Thuc hanh chan doan benh shpt

Cloning and sequencing of RDA resultMỗi chuỗi có dư 1 thymidine T tại đầu 3’ Dùng clone sản phẩm PCR của những Taq polymerase thiếu hoạt tính 3’ exonuclease.. Cloning and sequencing of R

TS BSTY Đinh Xuân Phát

THỰC HÀNH CHẨN ĐOÁN BỆNH THÚ Y

Thiết kế mồi - PCR

Family: Circoviridae Genus: Circovirus Type species: Porcine circovirus

type 2

Genome: ssDNA, circular Capsid symmetry: icosahedral Virion: non - enveloped

Pathogen

(Allan and Ellis, 2000)

Icosahedral, nonenveloped

x500,000

3

4

5 6

Ø=17n m

ssDNA

Apoptotic lymphocytes in

characterized shrunken cells

with acidophilic cytoplasm and

condensed nuclei (arrow)

Haematoxylin and eosin Chae,

(2004)

PCV2 – Clinical records

Susceptible animal: pigs at 5 – 18 weeks age

Morbidity: 5 - 30%; mortality: 10 - 80% of affected pigs

Clinical symptoms: emaciation, dyspnea, diarrhea, paleness of

skin and icterus

www.aasv.org/shap/issues

PCV2 – ORF1/945bp; ORF2/702bp

ACCAGCGCACTTCGGCAGCGGCAGCACCTCGGCAGCACCTCAGCAGCAACATGCCCAGCAGGAAGAATGGAAGAAGCGGACCCCAACCACATAAAAGGTGGGTGTTCACGCTGAATAATTCTTCCGAAGACGAGCGCAAGAAAATACGGGAGCTCCCAATCTCCCTATTTGATTATTTTATTGTTGGCGAGGAGGGTAATGAGGAAGGACGAACACCTCACCTCCAGGGGTTCGCTAATTTTGTGAAGAAGCAAACTTTTAATAAAGTGAAGTGGTATTTGGGTGCCCGCTGCCACATCGAGAAAGCCAAAGGAACTGATCAGCAGAATAAAGAATATTGCAGTAAAGAAGGCAACTTACTTATTGAATGTGGAGCTCCTCGATCTCAAGGACAACGGAGTGACCTGTCTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGAGAGCGGGAGTCTGGTGACCGTTGCAGAGCAGCACCCTGTAACGTTTGTCAGAAATTTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGAGCGGGAAAATGCAGAAGCGTGATTGGAAGACCAATGTCCACGTCATTGTGGGGCCACCTGGGTGTGGTAAAAGCAAATGGGCTGCTAATTTTGCAGACCCGGAAACCACATACTGGAAACCACCTAGAAACAAGTGGTGGGATGGTTACCATGGTGAAGAAGTGGTTGTTATTGATGACTTTTATGGCTGGCTGCCGTGGGATGATCTACTGAGACTGTGTGATCGATATCCATTGACTGTAGAGACTAAAGGTGGAACTGTACCTTTTTTGGCCCGCAGTATTCTGATTACCAGCAATCAGACCCCGTTGGAATGGTACTCCTCAACTGCTGTCCCAGCTGTAGAAGCTCTCTATCGGAGGATTACTTCCTTGGTATTTTGGAAGAATGCTACAGAACAATCCACGGAGGAAGGGGGCCAGTTCGTCACCCTTTCCCCCCCATGCCCTGAATTTCCATATGAAATAAATTACTGAGTCTTTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTTAT

TATTCAT

TTAGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAAATTCTCTGAATTGTACATACATGGTTACACGGATATTGTAGTCCTGGTCGTATTTACTGTTTTCGAACGCAGTGCCGAGGCCTACGTGGTCCACATTTCTAGAGGTTTGTAGCCTCAGCCAAAGCTGATTTTTTTTGTTATTTGGTTGGAAGTAATCAATAGTTCTGTCAAGTACAGGTTTGGGTGTGAATTAACGGGAGTGGTAGGAGAAGGGTTGGGGGATTGTATGGCGGGAGGAGTAGTTTACATATGGGTCATAGGTTAGGGCTGTGGCCTTTGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAACAGCAGTGGAGCCCACTCCCCTATCACCCTGGGTGATGGGGGAGCAGGGCCAGAATTCAACCTTAACCTTTCTTATTCTGTAGTATTCAAAGGGTACAGAGATTTTGTTGGTCCCCCCTCCCGGGGGAACAAAGTCGTCAATATTAAATCTCATCATGTCCACCGCCCAGGAGGGCGTTGTGACTGTGGTAGCCTTGACAGTATATCCGAAGGTGCGGGAGAGGCGGGTGTTGAAGATGCCATTTTTCCTTCTCCAACGGTAGCGGTGGCGGGGGTGGACGAGCCAGGGGCGGCGGCGGAGGATCTGGCCAAGATGGCTGCGGGGGCGGTGTCTTCTTCTGCGGTAACGCCTCCTTGGATACGTCATAGCTGAAAACGAAAGAAGTGCGCTGTAAG

TATT

NCBI Nucleotide  Sequence

FASTA  Sequence liên tục

Exercise 1: Xác định vị trí ORF3 trong

Sequence

Exercise 2: Xác định vị trí các ORF trong file word chứa sequence đã phân tích

TACG 4.6 Form  analyse sequence

Cloning and sequencing of RDA result

Mỗi chuỗi có dư 1 thymidine (T) tại đầu 3’

Dùng clone sản phẩm PCR của những Taq polymerase thiếu hoạt tính 3’ exonuclease Những Taq này sẽ thêm Adenosine tại đầu 3’ của sản phẩm mà không phụ thuộc vào DNA khuôn.

Cloning and sequencing of RDA result

Gene lacZ mã hóa β-galactosidase  cắt chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) thành galactose and 5-

X-gal (5-bromo-4-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole  tự bắt cặp  xanh blue.

Cloning and sequencing of RDA result

Student: Dinh Xuan Phat

Advisor: Prof Fernando Osorio

Cloning and sequencing of RDA result

Student: Dinh Xuan Phat

Advisor: Prof Fernando Osorio

Student: Dinh Xuan Phat

Advisor: Prof Fernando Osorio

A3 cDNAs cloned into pGEM-T

Student: Dinh Xuan Phat

Advisor: Prof Fernando Osorio

A3D: 650 A3B: 420

A3A: 380 A3C: 500 pGEM-T

3kb

B1 cDNAs cloned into pGEM-T

Student: Dinh Xuan Phat

Advisor: Prof Fernando Osorio

PCR amplifying A3/B1 ORF2 and genome

M A3 B1 A3 B1

Clones screening

Student: Dinh Xuan Phat

Advisor: Prof Fernando Osorio

Student: Dinh Xuan Phat

Advisor: Prof Fernando Osorio

TS BSTY Đinh Xuân Phát

THỰC HÀNH CHẨN ĐOÁN BỆNH THÚ Y

Primer – PCR Cloning - Digestion

1 Độ dài 16 – 20 nt Nhưng nếu có phần không

bắt cặp thì phần bắt cặp ít nhất là 20 nt.

2 Nên kết thúc ở C hoặc G tại đầu 3’

3 Nhiệt độ Tm nên cách nhau càng ít càng tốt

4 Chỉ tính Tm cho phần bắt cặp của primer

5 5’ và 3’ không nên cùng lúc có G và C

Primer

1 Primer cho PCR kiểm tra có – không

2 Primer khuếch đại ORF

3 Primer tạo ORF để cloning (có thêm tag)

4 Primer tạo gien tiếp hợp (fusion gene)

5 Primer tạo đột biến điểm

6 Primer tạo đột biến mất đoạn

7 Kiểm tra vị trí và tính chất của primer có sẵn

- For: 5’-TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT-3’

- Rev: 3’-CCGCACCTTCGGATATACTC-5’

Primer – Cách làm

1 Thiết kế mồi với enzyme cắt phù hợp

3 Phân tích sản phẩm trên gel agarose

4 Ly trích DNA từ gel (Phenol – Cloroform)

5 Cắt với enzyme cắt đã định

6 Phân tích sản phẩm trên gel agarose

7 Ly trích DNA từ gel (Phenol – Cloroform)

8 Kiểm tra nồng độ DNA trong mẫu (ng/ul)

9 Phản ứng gắn (ligation – SL)

10 Chuyển nạp vào E.coli (DH5alpha)

Cloning

TA Cloning = Single enzyme

Cloning