Nhóm 18 chẩn Đoán bệnh thực vật bằng phương pháp sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP ILLUMINA SEQUENCING TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH NẤM HỒNG TRÊN CÂY SẦU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO

GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP ILLUMINA SEQUENCING TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH NẤM HỒNG TRÊN

CÂY SẦU RIÊNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO

GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP ILLUMINA SEQUENCING TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH NẤM HỒNG TRÊN

CÂY SẦU RIÊNG

LÊ THANH ÁI – 20126178 NGUYỄN MINH KHÔI – 20126271 DIỆP HOÀNG QUÂN – 21126478

TP Thủ Đức, 12/2024

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2

2.1 Sơ lược về cây sầu riêng 2

2.1.1 Phân bố và đặc điểm hình thái 2

2.1.2 Tình hình sản xuất và thương mại 2

2.2 Khái quát về bệnh nấm hồng 3

2.2.1 Sơ lược về nấm Erythricium salmonicolor 4

2.2.2 Giải pháp phòng trừ bệnh hại 4

2.3 Công nghệ giải trình tự Illumina 4

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 6

3.1 Vật liệu 6

3.2 Phương pháp 6

3.2.1 Ly trích DNA tổng số 6

3.2.2 Giải trình tự DNA bằng Illumina sequencing 6

TÀI LIỆU THAM KHẢO 8

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Sầu riêng là tên gọi các loài cây thuộc chi Durio, là loài thực vật nhiệt đới, có nguồn gốc từ khu vực Đông Nam Á Sầu riêng được biết đến như một loại trái cây đặc sản được nhiều người ưa chuộng không chỉ đơn thuần là hương vị thơm ngon và giàu chất dinh dưỡng của sầu riêng mà còn có giá trị kinh tế cao Tại Việt Nam, sầu riêng được thu hoạch quanh năm và đã trở thành sản phẩm xuất khẩu thế mạnh của ngành nông nghiệp Tuy nhiên, ngành sản xuất sầu riêng đang phải đối mặt với những thách thức nghiêm

trọng, đặc biệt là bệnh nấm hồng do nấm Erythricium salmonicolor gây ra Erythricium

salmonicolor là loại nấm gây nên bệnh nấm hồng ở các loại cây thân gỗ khác như điều,

cao su, xoài, … Nấm hồng sầu riêng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cây trồng dẫn đến năng suất và chất lượng quả giảm Với các loại cây trồng thu hoạch phần quả trên cành thì nấm hồng phá hủy gần như toàn bộ năng suất, sản lượng của cây bị nhiễm bệnh Bệnh nấm hồng rất khó bị phát hiện trong giai đoạn đầu của bệnh khá giống với bệnh thán thư – do một loại nấm khác gây nê Để có thể chẩn đoán chính xác và sử dụng đúng thuốc cho bệnh cần sử dụng đến các phương pháp chẩn đoán bằng sinh học phân tử

Và phương pháp được chọn là phương pháp giải trình tự Illumina của mẫu tơ trắng trên thân cây sầu riêng

1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN

2.1 Sơ lược về cây sầu riêng

Sầu riêng có tên khoa học là Durio zibethinus, thuộc giới Plantae, bộ Malvales, họ

Malvaceae, chi Durio Sầu riêng là loài trái cây phổ biến và được ưa chuộng tại các quốc gia Đông Nam Á Đặc trưng với mùi thơm nồng và ngọt, thịt quả khá dày và ngọt cùng với giá thành khá cao, sầu riêng còn được mệnh danh là “Vua của các loại trái cây”

2.1.1 Phân bố và đặc điểm hình thái

Sầu riêng là loài cây bản địa tại khu vực Đông Nam Á Phân bố chủ yếu từ bán đảo Malaysia, Indonesia và đảo Borneo Ở Việt Nam, cây sầu riêng được trồng chủ yếu ở Đông Nam bộ, Tây Nguyên và Đồng bằng Sông Cửu long, nhiều nhất là các tỉnh Tiền Giang, Bến Tre, Lâm Đồng Quả sầu riêng khá lớn, có dáng thuôn dài với đường kính quả khoảng 13 – 16 cm, dài 15 – 25 cm Quả nặng khoảng 3 kg, vỏ quả có màu vàng đến

ô liu trên bề mặt có nhiều gai nhọn hình chóp rộng, cứng và sắc Ruột quả chia thành các ngăn với mỗi ngăn có từ 3 – 5 hạt, màng ngoài hạt là phần ăn được có màu vàng Lá sầu riêng có hình elip với chóp nhọn như mũi mác, rộng từ 4 – 6 cm và dài 10 – 20 cm Hoa mọc thành cụm từ 3 – 50 hoa, cuống hoa dài khoảng 15 cm Cánh hoa dài hơn đài hoa, có

5 cánh hoa màu trắng đến vàng nhạt hoặc kem

2.1.2 Tình hình sản xuất và thương mại

Cây sầu riêng được du nhập từ Malaysia vào khu vực Nam Thái Lan vào năm 1687 Hiện nay, Thái Lan là quốc gia dẫn đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu sầu riêng, chiếm hơn 95% tổng sản lượng toàn cầu, trong khi Malaysia đứng thứ hai với 4%, và các quốc gia khác chiếm khoảng 1% Riêng sầu riêng Monthong, Thái Lan xuất khẩu khoảng 93,81% sản lượng toàn cầu, với giá trị xuất khẩu tăng trung bình 12,32% mỗi năm Giai đoạn 2006–2015, Thái Lan xuất khẩu trung bình 294.479 tấn sầu riêng mỗi năm, đạt giá trị khoảng 212 triệu USD, chiếm 41,21% tổng giá trị xuất khẩu trái cây của nước này Năm 2019, Thái Lan thống kê có 150.000 ha đất nông nghiệp trồng sầu riêng, đạt tổng sản lượng 1.017.097 tấn Trong đó, 270.441 tấn phục vụ tiêu thụ nội địa, 653.564 tấn được xuất khẩu, mang lại giá trị 1.361,1 triệu USD

Tại Việt Nam, diện tích, năng suất và sản lượng sầu riêng đã tăng trưởng mạnh trong những năm qua, chiếm khoảng 6,2% tổng diện tích cây ăn quả trên cả nước Năm

2010, diện tích trồng sầu riêng đạt 17.600 ha, sản lượng 107.500 tấn Đến năm 2015, diện tích tăng lên 31.900 ha với sản lượng 366.300 tấn Đặc biệt, năm 2020, diện tích trồng sầu riêng đạt 70.000 ha và sản lượng đạt 559.019 tấn

2.2 Khái quát về bệnh nấm hồng

Nguyên nhân chính gây bệnh nấm hồng trên cây sầu riêng là nấm Erythricium salmonicolor Đây cũng là tác nhân gây bệnh nấm hồng trên nhiều loại cây thân gỗ khác như điều, cao su, và xoài Nếu không được phát hiện và xử lý kịp thời, bệnh nấm hồng có thể gây tổn hại nghiêm trọng đến sức khỏe cây, làm giảm năng suất thu hoạch và gây thiệt hại kinh tế lớn

Bệnh nấm hồng thường phát triển mạnh trong điều kiện độ ẩm cao, thời tiết có sương mù dày đặc, mưa kéo dài, và gió lớn Ở những vườn có mật độ cây trồng quá dày, không gian thiếu ánh sáng sẽ càng tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh phát sinh

Triệu chứng ban đầu thường xuất hiện trên lá trưởng thành, thân và cành non của cây Các cành non bị nhiễm bệnh thường khô héo và chết Khi cây bắt đầu mắc bệnh, trên

vỏ cây sẽ xuất hiện lớp tơ mỏng màu trắng đục, sau đó chuyển sang màu nâu đỏ hoặc cam hồng, lan rộng quanh vỏ cây Đây là giai đoạn nấm hình thành bào tử để lây lan sang các cây khác Nấm bệnh phá hủy lớp vỏ, làm gián đoạn quá trình vận chuyển nước và dinh dưỡng lên các cành phía trên

Khi bệnh nặng, toàn bộ lá trên cành bị úa vàng, rụng xuống, trái rụng non, và cuối cùng cành sẽ chết khô Nấm bệnh lây lan chủ yếu qua nước mưa, nước tưới tiêu, gió, hoặc thông qua côn trùng Bệnh thường tấn công cây vào giai đoạn trước và sau khi thu hoạch, khi cây đang suy yếu và dễ bị tổn thương

2.2.1 Sơ lược về nấm Erythricium salmonicolor

Erythricium salmonicolor thuộc giới Fungi, ngành Basidiomycota, lớp

Agaricomycetes, bộ Corticiales, họ Corticiaceae, chi Erythricium Nấm Erythricium

3

salmonicolor được mô tả bởi Berk và Broome, báo cáo lần đầu tiên được ghi nhận tại

Ghana bởi Wharton (1962) Trên môi trường chọn lọc, các khuẩn lạc từ dạng tăng trưởng dạng mạng nhện ban đầu xuất hiện với màu trắng bông như bông gòn, có sợi nấm dạng chỉ ở rìa phát triển, nhưng chuyển thành màu kem theo thời gian Ngược lại, các khuẩn lạc từ các nốt màu hồng ban đầu có màu hồng nhưng chuyển sang màu kem sau một tuần Không có mẫu nào từ các giai đoạn phát triển khác nhau tạo bào tử trong môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, khi quan sát dưới kính hiển vi các cành bị nhiễm bệnh tự nhiên, các nốt bệnh cho thấy sự hình thành các sợi nấm trong suốt, không vách ngăn, và các khối bào tử trong suốt, hình elip, không vách ngăn, có kích thước 10-24 μm × 8-12 μm

2.2.2 Giải pháp phòng trừ bệnh hại

Để phòng trừ bệnh, cần áp dụng một số biện pháp sau: Trồng cây với mật độ phù hợp, thường xuyên cắt tỉa cành nhánh và tạo tán thông thoáng trong vườn, đảm bảo cây nhận đủ ánh sáng để quang hợp, đồng thời giảm độ ẩm – điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm bệnh Các cành bị bệnh hoặc cành chết cần được xử lý và tiêu hủy kịp thời

để ngăn ngừa lây lan

Việc chăm sóc cây tốt, bao gồm tưới nước và bón phân đầy đủ, giúp tăng cường sức

đề kháng, hỗ trợ cây chống lại bệnh hại Khi phát hiện dấu hiệu bệnh, cần sử dụng các loại thuốc đặc trị chứa hoạt chất gốc đồng như Triazole (Hexaconazole, Difenoconazole), hoặc gốc sinh học (Validamycin A) Ngoài ra, các chế phẩm sinh học dạng enzyme cũng có thể được sử dụng để ức chế và tiêu diệt nấm gây bệnh

Kết hợp với việc cung cấp dinh dưỡng hợp lý, đặc biệt là phân hữu cơ vi sinh, sẽ hỗ trợ cây sinh trưởng và phát triển khỏe mạnh, đủ sức chống lại mầm bệnh hiệu quả

2.3 Công nghệ giải trình tự Illumina

Phương pháp giải trình tự Illumina là một công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS) được sử dụng rộng rãi nhờ vào độ chính xác cao, thông lượng lớn và chi phí hợp lý Quá trình giải trình tự bắt đầu với việc chuẩn bị thư viện DNA, trong đó các đoạn DNA được cắt nhỏ và gắn thêm đoạn adaptor để hỗ trợ gắn kết với bề mặt flow cell Tiếp theo, các đoạn DNA được cố định lên flow cell và khuếch đại tạo thành các cụm DNA (clusters) Quá trình giải trình tự diễn ra qua phương pháp tổng hợp, trong đó nucleotide được đánh dấu bằng huỳnh quang được bổ sung vào các sợi

DNA, và tín hiệu huỳnh quang phát ra khi nucleotide gắn vào được ghi lại để xác định trình tự Dữ liệu thu được sẽ được phân tích và căn chỉnh để xác định trình tự hoàn chỉnh Công nghệ Illumina có nhiều ưu điểm như độ chính xác cao, khả năng giải trình tự hàng

tỷ đoạn DNA trong một lần chạy, và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như giải trình

tự toàn bộ bộ gen, RNA-seq, metagenomics, và nghiên cứu bệnh học Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số nhược điểm như độ dài đoạn đọc ngắn và yêu cầu chuẩn bị mẫu phức tạp Mặc dù vậy, công nghệ Illumina vẫn là một công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu sinh học phân tử và y học, đặc biệt là trong các ứng dụng nghiên cứu gen và phát hiện đột biến

5

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu

Mẫu tơ màu trắng trên vỏ cây sầu riêng nghi ngờ là nấm Erythricium salmonicolor

gây bệnh nấm hồng

3.2 Phương pháp

3.2.1 Ly trích DNA tổng số

Tiến hành nghiền một lượng mẫu vừa đủ trong tube 1,5 mL cùng với 400 µL dung dịch đồng nhất mẫu Tris – EDTA – NaCl – SDS Bổ sung vào tube 500 µL PCI (Phenol

: Chloroform :Isoamyl alcohol) với tỉ lệ thể tích 25 : 24 : 1, lắc nhẹ và ly tâm 10000 rpm trong 5 phút, thu dịch nổi vào tube mới Sau đó, bổ sung thêm 400 µL Chloroform vào, lắc nhẹ và ly tâm 10.000 rpm trong 5 phút, thu dịch nổi vào tube mới Tiếp theo tiến hành thêm 600 µL Ethanol 99% vào tube, lắc nhẹ rồi ủ ở - 20 °C trong 30 phút, sau đó ly tâm

12000 rpm trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi, thu phần tủa, phơi tube ở nhiệt độ phòng Cuối cùng, làm sạch DNA bằng Ethanol 70%, rửa 2 lần, sau đó thêm vào tube 50 µL dung dịch

TE 0,5X (Tris – EDTA), vortex nhẹ và bảo quản ở 4 °C

3.2.2 Giải trình tự DNA bằng Illumina sequencing

Tiến hành cho DNA tổng số đã ly trích được vào hệ thống Illumina MiSeqTM để giải trình tự Đầu tiên DNA sẽ được cắt thành những đoạn DNA ngắn hơn Các oligonucleotide (adapter) được nối vào 2 đầu của các đoạn DNA đã cắt bằng ligase Máy

sẽ tăng nhiệt độ lên 95 °C để biến tính tách các đoạn DNA sợi đôi thành các DNA sợi đơn Các sợi DNA đơn này sau đó được đưa đến các bề mặt các ô của chip giải trình tự (flowcell) đã được gắn sẵn các oligonucleotide có trình tự bổ sung với adapter của DNA

để làm khuôn Sợi DNA bổ sung sẽ được tổng hợp nhờ enzyme Taq polymerase ở 72 °C, sau đó bị biến tính ở 95 °C Máy sẽ rửa loại bỏ các DNA khuôn và giữ lại các DNA bổ sung vừa tổng hợp do có một đầu được cố định trên bề mặt flowcell và đầu còn lại ở trạng thái tự do Các DNA này sau đó dùng đầu tự do để bắt cặp với các oligonucleotide tự do khác trên bề mặt flowcell tạo thành dạng cầu nối Mạch DNA bổ sung tiếp tục được tổng hợp bằng enzyme Taq polymerase ở 72 °C tạo thành cầu nối DNA mạch đôi Cầu nối

mạch đôi bị biến tính ở 95 °C, tạo thành hai mạch đơn gắn vào bề mặt flowcell Quá trình khuếch đại cầu nối lặp lại và nhiều bản sao của cầu nối mạch đôi được hình thành Máy

sẽ rửa loại bỏ các DNA mạch ngược bằng hóa chất và giữ lại các DNA mạch xuôi Tiếp theo các primer đã được thiết kế có trình tự bổ sung bắt cặp với trình tự adapter tại đầu tự

do tạo vị trí bám cho enzyme Taq polymerase để tổng hợp mạch DNA bổ sung sử dụng các ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP) đã gắn nhãn huỳnh quang, mỗi ddNTP có một màu huỳnh quang khác nhau Khi một ddNTP được bổ sung vào sợi khuôn thì phản ứng dừng lại và máy ghi nhận tín hiệu huỳnh quang, sau đó máy bơm hóa chất vào rửa nhãn huỳnh quang, đồng thời phục hồi gốc hydroxyl (- OH) tại đầu 3’ để ddNTP tiếp theo đến hình thành liên kết phosphodiester Quá trình lặp lại nhiều lần đến khi sợi DNA được tổng hợp hoàn toàn Tiếp theo sẽ phân tích dữ liệu giải được bằng các công cụ tin sinh học Thực hiện phân tích chiều dài trình tự, nối đoạn thành những trình tự có ý nghĩa và loại bỏ những phần bị trùng lặp Sản phẩm giải trình tự hoàn chỉnh sẽ được đưa lên NCBI

để so sánh trình tự với tất cả các loài trên cơ sở dữ liệu hiện có thông qua chức năng Nucleotide BLAST Kết quả BLAST sẽ hiển thị một danh sách các loài có độ tương đồng cao với mẫu, cần quan tâm loài có độ tương đồng cao nhất để kết luận tác nhân gây bệnh, nếu có nhiều loài cùng độ tương đồng thì tiến hành phân tích cây phát sinh loài

7

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Akrofi, A Y., Amoako-Atta, I., Assuah, M., & Kumi-Asare, E (2014) Pink disease caused by Erythricium salmonicolor (Berk & Broome) Burdsall: an epidemiological assessment of its potential effect on cocoa production in Ghana Journal of Plant Pathology & Microbiology, 5(1), 1

2 Ketsa, S (2018) Durian—Durio zibethinus In Exotic Fruits (pp 169-180) Academic Press

3 Hoàng, M C., Trần, V P., Lâm, M V., Hoàng, T S., Huỳnh, T T T., Đặng, T T T., Bùi, T P L., & Trần, T T (n.d.) Tổng quan tình hình sản xuất và tiêu thụ sản phẩm sầu riêng ở Việt Nam và một số nước trong khu vực Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên (WASI)