Nhóm 8 th chẩn Đoán bệnh thực vật bằng shpt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ TP... BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

TP Thủ Đức, 12/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

Giảng viên hướng dẫn

PSG TS NGUYỄN BẢO QUỐC

Sinh viên thực hiện

Dương Tuấn Kiệt 21126379 DH21SHB

Lê Thị Ngọc Loan 21126394 DH21SHA

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

LỜI CẢM ƠN iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH v

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Các bệnh hại chính trên cây mít 1 1.1.1 Tổng quan về bệnh đen xơ mít 1 1.1.2 Vi khuẩn Pantoea stewartii 2 1.2 Kỹ thuật PCR 3 1.3 Kỹ thuật điện di 3 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 5

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 5 2.2 Vật liệu nghiên cứu 5 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 5 2.2.2 Các primer dùng trong nghiên cứu 5 2.2.3 Hóa chất 5 2.3 Phương pháp nghiên cứu 5 2.3.1 Tách chiết DNA 5 2.3.2 Điện di sản phẩm tách chiết DNA tổng số 6 2.3.3 Phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA 7 2.3.4 Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen với cặp primer tự thiết kế đặc hiệu 7 2.3.5 Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen với cặp primer tham khảo trên báo 8 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 9

3.1.1 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA 9

3.1.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR cặp primer tự thiết kế đặc hiệu 10 3.1.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR cặp primer tham khảo trên báo 10

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 12

TÀI LIỆU THAM KHẢO 13

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, nhóm em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Khoa học sinh học đã tạo điều kiện cho chúng em được tham gia và hoàn thành báo cáo thực hành này

Đặc biệt, nhóm em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Bảo Quốc, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và cung cấp những kiến thức quý báu cũng như các tài liệu cần thiết trong suốt quá trình thực hiện báo cáo Sự giúp đỡ và những góp ý quý báu của Thầy đã giúp chúng em hoàn thiện báo cáo này một cách tốt nhất

Bên cạnh đó, nhóm em cũng xin cảm ơn các Anh Chị trong lab và các bạn trong nhóm thực hành, những người đã luôn hỗ trợ, chia sẻ và cùng chúng em vượt qua những khó khăn, thách thức trong quá trình thực hiện dự án Sự hợp tác và tinh thần đồng đội của mọi người là nguồn động lực lớn giúp chúng em hoàn thành báo cáo này

Dù đã cố gắng hết sức, báo cáo của chúng em không thể tránh khỏi những thiếu sót

và hạn chế Chúng em rất mong nhận được sự đóng góp, ý kiến quý báu của Thầy và Anh Chị để chúng em có thể rút kinh nghiệm và hoàn thiện hơn trong những lần sau

Nhóm em xin chân thành cảm ơn!

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các primer dùng trong nghiên cứu 5 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA 7 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR với cặp primer tự thiết kế đặc hiệu 8

DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Vết bệnh đen xơ trên múi mít 2

Hình 1.2 Cấu trúc vi khuẩn Pantoea stewartii dưới kính hiển vi 2 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học Ethidium bromide (a) ethidium bromide, (b) quá trình chèn

vào phân tử DNA của ethidium bromide 4

Hình 2.1 Mẫu dịch khuẩn (a) sau khi loại bỏ dịch nổi, (b) Thêm CI 6 Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số (A: Mẫu điện di tổng số nhóm 8) 9 Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng gen 16S (M) Thang chuẩn DNA, Giếng

B: đối chứng âm, Giếng A: Mẫu điện di nhóm 8 9

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR (M) Thang chuẩn DNA; Giếng B: Đối chứng

âm; Giếng C: Đối chứng dương; Giếng A: Mẫu điện di nhóm 8 10

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Các bệnh hại chính trên cây mít

Bệnh nứt thân xì mủ do Phytophthora palmivora gây ra, làm thân chảy mủ, cảnh

nhánh khô, lá vàng rồi rụng, quả thối nâu Bệnh này thường hoạt động mạnh khi đất bị úng nước, pH thấp

Bệnh thối trái do Rhizopus artocarpi gây ra Bệnh chủ yếu gây hại hoa và trái mít

non, nấm làm hoa và trái bị thối đen, trên đó sinh ra các sợi nấm màu đen tua tủa Bệnh phát triển nhiều trong mùa mưa

Bệnh đốm nâu: Tác nhân là nấm Phomopsis artocarpine Triệu chứng: bệnh chủ

yếu hại lá Vết bệnh hình tròn, lúc đầu nhỏ, màu nâu, sau lớn lên đường kính 10 – 15 mm,

ở giữa màu xám tro, trên đó có những hạt nhỏ màu đen xếp thành các đường vòng đồng tâm, đó là các ổ bào tử

Bệnh nấm hồng: Tác nhân nấm Corticium salmonicolor gây ra Triệu chứng: nấm

tạo thành những mảng màu trắng hoặc hồng trên cành làm lá vàng héo, cảnh khô

1.1.1 Tổng quan về bệnh đen xơ mít

Năm 2006, Tổ chức Bảo vệ Thực vật Châu Âu (EPPO) tuyên bố rằng sự hiện diện

của Pantoea stewartii đã được báo cáo ở một số địa điểm riêng biệt của Nam và Trung

Mỹ, Châu Âu và Châu Á Các nước trồng mít nhiều ở Bangladesh, Miến Điện, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Philippines, Sri Lanka, Thái Lan, và một số khu vực ở Brazil vá Queensland, Úc Hiện nay, đen xơ mít gây hại nghiêm trọng ở Đông Nam Bộ và ĐBSCL, chủ yêu vào những tháng mùa mưa Theo khảo sát, đều có những ghi nhận về thiệt hại đáng kể do bệnh đen xơ mít làm cho trái méo mó, làm giảm chất lượng và độ ngọt trái làm thiệt hại nặng nề cho các nhà vườn dù đã sử dụng rộng rãi nhiều thuốc hóa học (Lê Trí Nhân, 2016)

Bệnh đen xơ mít đang là một vấn đề nan giải cho các nhà vườn đang phải đối măt, căn bệnh này gây ra những đốm đen li ti trên xơ mít, làm giảm chất lượng thương phẩm của mít Biểu hiện bệnh đen xơ trên mít là hình dạng trái méo mó, đầu trái nhỏ, phần xơ

có màu đen, múi bị lép, hạt không phát triển, vết đen trên xơ không có hình dạng nhất định, làm giảm chất lượng và độ ngọt, thường xuất hiện vào mùa mưa, các yếu tố khiến bệnh phát triển như thời tiết mùa mưa, độ ẩm cao, một số giống mít dễ mắc bệnh này hơn các giống khác, hoặc do kỹ thuật canh tác, thiếu canxi, tưới nước không hợp lý, vệ sinh vườn kém

1.1.2 Vi khuẩn Pantoea stewartii

Nguyên nhân gây bệnh này là do vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert, trước đây có tên Erwinia stewartii (Smith) (Gapasin và ctv, 2014) Về phân loại khoa học P stewartii được xếp vào giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Gamma Proteobacteria, thuộc bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae, chi Pantoea và loài là

Pantoea stewartii.

Vi khuẩn P stewartii là vi khuẩn hiếu khí, gram âm, hình que, không tạo bào tử Có

sắc tố màu vàng, tạo chất nhầy kích thước 0,4 – 0,8 × 0,9 – 2,2 µm tạo thành chuỗi ngắn, đơn giản.Có thể phát triển ở nhiệt độ khác nhau, từ 4°C đến 37°C Vi khuẩn tấn công trái trong quá trình thụ phấn theo hai con đường: một là xâm nhập qua vòi nhị cái và đi vào bên trong trong trái, hai là qua khe hở giữa các múi lúc trái còn non

1.2 Kỹ thuật PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) là một kỹ thuật trong công nghệ sinh học, do Kary Mullis phát minh ra vào năm 1983, đến nay đã được hoàn thiện qua nhiều cải tiến

và được tự động hoá hoàn toàn Kỹ thuật này vận dụng các kiến thức sinh học phân tử, nhằm tạo ra vô số bản sao (tức khuếch đại) từ đoạn DNA ban đầu (bản gốc) có khi rất nhỏ

Hình 1.1 Vết bệnh đen xơ trên múi

mít.

Hình 1.2 Cấu trúc vi khuẩn

Pantoea stewartii dưới kính hiển vi.

với số lượng tối thiểu mà không cần sử dụng các sinh vật sống (như E coli và nấm men

thường dùng đương thời)

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1: Biển tỉnh tách đôi sợi DNA (Denaturation): giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 – 95°C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch

Bước 2: Bắt cặp (Annealing): trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65°C Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây

Bước 3: Kéo dài (Elongation Extension): nhiệt độ được tăng lên 72°C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ

30 giây đến vài phút

1.3 Kỹ thuật điện di

Quá trình điện di sử dụng gel agarose hay polyacrylamide thường được dùng để phân tích nucleic acid dựa vào kích thước Kỹ thuật điện di có thể được sử dụng trong phân tích hay phối hợp với các kỹ thuật khác, có thể định tính và định lượng Những đoạn DNA lớn như là nhiễm sắc thể có thể được phân tách bằng kỹ thuật điện di cải biến pulsed field gel electrophoresis (PFGE), sử dụng sự thay đổi chiều di chuyển của DNA

Kỹ thuật điện di đơn giản nhất và được sử dụng rộng rãi nhất là kỹ thuật điện di theo phương ngang

Để quan sát DNA, cần phải nhuộm phân tử này Ethidium bromide (EtBr) đã từng

là chất nhuộm DNA phổ biến Phân tử EtBr chèn vào giữa các cặp base đối diện nhau trên phân tử DNA và tạo huỳnh quang cam/đỏ khi được chiếu tia UV (~ 300 nm) Các chất nhuộm thay thế khác với độ nhạy tương đương và ít nguy nguy hiểm hơn, đó là SYBRGreen, GelRed hay Gelstar

Gel agarose có thể được sử dụng để phân tách các phân tử lớn hơn khoảng 100 bp Agarose là một dạng polymer có thể được đun hòa tan, đổ khuôn và tạo thành nhiều miếng gel với kích thước khác nhau (thường là minigel có chiều dài 10 cm) Các giếng (well) được định hình bằng lược gel (comb) sau khi đổ gel vào khuôn Miếng gel được đặt ngập chìm trong dung dịch điện di và DNA được thêm vào các giếng Dòng điện đi qua bồn điện di, theo chiều dài gel làm các phân tử DNA tích điện âm di chuyển về phía cực dương Agarose gel là một ma trận gồm các lỗ và các phân tử DNA có kích thước nhỏ sẽ di chuyển qua dễ dàng hơn các phân tử DNA có kích thước lớn hơn Với yêu cầu

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 8 giờ sáng thứ 6, từ ngày 29 tháng 11 đến ngày 27 tháng 12 năm 2024 Địa điểm thực hiện: RIBE 302 – 304, phòng thí nghiệm Bệnh học và chẩn đoán phân tử, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu đối chứng dương có kết quả xét nghiệm dương tính với Pantoea stewartii do

phòng RIBE cung cấp

Mẫu dịch vi khuẩn Pantoea stewartii tăng sinh 48 giờ trong môi trường LB.

2.2.2 Các primer dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.1 Các primer dùng trong nghiên cứu

Tên primer Kích thước

(bp) Tm (°C) 63F

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học Ethidium bromide (a)

ethidium bromide, (b) quá trình chèn vào phân tử DNA của

ethidium bromide.

PanR 214

ES16

2.2.3 Hóa chất

Các hóa chất ly trích tách chiết DNA bao gồm: STE, Lysis Buffer, Chloroform Isoamyl Alcohol buffer (CI), Chloroform, Isopropanol, Ethanol 70°, Tris HCl Na2EDTA buffer (TE)

Các hóa chất chạy phản ứng PCR và điện di: Agarose, Tris Borate EDTA buffer 0,5X (TBE), GelRed, Loading Dye, Dreamtaq Green PCR Master Mix 2X, primer, DNase-free water

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tách chiết DNA

Tăng sinh khuẩn lạc trên môi trường LB ở 28°C trong 24 – 48h tiến hành ly trích thu DNA của vi khuẩn (Sambrook và Russell, 2001)

Bước 1: thu cận khuẩn, hút 1mL dịch tăng sinh vi khuẩn vào tube 1,5 mL ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nổi thu kết tủa (lặp lại 3 lần)

Bước 2: hút 400 µL dung dịch STE buffer (Sodium chloride/Tris/EDTA) vào tube

và vortex để rửa sinh khối khuẩn Sau đó dung dịch được ly tâm 10.000 vòng/ phút trong

3 phút, loại bỏ dịch nổi (lặp lại 2 lần)

Bước 3: hút 400 µL lysis buffer vào phần kết tủa thu được, vortex hỗn hợp, ủ 65°C

, trong 1 giờ

Bước 4: hút thêm 300 µL CI (chloroform/isoamyl alcohol, 24:1), đảo đều và ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút

Bước 5: hút 300 µL dịch nổi phía trên cho vào tube 1,5 mL sạch thêm 100 µL dung dịch chloroform Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 8 phút

Bước 6: thu kết tủa DNA bằng isopropanol: Hút 200 μL dịch nổi phía trên cho vào tube 1,5 mL sạch mới Thêm 100 µL isopropanol, đảo đều, ủ lạnh -20°C trong 1 giờ, sau

đó ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 13 phút

Bước 7: sau khi ly tâm và loại bỏ dịch nổi, tủa DNA được rửa bằng ethanol 70°: Loại bỏ dịch nổi, thêm 480 µL Ethanol 70°, ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút (lặp lại 2 lần), loại bỏ dịch nổi và để DNA khô tự nhiên

Bước 8: Tủa DNA hòa tan hoàn toàn trong 50 µL elution buffer, bảo quản -20°C

2.3.2 Điện di sản phẩm tách chiết DNA tổng số

Sau quá trình tách chiết, DNA tổng số sẽ được điện di bằng máy điện di để kiểm tra chất lượng sản phẩm DNA ly trích được từ dịch tăng sinh vi khuẩn Hút 1 µL Gel Red + Loading dye nhỏ 1 giọt lên miếng nilon và tiếp tục hút 4 µL mẫu DNA tổng số nhỏ vào cùng Gel Red Quá trình điện di thực hiện trên gel Agarose 1% với hiệu điện thế 100V trong 25 phút Sau quá trình điện di, gel sẽ được chuyển vào bộ phận soi gel và ghi nhận kết quả

2.3.3 Phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA

Thực hiện pha loãng nồng độ DNA, tiến hành định danh bằng kỹ thuật phân tử dựa trên việc khuếch đại trình tự vùng 16S rRNA với cặp primer 63F:5’ -CAGGCCTAACACATGCAAGTC - 3’; 1489R:5’ - TACCTTGTTACGACTTCA - 3’ bằng kỹ thuật PCR Thành phần phản ứng PCR được thể hiện trong Bảng 2.2 Thực hiện phản ứng PCR với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 95℃ trong 3 phút; tiếp theo là 35 chu kỳ biến tính ở 95℃ trong 30 giây, bắt cặp ở 52℃ trong 30 giây,kéo dài ở 72℃ trong

30 giây và kéo dài cuối cùng ở 72℃ trong 7 phút, và bảo quản ở 10℃ trong 2 phút

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA

Buffer Primer F Primer R Taq polymerase

DNA khuôn H2O

2 0,5 0,5 0,1 1 5,9

Điện di sản phần PCR 16S rRNA được nhuộm với gelred và điện di trong gel agarose 1% trong 25 phút với hiệu điện thế 100V Xem kết quả các mẫu có xuất hiện band mục tiêu với kích thước khoảng 1500bp

2.3.4 Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen với cặp primer tự thiết kế đặc hiệu

Thực hiện phản ứng PCR với cặp primer chuyên biệt cho vi khuẩn Pantoea

stewartii tự thiết kế (PanF - PanR) đã được đánh giá từ phòng thí nghiệm bệnh học và

chẩn đoán phân tử (RIBE 302 – 304), Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường thuộc Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Thành phần cho 1 phản ứng PCR được thực hiện trong Bảng 2.3 với chu trình nhiệt như sau 95℃ - 3 phút, 30 chu kỳ tiếp theo (95℃ - 30 giây; 61℃ - 30 giây; 72℃ - 30 giây) và 72℃ - 5 phút, bảo quản ở

25℃ trong 2 phút Điện di sản phần PCR được nhuộm với gelred và điện di trong gel agarose 1% trong 25 phút với hiệu điện thế 100V Xem kết quả các mẫu có xuất hiện band mục tiêu với kích thước khoảng 214bp

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR với cặp primer tự thiết kế đặc hiệu

Buffer Primer PanF Primer PanR Taq polymerase

DNA khuôn H2O

2 0,5 0,5 0,1 1,5 5,4

2.3.5 Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen với cặp primer tham khảo trên báo

Thực hiện phản ứng PCR với cặp primer được tham khảo của Coplin và cộng sự (2002): ES16 (GCGAACTTGGCAGAGAT, 993 nt trong 16S rRNA); ESIG2c (GCGCTTGCGTGT-TATGAG, 361 nt là sợi bổ sung của vùng ITS), so sánh tính đặc hiệu với cặp primer PanF - PanR Thành phần cho 1 phản ứng PCR được thực hiện như Bảng 2.2 với chu trình nhiệt: 95℃ - 3 phút, 35 chu kỳ tiếp theo (95℃ - 30 giây; 53℃ - 3

0 giây; 72℃ - 30 giây) và 72℃ - 7 phút, bảo quản ở 10℃ trong 2 phút Điện di sản phần PCR được nhuộm với gelred và điện di trong gel agarose 1% trong 25 phút với hiệu điện thế 100V Xem kết quả các mẫu có xuất hiện band mục tiêu với kích thước khoảng 920bp

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN