochẩn đốn bệnh ở thực địa RPA cĩ thể sử dụng cho chẩn đốn bệnh và phát hiện đa hìnhnucleotide đơn ở ung thư của người và sinh vật biến đổi gen Ngồi ra, RPA cũng cĩ thểđược ứng dụng trong kiểm tra vi sinh trong mẫu nước, thực phẩm và trong lĩnh vực trồng

trọt, chăn nuôi Sự khuếch đại trong phản ứng RPA được thực hiện nhờ vào sự kết hợpđặc hiệu của các enzyme và protein (recombinase, SSB protein và DNA polymerase thaythế sợi), giúp các primer gắn đặc hiệu vào gen đích và tổng hợp sợi mới Đầu tiên,recombinase sẽ gắn lên sợi DNA mạch đơn (môi) hình thành phức hợp nucleoprotein.Sau đó, sợi nucleoprotein sẽ tiến hành quét sợi DNA mạch đôi để tìm kiếm vị trí tươngđồng Nếu có vị trí tương đồng giữa sợi nucleoprotein và một mạch DNA sẽ hình thànhnên cấu trúc D-loop Mạch DNA còn lại sẽ được ổn định bởi SSB Sau đó, recombinase

sẽ được tháo gỡ ra và sự sao chép được thực hiện bởi một DNA polymerase có hoạt tínhstrand-displacement cần thiết để kéo dài mồi (Daher và ctv, 2016)

Đề kháng với chất ức chế

Nhiều phòng thí nghiệmNhiều kit thương mại vàứng dụng rộng rãi

Công nghệ toàn diệnThuốc thử khá rẻ

Lý tưởng cho mục đích địnhlượng

Nhược điểm Chi phí thuốc thứ cao

Có một vài kít thương mại, nhưngkhông thuận lợi cho pháthiện quy

mô lớnPhần mềm thiết kế mồi không

Cần thiết bị đất tiềnHoạt động này có tínhchuyên môn cao và yêu cầuđào tạo vận hành đặc biệt

đặc hiệuKhông sử dụng cho lâm sàng chỉdùng cho nghiên cứu khoa học

Có xu hướng khuếch đại khôngđặc hiệu

Tỷ lệ phân tách định lượng kém

(Tran và ctv, 2022)

2.2.2 Phương pháp RPA - CRISPR/Cas12a

Các phương pháp chẩn đoán mới dựa trên hệ thống CRISPR (clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats) kết hợp với protein Cas (associated) đã mang lạimột hướng tiếp cận đầy hứa hẹn cho việc phát hiện nhanh chóng và chính xác Kỹ thuậtDETECTR (DNA-endonuclease-targeted CRISPR trans reporter) đã được sử dụng để hỗtrợ phát hiện axit nucleic thông qua Cas12a Cas12a là một enzyme cắt DNA đượchướng dẫn bởi RNA, có khả năng cắt DNA mạch kép chứa một motif liền kề giàu T(PAM) Sau khi cắt, Cas12a sẽ tiếp tục cắt các DNA sợi đơn (ssDNA), còn được gọi làDNA báo hiệu (reporter DNA), một cách không đặc hiệu Khi kết hợp với kỹ thuậtkhuếch đại đẳng nhiệt (RPA-Recombinase Polymerase Amplification), DETECTR đãđược sử dụng thành công để phát hiện nhanh chóng và chính xác nhiều loại mầm bệnhkhác nhau (Gootenberg và ctv, 2017; Chen và ctv, 2018; Harrington và ctv, 2018)

Ngoài ra, kết quả của hệ thống RPA-CRISPR/Cas12a có thể dễ dàng được quansát thông qua các thiết bị thử nghiệm dòng chảy bên (LFA), mà không cần sử dụng đếncác thiết bị phát hiện huỳnh quang, điện di, hay nguồn bức xạ tia cực tím LFA là mộtthiết bị phát hiện nổi lên với khả năng cho kết quả có thể quan sát trực tiếp bằng mắtthường để phát hiện các sản phẩm DNA đã được khuếch đại Trong phương pháp LFA cổđiển, DNA được khuếch đại với một đầu được gắn nhãn Fluorescein phosphoramidite(FAM) hoặc Fluorescein isothiocyanate (FITC) và đầu kia gắn biotin, được bắt giữ bởiprotein liên kết với biotin (streptavidin) ở dòng dưới cùng, gần với miếng đệm mẫu Sau

đó, FAM/FITC sẽ được nhận biết và gắn kết bởi các kháng thể gắn với các hạt nano vàng(Au-NP) nhắm đến FAM/FITC Kết quả là dòng dưới cùng tạo ra tín hiệu màu (Sajid vàctv, 2015; Poulton và Webster, 2018) Trong hệ thống phát hiện dựa trên CRISPR/Cas,DNA sợi đơn được gắn nhãn kép (ssDNA) được sử dụng làm báo hiệu và một lượng báohiệu được xác định sẽ được sử dụng trong LFA Khi không có mẫu DNA đích, các báo

hiệu không bị cắt sẽ được bắt giữ, và phần lớn hạt nano vàng sẽ bị giữ lại ở dòng dướicùng, tạo ra tín hiệu yếu ở dòng trên cùng, biểu thị kết quả âm tính Khi có sự hiện diệncủa mẫu DNA đích, các báo hiệu sẽ bị cắt và các nhãn sẽ được tách rời nhau nhờ enzymeCas đã được kích hoạt Do đó, ít hạt nano vàng di động hơn sẽ được giữ lại ở dòng dướicùng Cường độ màu ở dòng dưới giảm và cường độ màu ở dòng trên tăng lên, biểu thịkết quả dương tính (Zhang và ctv, 2021; Broughton và ctv, 2020).

2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

2.3.1 Nghiên cứu ngoài nước

Nghiên cứu được thực hiện bởi Rashid Aman và các cộng sự, công bố vào năm

2020, nhằm phát triển một phương pháp phát hiện nhanh chóng và nhạy cảm các virus

RNA gây bệnh ở thực vật, đặc biệt là Potato virus X (PVX), Potato virus Y (PVY) và

Tobacco mosaic virus (TMV) Các mẫu virus được phân lập từ cây Nicotiana benthamiana, sử dụng phương pháp chiết xuất RNA tổng hợp Nghiên cứu áp dụng

phương pháp khuếch đại nucleic acid isothermal, cụ thể là RT-RPA kết hợp với hệ thốngCRISPR/Cas12a để phát hiện virus Các primer được thiết kế cho từng virus, với chutrình nhiệt khuyến cáo là 42°C trong 20 phút Kết quả cho thấy phương pháp này có độđặc hiệu cao, có khả năng phát hiện virus trong điều kiện nhiễm chéo, và độ tin cậy caovới khả năng phát hiện RNA virus ở nồng độ femtomolar

Nghiên cứu được thực hiện bởi Alon và các cộng sự vào năm 2021, nhằm pháthiện phân biệt virus Tobamovirus, cụ thể là virus nâu gân quả cà chua (ToBRFV) vàvirus mosaic cà chua (ToMV), gây hại cho cây cà chua (Solanum lycopersicum) Phươngpháp phân lập virus được thực hiện thông qua việc nhiễm virus vào cây cà chua giốngMoneymaker, sau đó thu thập mẫu lá và chiết xuất RNA tổng hợp Nghiên cứu sử dụngphương pháp RT-PCR với các primer F-1381 và R-3208 để khuếch đại vùng ORF1 củavirus Chu trình nhiệt khuyến cáo cho RT-PCR là 25°C trong 16 giờ cho quá trình nuôicấy và 37°C cho các bước khuếch đại Độ đặc hiệu của phương pháp CRISPR/Cas12acho thấy khả năng phát hiện ToBRFV và ToMV với độ nhạy từ 15 – 30 ng sản phẩm RT-PCR, cho phép phát hiện virus ngay cả trong mẫu hỗn hợp

Vào năm 2021, Mahas và các cộng sự phát triển một phương pháp chẩn đoánnhanh và nhạy cảm cho các virus DNA thực vật, cụ thể là virus cuốn lá vàng cà chua

(TYLCV) và virus cuốn lá cà chua New Delhi (ToLCNDV) Các virus này gây ra thiệthại nghiêm trọng cho cây cà chua, một loại cây trồng quan trọng Phương pháp được sửdụng là kết hợp giữa khuếch đại isothermal bằng LAMP (Loop-Mediated IsothermalAmplification) và hệ thống CRISPR-Cas12a để phát hiện các trình tự DNA virus Cácprimer được thiết kế dựa trên các vùng bảo tồn trong gen protein vỏ của TYLCV vàToLCNDV Chu trình nhiệt khuyến cáo cho LAMP là 65°C trong khoảng 40 – 45 phút,tiếp theo là phát hiện bằng Cas12a ở 37°C trong 25 – 30 phút Nghiên cứu cho thấyphương pháp này có độ đặc hiệu cao, không xảy ra phản ứng chéo với các virusgeminivirus khác, và độ tin cậy cao trong việc phát hiện các trình tự virus với nồng độthấp, cho phép phát hiện nhanh chóng trong vòng khoảng 1 giờ.

Phương pháp chẩn đoán virus beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) gây bệnh rhizomania trên cây củ cải đường (Beta vulgaris) được thực hiện bởi Ramachandran và

cộng sự vào năm 2021 Phương pháp phân lập virus được thực hiện từ mẫu đất nhiễmbệnh thu thập từ các khu vực sản xuất củ cải đường ở Bắc Dakota và Minnesota Nghiêncứu sử dụng phương pháp khuếch đại polymerase đảo ngược (RT-RPA) kết hợp với hệthống CRISPR-Cas12a để phát hiện BNYVV Các primer được sử dụng bao gồm VR-1

và VR-2, thiết kế để khuếch đại một đoạn 465 bp của RNA-1 của BNYVV Chu trìnhnhiệt khuyến cáo cho phản ứng RT-RPA là 42°C trong 60 phút Kết quả cho thấy phươngpháp này có độ đặc hiệu cao, với khả năng phát hiện BNYVV ở nồng độ thấp tới 0,1 pM,cho thấy độ tin cậy và tính nhạy cao trong việc phát hiện virus trong mẫu rễ củ cải đường

bị nhiễm bệnh so với mẫu rễ khỏe mạnh

Nghiên cứu được thực hiện bởi Matthew S Wheatley, Yong-Ping Duan và YinongYang, công bố vào năm 2021, nhằm phát triển phương pháp phát hiện nhanh và nhạycảm đối với tác nhân gây bệnh Huanglongbing (HLB), cụ thể là “CandidatusLiberibacter asiaticus” (CLas) Bệnh HLB là một trong những bệnh nghiêm trọng nhấtđối với cây cam quýt, gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngành nông nghiệp Nghiên cứu đã sửdụng phương pháp DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter (DETECTR) kếthợp với khuếch đại isothermal để phát hiện nucleic acid của CLas từ các mẫu cây bịnhiễm Các primer được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm nrdB RPA F1 và nrdB RPAR3, nhắm vào gen nrdB có năm bản sao trong genome của CLas Chu trình nhiệt khuyếncáo cho phản ứng khuếch đại là 37°C trong 10 phút cho RPA, tiếp theo là 37°C trong 1

giờ cho phát hiện bằng Cas12a Độ nhạy của phương pháp DETECTR đạt đến mứcattomolar, cho phép phát hiện CLas với độ đặc hiệu cao và độ tin cậy tốt, vượt trội hơn sovới các phương pháp truyền thống như qPCR.

2.3.2 Nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu gần đây đã áp dụng kỹ thuật khuếch đại polymerase tái tổ hợp (RPA)

để phát hiện virus gây bệnh trên cây trồng, với các kết quả đáng chú ý được công bố vàonăm 2018 Cụ thể, nghiên cứu đã tập trung vào việc xác định các virus như Tomatoyellow leaf curl virus và Banana bunchy top virus trên các ký chủ như cà chua và chuối.Phương pháp phân lập sử dụng mẫu lá được xử lý với hóa chất thông dụng như NaOH vàGEB Kỹ thuật RPA cho phép phát hiện virus mà không cần tách chiết ADN phức tạp, vớithời gian phản ứng chỉ từ 5 đến 20 phút ở nhiệt độ đẳng nhiệt 37 – 42°C Các primer đượcthiết kế đơn giản cho phép khuếch đại ADN mục tiêu với độ nhạy cao, có thể phát hiệnđược bản copy mẫu ADN mục tiêu Độ đặc hiệu và độ tin cậy của phương pháp này đượcđánh giá cao, với khả năng phát hiện virus trong mẫu có chứa nhiều vật chất di truyềnkhác Kết quả cho thấy RPA là một công cụ tiềm năng trong chẩn đoán bệnh hại cây trồnggiúp cải thiện hiệu quả quản lý dịch bệnh trong nông nghiệp