Lí thuyết chẩn Đoán bênh thực vật

Tuy nhiên, sản xuất lúa thường xuyên bị đe dọa bởi các dịch bệnh nguy hiểm, trong số đó có sự đóng góp đáng kể của bệnh đạo ôn gây nên bởi nấm Magnaporthe oryzae anamorph, Pyricularia or

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO BÀI TẬP

SINH HỌC PHÂN TỬ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO BÀI TẬP

PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc Phan Bá Quốc Anh 21126278

Nguyễn Hoài An 21126267

Lê Ngọc Thế Hoa 21126346Trượng Hoàng Minh Yến 21126260

TP Thủ Đức, 12/2024CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG

SINH HỌC PHÂN TỬ

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về nấm Magnaporthe oryzae 3

2.2 Tổng quan về kỹ thuật CRISPR Cas 12a 5

2.3 Tổng quan về lúa chuyển gene Bt 6

2.3.1 Lợi ích của cây trồng Bt 6

2.3.2 Nghiên cứu về chuyển gene trên Bt ở Việt Nam và tác hại của Magnaporthe oryzae gây ra đối với lúa Bt 6

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 9

3.1 Vật liệu nghiên cứu 9

3.1.1 Mẫu thực vật 9

3.1.2 Gen mục tiêu 9

3.1.3 Công cụ và hóa chất 9

3.2 Phương pháp nghiên cứu 10

3.2.1 Phương pháp chiết xuất DNA bằng giấy lọc 10

3.2.2 Phương pháp khuếch đại Recombinase Polymerase Amplification (RPA) 10

3.2.3 Phương pháp phát hiện DNA bằng CRISPR/Cas12a 11

3.2.4 Phương pháp xét nghiệm dòng chảy bên (LFA) 12

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ KẾT LUẬN 12

4.1 Kết quả 12

4.1.1 Kết quả của phương pháp chiết xuất DNA bằng giấy lọc 13

4.1.2 Kết quả của phương pháp khuếch đại Recombinase Polymerase Amplification (RPA) 13

4.1.3 Kết quả của phương pháp phát hiện DNA bằng CRISPR/Cas12a 13

4.1.4 Kết quả của phương pháp chiết DNA dựa trên giấy lọc và xét nghiệm dòng chảy bên (LFA) 15

4.2 Kết luận 17

4.2.1 Kết luận của phương pháp chiết xuất DNA bằng giấy lọc 17

4.2.2 Kết luận của phương pháp khuếch đại Recombinase Polymerase Amplification (RPA) 17

4.2.3 Kết luận của phương pháp phát hiện DNA bằng CRISPR/Cas12a 18

4.2.4 Kết luận của Phương pháp chiết DNA dựa trên giấy lọc và xét nghiệm dòng chảy bên (LFA) 18

4.3 Thảo luận 18

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Nấm Magnaporthe oryzae gây bệnh trên lúa 3

Hình 3.1 Sơ đồ minh họa quy trình xét nghiệm DNA trên giấy 10 Hình 3.2 Sơ đồ minh họa nguyên lý hoạt động của CRISPR/Cas12a trong nhận diện

và phân tách DNA mục tiêu 11

Hình 3.3 Sơ đồ phát hiện DNA bằng trình báo huỳnh quang (FQ-reporter) 12 Hình 3.4 Sơ đồ quy trình phát hiện LFA, minh hoạ cách sản phẩm từ RPA tương tác

với Cas12a và trình báo FB để tạo vạch dải màu trên dải giấy 12

Hình 4.1 Thể hiện tín hiệu huỳnh quang thu được từ các crRNA khác nhau khi phát

hiện DNA mục tiêu 13

Hình 4.2 Hiệu quả phân tách DNA mục tiêu của Cas12a với các crRNA khác nhau 14 Hình 4.3 So sánh tín hiệu huỳnh quang giữa crRNA hoàn toàn khớp với DNA mục

tiêu 15

Hình 4.4 Kết quả phát hiện mầm bệnh và gen mục tiêu bằng phương pháp LFA 16 Hình 4.5 Kết quả trực quan trên dải LFA khi phát hiện gen mục tiêu 17

DANH SÁCH CÁC BẢNGBảng 3.1 Thành phần và thể tích của phản ứng RPA 11 Bảng 3.2 Thành phần và thể tích của phản ứng Cas12a 11

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

FQ : Fluorescent Quenching

FAM : Fluorescein amidite

CRISPR : Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic RepeatsRPA : Recombinase Polymerase Amplification

LFA : Lateral Flow Assay

FITC : Fluorescein isothiocyanate

GRNA : guide RNA

TracrRNA: trans-activating CRISPR RNA

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đề

Lúa gạo từ lâu là cây lương thực chính của nền nông nghiệp Việt Nam và đồngthời là nước giữ vị trí thứ 3 thế giới về sản lượng gạo xuất khẩu hằng năm, đem lại thunhập cho nhiều người và đóng góp to lớn vào GDP cả nước Do đó, việc cải thiện năngsuất lúa và thường xuyên giám sát, phòng trừ bệnh hại là rất quan trọng

Tuy nhiên, sản xuất lúa thường xuyên bị đe dọa bởi các dịch bệnh nguy hiểm,

trong số đó có sự đóng góp đáng kể của bệnh đạo ôn gây nên bởi nấm Magnaporthe

oryzae (anamorph, Pyricularia oryzae) Magnaporthe oryzae là một loài đơn bội của

ngành nấm Ascomycota, phân ly từ Magnaporthe grisea, gây bệnh đạo ôn chủ yếu

trên cây cỏ và một số loài khác trong đó có lúa Là hai loài phát sinh khác nhau nhưng

M oryzae và M grisea không có sự khác biệt rõ ràng về hình thái (Couch and Kohn,

2002) Bệnh đạo ôn làm giảm năng suất lúa từ 10 - 30% trên toàn thế giới (Pooja andKatoch, 2014) nhưng cũng có nơi bị thiệt hại lên tới 80 - 100% (Talbot, 2003) Ở ViệtNam, bệnh đạo ôn gây hại trên tất cả các vùng sinh thái nông nghiệp, đặc biệt nghiêmtrọng hơn ở các khu vực áp dụng hệ thống canh tác hiện đại, như đồng bằng sôngHồng (ĐBSH), đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) và các hệ sinh thái nông nghiệp ởmiền Trung do tập trung khai thác các giống thương mại cho năng suất cao Bệnh đạo

ôn có thể phát triển thành dịch nhanh chóng nhất là vào vụ Đông Xuân Vì thế việc cónhững phương pháp chẩn đoán kịp thời, chính xác bệnh đạo ôn hay những bệnh khác

sẽ giúp giảm thiểu việc tốn hao năng suất lúa cũng như nhiều loài khác

Chẩn đoán bệnh bằng sinh học phân tử thường được ứng dụng nhiều các kỹthuật PCR, realtime PCR, LAMP PCR giúp định lượng và đặc biệt với realtime PCRgiúp định lượng theo thời gian thực khá tốt nhưng đòi hỏi phải làm việc trong phòngthí nghiệm có trang thiết bị và hóa chất như máy luân nhiệt, sử dụng các chất pháthuỳnh quang như SYBR GREEN hay thiết kế đoạn mồi có gắn huỳnh quang Kỹ thuậtLAMP có thể phát hiện mầm bệnh tại đồng ruộng nhưng đòi hỏi phải thiết kế nhiềuđoạn mồi phức tạp hơn PCR Kỹ thuật CRISPR gần đây đã nổi lên trong công cuộcchỉnh sửa gen và phát hiện gen mục tiêu, tiêu biểu là CRISPR Cas9 Ngoài ra, Cas12gần đây đã được phát hiện nhưng việc sử dụng trong chẩn đoán bệnh thực vật còn hạnchế

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đây là một phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác cho các bệnh trêncây trồng và phát hiện sinh vật biến đổi gen (GMO) Phương pháp này kết hợp côngnghệ CRISPR-Cas12a với khuếch đại polymerase tái tổ hợp (RPA) và xét nghiệmdòng chảy bên (LFA) để tạo ra một hệ thống phát hiện DNA đơn giản, hiệu quả và cóthể thực hiện ở nhiệt độ cơ thể mà không cần thiết bị phức tạp

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Chiết xuất DNA bằng giấy lọc

Nội dung 2: Khuếch đại Recombinase Polymerase Amplification (RPA)

Nội dung 3: Phát hiện DNA bằng CRISPR/Cas12a

Nội dung 4: Xét nghiệm dòng chảy bên (LFA)

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Tổng quan về nấm Magnaporthe oryzae

Nấm gây bệnh cho thực vật Magnaporthe oryzae là một loại nấm túi dạng sợi

gây bệnh đạo ôn trên lúa, bệnh chính của lúa trồng trên toàn thế giới, với mức mấtnăng suất dao động từ 10% đến 30% (Talbot, 2003) Tác nhân gây bệnh ảnh hưởng

đến một số loại cỏ khác như lúa mì, kê và lúa mạch (Talbot, 2003) Magnaporthe

oryzae B.C Couch lần đầu tiên được F Cavara phân lập từ lúa (Oryza sativa) vào năm

1892 với tên gọi là Pyricularia oryzae (Couch và Kohn, 2002; Rossman và ctv, 1990).

Tuy nhiên, bệnh đạo ôn trên lúa đã được biết đến từ năm 7000 trước Công nguyên, khi

quá trình thuần hóa O sativa bắt đầu ở Thung lũng Dương Tử ở Trung Quốc (Couch

và cộng sự, 2005) (Hình bổ sung 1E) M oryzae được mô tả là bệnh sốt lúa ở Trung

Hình 1.1 Nấm Magnaporthe oryzae gây bệnh trên lúa (Nguồn:

Li và ctv, 1999)

Quốc vào năm 1637 và chỉ sau đó mới được biết đến rộng rãi hơn với tên gọi là nấmđạo ôn lúa (Ou, 1985) Tên thực tế “đạo ôn” ám chỉ sự lây lan nhanh chóng của bệnhtrong các cánh đồng lúa.

Vòng đời của M oryzae bao gồm chu kỳ nhiễm trùng bán sinh dưỡng và chủ yếu

là phương thức sinh sản vô tính Giai đoạn sinh sản hữu tính tồn tại nhưng hiếm khiđược tìm thấy trong tự nhiên ở các quần thể nhiễm bệnh lúa (Notteghem và Silué,

1992; Talbot và cộng sự, 1993b) Phân tích quần thể M oryzae cho thấy ở hầu hết các

khu vực chỉ có một trong hai loại giao phối, MAT1-1 hoặc MAT1-2, chiếm ưu thếhoặc khi cả hai đều có mặt, các cá thể không có khả năng sinh sản (Notteghem vàSilué, 1992) Tuy nhiên, có thể bắt đầu sinh sản hữu tính bằng cách ghép các dòng hữuthụ có kiểu giao phối đối lập (Notteghem và Silué, 1992; Valent và ctv, 1991) Điềunày dẫn đến sự phát triển của các thể quả (perithecia) bao quanh các túi chứa đầy támbào tử túi (Valent và ctv, 1991)

Trong chu kỳ vô tính của mình, M oryzae tạo ra các bào tử ba tế bào được phát

tán bằng cách bắn giọt sương (Talbot, 2003) Chu kỳ nhiễm trùng bắt đầu khi một bào

tử đậu trên lá lúa (Hamer và ctv, 1988) Một ống mầm phân cực xuất hiện từ đầu vàkéo dài, trở nên dẹt trên bề mặt, một giai đoạn được gọi là móc Ở giai đoạn này, cáctín hiệu vật lý như kỵ nước, độ cứng bề mặt và các tín hiệu của thực vật như monomecutin, kích hoạt sự hình thành các cấu trúc nhiễm trùng chuyên biệt được gọi là

appressoria (Talbot và cộng sự, 1993a) Appressorium là một tế bào melanized hình

vòm đơn, có khả năng phá vỡ lớp biểu bì bằng cách chuyển hóa sức căng bên trongcao thành lực cơ học (Dixon và cộng sự, 1999) Nó chứa một lỗ ở gốc, từ đó một chốtxuyên thấu xuất hiện để phá vỡ lớp biểu bì của lá lúa, bắt đầu quá trình phát triển xâmlấn Các sợi nấm xâm lấn được bao quanh bởi màng tế bào chất của cây và phân nhánhqua mô thực vật trong 3–4 ngày cho đến khi hình thành tổn thương (Kankanala vàcộng sự, 2007) Sau 72 giờ, gần 10% sinh khối của lá lúa có thể là sợi nấm M oryzaetrong các trường hợp nhiễm trùng nặng (Talbot và cộng sự, 1993b) Sau 4–5 ngày, cáctổn thương do bệnh có thể nhìn thấy trên bề mặt cây, từ đó các bào tử phát triển để tạo

ra bào tử lây lan sang các cây mới (Talbot và cộng sự, 1993a)

Trong 20 năm qua, M oryzae đã nổi lên như một sinh vật mô hình trong bệnh

học thực vật, đặc biệt là một hệ thống nghiên cứu tương tác giữa thực vật và mầm

bệnh Sự sẵn có của các phương pháp nuôi cấy in vitro và kích thích sự phát triển của

appressorium, cùng với sự sẵn có của trình tự bộ gen và các công cụ cho di truyền học

cổ điển và phân tử làm cho loại nấm này trở thành một mô hình thử nghiệm tuyệt vời(Wilson và Talbot, 2009)

2.2 Tổng quan về kỹ thuật CRISPR Cas 12a

Hiện nay công nghệ CRISPR đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong tất cả cáclĩnh vực từ cây trồng, vật nuôi, nông nghiệp, y học CRISPR (Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats) là hệ thống miễn dịch của vi khuẩn và cổ vikhuẩn nhằm chống lại virus và thực khuẩn thể Cho đến một thập kỷ trước, người tacho rằng khả năng miễn dịch thích ứng được coi là một đặc điểm chỉ có ở sinh vậtnhân chuẩn Tuy nhiên, việc phát hiện ra CRISPR và các protein liên kết với CRISPR(Cas) đã dẫn đến giả thuyết được xây dựng, rằng nhiều vi khuẩn và cổ vi khuẩn cũng

sở hữu một hệ thống miễn dịch thích ứng phức tạp về mặt chức năng (Ishino và ctv,1987; Jansen và ctv, 2002)

Các hệ thống CRISPR hiện được chia thành hai lớp chính là lớp 1 và lớp 2 vàđược chia thành sáu loại (loại I đến VI) Lớp chính được phân loại dựa trên proteinCas tham gia chính vào miễn dịch thích ứng của vi khuẩn (Koonin và ctv, 2017;Makarova và ctv, 2020) Hệ thống lớp 1 (loại I, III và IV) sử dụng nhiều protein Castrong các nuclease và hệ thống lớp 2 (loại II, V và VI) sử dụng một protein Cas duynhất (Nishimasu và ctv, 2017) Hệ thống CRISPR-Cas Lớp 1 thường được tìm thấynhất ở vi khuẩn và cổ vi khuẩn và bao gồm khoảng 90% tất cả các locus CRISPR-Cas

đã được xác định Hệ thống CRISPR-Cas Lớp 2, chứa 10% gen còn lại, hầu như chỉtồn tại ở vi khuẩn (Shmakov và ctv, 2017)

CRISPR-Cas12a (còn được gọi là Cpf1) là hệ thống CRISPR-Cas loại V đã cóthể được sử dụng như một công cụ chỉnh sửa bộ gen thay thế cho CRISPR-Cas9.GRNA (guide RNA) của phức hợp ribonucleoprotein CRISPR-Cas12a là crRNA(CRISPR RNA) dài 41–44 nucleotide mã hóa một chuỗi bổ sung gồm 20–24nucleotide so với trình tự DNA mục tiêu và không cần tracrRNA (trans-activatingCRISPR RNA) để đưa Cas12a vào vị trí DNA mục tiêu (Ishibashi và ctv, 2022) Hiện

nay ba thành viên của Cas12a nuclease (còn được gọi là Cpf1) từ Acidaminococcus sp (AsCas12a), vi khuẩn Lachnospiraceae ND2006 (LbCas12a) và Francisella novicida

(FnCas12a) là được mô tả và sử dụng trong chỉnh sửa bộ gen (Zetsche và ctv, 2015;Zetsche và ctv, 2017) ứng dụng chẩn đoán CRISPR ở thực vật vẫn còn hạn chế

2.3 Tổng quan về lúa chuyển gene Bt

2.3.1 Lợi ích của cây trồng Bt

Cây trồng Bt kháng côn trùng đã mang lại nhiều lợi ích đáng kể trong lĩnh vựcquản lý nông nghiệp hiện đại Một trong những ưu điểm nổi bật của loại cây trồng này

là khả năng tự kháng sâu bệnh, giúp bảo vệ cây trồng khỏi một số loài côn trùng gâyhại mà không cần sử dụng thuốc trừ sâu Điều này không chỉ giúp nông dân giảm thiểuchi phí mua thuốc trừ sâu mà còn góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.Theo nghiên cứu của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, năm 1998, nông dân trồng cây Bt đãgiảm được hơn 3,7 triệu kg thuốc trừ sâu Tại Trung Quốc và Argentina, các quốc giaứng dụng rộng rãi cây trồng Bt, lượng thuốc trừ sâu sử dụng cũng giảm mạnh, từ 60-70%, đặc biệt trong canh tác bông Bt Nhờ đó, năng suất mùa màng được cải thiệnđáng kể, đồng thời giúp nông dân có thêm thời gian dành cho các công việc quản lýnông trại khác

Ngoài lợi ích kinh tế, cây trồng Bt còn mang lại lợi nhuận cao hơn so với câytrồng truyền thống Ở Hoa Kỳ, nông dân trồng bông Bt đã thu được 99 triệu đô la tiềnlãi nhờ giảm chi phí đầu vào và/hoặc nhờ sản lượng cao hơn Tại Argentina, lợi nhuận

từ bông Bt cũng tăng trung bình 65,05 đô la/ha, tạo điều kiện cải thiện thu nhập vànâng cao đời sống cho người nông dân Không chỉ vậy, việc giảm sử dụng thuốc trừsâu phổ rộng còn góp phần tạo môi trường thuận lợi cho các sinh vật có ích, như cácloài động vật ăn thịt và sinh vật ký sinh, phát triển mạnh mẽ hơn Những sinh vật nàyđóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sâu hại thứ cấp, giảm sự phụ thuộc vàocác biện pháp hóa học truyền thống vốn tiềm ẩn nhiều nguy cơ với hệ sinh thái

Bên cạnh khả năng kháng sâu bệnh hiệu quả, cây trồng Bt còn có khả năng khánglại một số mầm bệnh vi sinh vật, điển hình là nấm Fusarium Loài nấm này thường sảnsinh mycotoxin, một loại độc tố gây nguy hiểm cho gia súc và có khả năng gây ungthư ở người Do đó, việc trồng cây Bt không chỉ nâng cao hiệu quả kinh tế mà cònđóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng.Những lợi ích toàn diện này đã chứng minh cây trồng Bt là một giải pháp nông nghiệpbền vững, đáp ứng được yêu cầu của cả sản xuất hiện đại và bảo vệ môi trường

2.3.2 Nghiên cứu về chuyển gene trên Bt ở Việt Nam và tác hại của Magnaporthe oryzae gây ra đối với lúa Bt

Nghiên cứu của Nguyễn Hữu Hồ và ctv tại Viện Sinh học Nhiệt đới, phối hợpvới Campus International de Baillarguet (Pháp), đã công bố trong Tạp chí Khoa họcCây trồng những kết quả quan trọng về việc chuyển nạp gen kháng sâu đục thân màuvàng vào cây lúa Việt Nam (Oryza sativa) Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học sửdụng gen hợp nhất Bt, mã hóa protein Cry1Ab-Cry1B, có khả năng tiêu diệt các loạisâu hại chính Gen này được đưa vào tế bào mầm lúa thông qua các kỹ thuật chuyểngen tiên tiến Sau khi thực hiện, nhóm nghiên cứu tiến hành xác nhận sự hiện diện củaprotein dung nạp trong cây chuyển gen, đồng thời phân tích sự ổn định di truyền vàhiệu quả kháng sâu của cây lúa Bt đối với sâu đục thân màu vàng và sâu sọc nâu Kếtquả cho thấy, cây lúa chuyển gen Bt tiêu diệt 100% ấu trùng sâu đục thân màu vàng vàsọc nâu trong vòng một tuần kể từ khi nhiễm bệnh, trong khi không gây ảnh hưởngđến năng suất hay chất lượng hạt lúa Điều này chứng minh cây lúa Bt là một giải pháphiệu quả để giảm thiểu thiệt hại do sâu bệnh trong nông nghiệp (Nguyễn và ctv, 2024).Tuy nhiên, cây lúa Bt vẫn không tránh khỏi sự xâm nhiễm của bệnh đạo ôn, mộtbệnh nghiêm trọng do nấm Magnaporthe oryzae gây ra Khi bị nhiễm bệnh, cây lúa Btchịu những thiệt hại tương tự như các giống lúa thông thường Bệnh đạo ôn làm giảmkhả năng quang hợp của lá, từ đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển,dẫn đến giảm năng suất đáng kể Đồng thời, chất lượng hạt lúa cũng bị suy giảmnghiêm trọng; hạt lúa thường bị lép và nhẹ hơn, không đạt tiêu chuẩn chất lượng.Ngoài ra, nông dân phải tăng cường sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để phòng trừ bệnh,dẫn đến chi phí sản xuất gia tăng Những tác động này không chỉ làm giảm hiệu quảkinh tế của việc trồng lúa Bt mà còn gây ra những khó khăn lớn trong quản lý bệnhtrên đồng ruộng (Zhu và ctv, 2023).

Trước thực trạng này, nhóm nghiên cứu đã đề xuất một giải pháp mới nhằm hỗtrợ chẩn đoán và quản lý bệnh nhanh chóng, đó là ứng dụng công nghệ phát hiện DNAdựa trên hệ thống CRISPR-Cas12a Phương pháp này cho phép phát hiện mầm bệnhmột cách nhanh chóng và chính xác nhờ khả năng nhận diện các đoạn DNA đặc hiệucủa tác nhân gây bệnh Đặc biệt, công nghệ này không chỉ hỗ trợ chẩn đoán bệnh đạo

ôn mà còn có thể được sử dụng để kiểm tra tính ổn định và hiệu quả của các cây trồngchuyển gen GMO Theo nghiên cứu của Chen và cộng sự (2022), CRISPR-Cas12a có

độ nhạy cao, thời gian phản ứng nhanh, và có thể được triển khai dễ dàng ngay tại hiệntrường Sự kết hợp giữa công nghệ di truyền tiên tiến và hệ thống chẩn đoán hiện đại