Nhóm 13 thứ 5 ca3 chẩn Đoán bệnh thực vật

Trong nghiêncứu này, đầu tiên chúng tôi sử dụng MinION, một thiết bị giải trình tự di động dựa trênOxford Nanopore Technologies ONT để phát hiện nhanh chóng các loại virus thực vật ở hoa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

CHUẨN ĐOÁN BỆNH TỪ VIRUS NELV TRÊN LAN HỒ ĐIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

CHUẨN ĐOÁN BỆNH TỪ VIRUS NELV TRÊN LAN HỒ ĐIỆP

BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-RPA-CRISPR/Cas12a

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

PGS.TS NGUYỄN BẢO QUỐC NGUYỄN PHÚC HUY 21126073

VÕ HOÀNG MINH 21126408

VÕ DUY KHÁNH 21126374NGUYỄN VĂN TOÀN 21126539

TP Thủ Đức, 25/12/2024

TÓM TẮT

Hoa lan Hồ điệp là một trong những loại cây cảnh phổ biến nhất Hơn ba mươi loại virushoa lan đã được báo cáo và hoa lan Hồ điệp bị nhiễm virus mất đi đáng kể giá trị thươngmại của chúng Do đó, việc phát triển các phương pháp phát hiện bệnh do virus cải tiến

có thể hữu ích cho việc kiểm soát chất lượng trong quá trình trồng hoa lan Trong nghiêncứu này, đầu tiên chúng tôi sử dụng MinION, một thiết bị giải trình tự di động dựa trênOxford Nanopore Technologies (ONT) để phát hiện nhanh chóng các loại virus thực vật

ở hoa lan Hồ điệp Giải trình tự Nanopore cho thấy sự hiện diện của ba loại virus thực vật

ở hoa lan Hồ điệp : virus đốm vòng odontoglossum, virus khảm cymbidium và virus tiềm

ẩn nerine (NeLV) Hơn nữa, lần đầu tiên, chúng tôi phát hiện nhiễm trùng NeLV ở hoalan Hồ điệp bằng cách sử dụng giải trình tự nanopore và phát triển phương pháp khuếchđại polymerase phiên mã ngược-tái tổ hợp (RT-RPA)-CRISPR/Cas12a để chẩn đoánnhanh chóng, linh hoạt với thiết bị và chính xác Kỹ thuật RT-RPA-CRISPR/Cas12ađược phát triển có thể xác nhận nhiễm trùng NeLV trong vòng chưa đầy 20 phút vàkhông biểu hiện phản ứng chéo với các loại virus khác Để xác định độ nhạy của RT-RPA-CRISPR/Cas12a đối với NeLV, chúng tôi đã so sánh nó với RT-PCR sử dụng cácbản sao pha loãng theo chuỗi và tìm thấy giới hạn phát hiện là 10 zg/μL, nhạy hơnkhoảng 1000 lần Xét về tổng thể, nền tảng ONT cung cấp một chiến lược hiệu quả đểtheo dõi các tác nhân gây bệnh virus thực vật và phương pháp RT-RPA-CRISPR/Cas12a

có tiềm năng lớn như một công cụ hữu ích để chẩn đoán nhanh và nhạy NeLV

Từ khóa: Hoa lan hồ điệp; giải trình tự nanopore; RT-RPA-CRISPR/Cas12a; chẩn đoántrực quan; phát hiện nhanh

Phalaenopsis orchids are one of the most popular ornamental plants More than thirtyorchid viruses have been reported, and virus-infected Phalaenopsis orchids significantlylose their commercial value Therefore, the development of improved viral diseasedetection methods could be useful for quality control in orchid cultivation In this study,

we first utilized the MinION, a portable sequencing device based on Oxford NanoporeTechnologies (ONT) to rapidly detect plant viruses in Phalaenopsis orchids Nanoporesequencing revealed the presence of three plant viruses in Phalaenopsis orchids:odontoglossum ringspot virus, cymbidium mosaic virus, and nerine latent virus (NeLV).Furthermore, for the first time, we detected NeLV infection in Phalaenopsis orchidsusing nanopore sequencing and developed the reverse transcription–recombinasepolymerase amplification (RT-RPA)-CRISPR/Cas12a method for rapid, instrument-flexible, and accurate diagnosis The developed RT-RPA-CRISPR/Cas12a technique canconfirm NeLV infection in less than 20 min and exhibits no cross-reactivity with otherviruses To determine the sensitivity of RT-RPA-CRISPR/Cas12a for NeLV, wecompared it with RT-PCR using serially diluted transcripts and found a detection limit of

10 zg/μL, which is approximately 1000-fold more sensitive Taken together, the ONTplatform offers an efficient strategy for monitoring plant viral pathogens, and the RT-RPA-CRISPR/Cas12a method has great potential as a useful tool for the rapid andsensitive diagnosis of NeLV

Keywords: Phalaenopsis orchids; nanopore sequencing; RT-RPA-CRISPR/Cas12a;visualized diagnosis; rapid detection

MỤC LỤC

Trang

TÓM TẮT i

ABSTRACT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH vii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu về Phalaenopsis 2

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố 2

2.1.2 Phân loại học 2

2.1.3 Hình thái học của chi lan hồ điệp 2

2.1.4 Điều kiện sinh trưởng 3

2.2 Giới thiệu về Nerine latent virus 3

2.2.1 Hình thái và phân loại học 3

2.3 Giới thiệu về kỹ thuật CRISPR–Cas12 3

2.3.1 CRISPS 3

2.3.2 CRISPR–Cas12 4

2.4 RT- RPA 4

2.5 Ứng dụng RT-RPA-CRISPR/Cas12a trong phát hiện NeLV 5

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 7

3.1 Vật liệu và phương pháp 7

3.1.1 Thu thập mẫu và chiết xuất RNA 7

3.1.2 Quan sát các hạt virus bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 7

3.1.3 Chuẩn bị thư viện Nanopore và giải trình tự ONT 7

3.1.4 Phân tích tin sinh học 8

3.1.5 Phân tích phát sinh loài 8

3.1.6 RT-PCR để xác nhận 8

3.1.7 Tính khả dụng của dữ liệu 8

3.1.8 Thiết kế mồi RT-RPA và chuẩn bị crRNA 9

3.1.9 Chuẩn bị bản sao virus chuẩn 9

3.1.10 Xét nghiệm RT-RPA-CRISPR/Cas12a 9

3.1.11 Tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian phản ứng 10

3.1.12 Đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy 10

3.1.13 Xác thực CRISPR/Cas12 bằng cách sử dụng mẫu thực địa 10

3.2 Phân tích thống kê 11

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12

4.1 Kết quả 12

4.1.1 Quan sát các hạt virus bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 12

4.1.2 Nhận dạng Virus bằng Giải trình tự Nanopore 12

4.1.3 Lắp ráp bộ gen 13

4.1.4 Phân tích phát sinh loài 14

4.1.5 Xác nhận các loại virus đã xác định 14

4.1.6 Tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian phản ứng 15

4.1.7 Độ đặc hiệu và độ nhạy 16

4.1.8 Xác thực CRISPR/Cas12 bằng cách sử dụng mẫu thực địa 17

4.2 Thảo luận 18

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 22

5.1 Kết luận 22

5.2 Đề nghị 22

TÀI LIỆU THAM KHẢO 24

PHỤ LỤC 25

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Tóm tắt dữ liệu từ ONT 13 Bảng 4.2 Danh sách các loại virus được xác định ở hoa lan Hồ điệp 14 Bảng 4.3 So sánh RT-RPA-CRISPR/Cas12a và RT-PCR đối với NeLV sử dụng mẫu

hoa lan Hồ điệp và mẫu hoa thủy tiên vàng 18

Hình 4.3 Xác nhận virus được xác định thông qua giải trình tự nanopore bằng phản ứng

chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) 15

Hình 4.4 Tối ưu hóa RT-RPA-CRISPR/Cas12a để phát hiện NeLV

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hoa lan Hồ điệp là một trong những loại cây cảnh phổ biến nhất Hơn ba mươiloại virus hoa lan đã được báo cáo và hoa lan Hồ điệp bị nhiễm virus mất đi đáng kể giátrị thương mại của chúng Do đó, việc phát triển các phương pháp phát hiện bệnh dovirus cải tiến có thể hữu ích cho việc kiểm soát chất lượng trong quá trình trồng hoa lan

1.2 Mục tiêu đề tài

Phát hiện nhanh chóng các loại virus thực vật ở hoa lan Hồ điệp và phát hiện đượcnhiễm trùng NeLV ở hoa lan Hồ điệp

1.3 Nội dung thực hiện

Trong nghiên cứu này, đầu tiên chúng tôi sử dụng MinION, một thiết bị giải trình

tự di động dựa trên Oxford Nanopore Technologies (ONT) để phát hiện nhanh chóng cácloại virus thực vật ở hoa lan Hồ điệp Phát hiện nhiễm trùng NeLV ở hoa lan Hồ điệpbằng cách sử dụng giải trình tự nanopore và phát triển phương pháp khuếch đạipolymerase phiên mã ngược-tái tổ hợp (RT-RPA)-CRISPR/Cas12a để chẩn đoán nhanhchóng, linh hoạt với thiết bị và chính xác

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về Phalaenopsis

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Chi Phalaenopsis (lan hồ điệp) được đặt tên vào năm 1825 do nhà thực vật người

Hà Lan Karl Lud-wig Blume nhưng ghi chép về 1 loài trong chi này, cũng là tài liệu bênsớm nhất mô tả hình thái cây đã xuất hiện năm 1750, do nhà thực vật Rumphius mô tả.Khi chỉ mới phát hiện vài loài trong chi lan hồ điệp, thì các loài đã được các nhà thực vậthọc xếp vào các chi lan khác Phải đến năm 1825, thì mới được phân ra làm 1 chi lan mới

là Phalaenopsis, có nghĩa là ngoại hình của một loài bướm đêm Cũng từ đó người ta đãphát hiện và đặt tên cho nhiều loài trong chi này

Chi lan hồ điệp có sự phân bố rộng rãi từ các dãy núi, đến các quốc gia tiếp giáp biển, cácđảo quốc nơi có điều kiện thiên nhiên thích hợp để cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất

2.1.3 Hình thái học của chi lan hồ điệp

Chi lan hồ điệp theo The World Checklist of Monocotyledons current (2010), đãcông nhận chi này có 61 loài và ngày càng nhiều loài được công nhận do quá trình lai tạocủa con người, nên có sự đa dạng đặc điểm hình thái của các loài trong chi đến mức khóphân biệt rạch ròi

Đặc điểm hình thái chung của cây lan hồ điệp là thực vật biểu sinh trên cây và đá, với sựphát triển đơn thân; thân ngắn với một vài đến nhiều lá mọc sát nhau Lá thường dai, hơimọng hoặc dai, màu xanh lá cây hoặc có đốm, rộng, phẳng và rủ xuống Cụm hoa bên từgần gốc thân, ngắn hoặc dài, rủ xuống, cong hoặc thẳng, đơn giản đến phân nhánh, mang

từ một vài đến nhiều hoa Hoa nhỏ đến khá lớn, có nhiều màu sắc, thường rực rỡ và lâutàn Lá đài giống nhau và gần như bằng nhau, xòe rộng Cánh hoa giống như lá đài, hẹphơn một chút hoặc rộng hơn nhiều Môi có ba thùy, gắn vào chân cột mà không có bản lề,thay đổi và phức tạp với các phần phụ giống như râu thường có Cột ngắn đến dài, với

một chân nổi bật Đầu bao phấn, nằm, hai ô Phấn hoa hai, sáp, gần như hình cầu hoặchình trứng, hơi nứt, trên một cuống khá dài.

2.1.4 Điều kiện sinh trưởng

Lan hồ điệp có các loài sinh trưởng ở những vùng cao hơn và những loài sinhtrưởng ở những vùng thấp hơn mực nước biển; những nơi có môi trường sống ở các vùngnhiệt đới nơi có nhiệt độ khá đồng đều, ban ngày không quá nóng còn ban đêm thì khôngquá lạnh Khoảng nhiệt độ tối ưu từ 18 - 26 °C Là loài cây ưa bóng không cần quá nhiềuánh sáng mặt trời để sinh trưởng và phát triển Độ ẩm là một yếu tố quan trọng ảnhhưởng đến cây, độ ẩm luôn phải trên 70 %, và cao hơn khi nhiệt độ vượt mức 26 °Cnhưng cần thấp hơn khi cây đang trong giai đoạn ra hoa Cây yêu cầu về sự trao đổi lưuthông không khí, nhưng cần đảm bảo về độ ẩm không khí nên các vùng ven biển rất thíchhợp cho cây sinh sống Lan hồ điệp là loài cây biểu sinh vì vậy nó cần giá đỡ để sinhtrưởng và phát triển và cũng phải lưu ý việc giá đỡ phải thoát nước tốt

2.2 Giới thiệu về Nerine latent virus

2.2.1 Hình thái và phân loại học

Nerine latent virus (NeLV) là loại loại virus có dạng sợi, có chiều dài trung bình

là 660 nm,có chiều dài trình tự 891 nucleotide Virion chứa một phân tử ssRNA dươngtính, có một mũ methyl hóa ở đầu 5' và một đầu 3' polyadenylat; vỏ virus được cấu tạo từmột chuỗi polypeptide đơn có kích thước khoảng 41 kDa Bộ gen chứa ba ORF; ORF 2

và 3 được tách biệt bởi một vùng liên gen ngắn và ORF 1 và 2 chồng chéo nhau bởi 1 nt.ORF1 là protein sao chép và có thể được biểu hiện trực tiếp từ RNA bộ gen Người ta chorằng hai ORF hạ lưu nhỏ hơn, mã hóa tương ứng cho MP và CP được cho là, được biểuhiện thông qua sgRNA (https://ictv.global/report_9th/RNApos/Betaflexiviridae)

Phân loại theo quy ước quốc tế:

Loài - Nerine latent virus.

2.3 Giới thiệu về kỹ thuật CRISPR–Cas12

2.3.1 CRISPS

CRISPR là viết tắt của “clustered regularly interspaced short palindromicrepeats” là một hệ thống miễn dịch thích ứng có trong hầu hết ở sinh vật nhân sơ, để giúpchúng ngăn ngừa bị nhiễm, bởi các phage, vi-rút và các yếu tố di truyền lạ khác Nó baogồm các mảng lặp lại CRISPR, có thể được phiên mã thêm thành CRISPR RNA(crRNA) và CRISPR RNA hoạt hóa trans (tracrRNA), và một bộ gen liên kết vớiCRISPR (cas) mã hóa protein Cas có hoạt tính endonuclease Khi các sinh vật nhân sơ, bịcác yếu tố di truyền lạ xâm chiếm, DNA lạ có thể bị protein Cas cắt thành các đoạn ngắn,sau đó các đoạn DNA bị phân cắt trước đó sẽ được tích hợp vào mảng CRISPR dướidạng các đoạn giãn cách mới được đặt cạnh vùng protospacer-adjacent (PAM) Khi cùngmột kẻ xâm lược xâm chiếm một lần nữa, crRNA sẽ nhanh chóng nhận ra và ghép nối vớiDNA lạ, hướng dẫn protein Cas cắt các trình tự mục tiêu của DNA lạ, do đó bảo vệ vậtchủ.

Hệ thống CRISPR-Cas có thể được phân loại thành 2 lớp (Lớp 1 và Lớp 2), 6 loại(I đến VI) và một số phân nhóm, với các phức hợp tác động protein đa Cas trong hệ thốngLớp 1 (Loại I, III và IV) và một protein tác động duy nhất trong hệ thống Lớp 2 (Loại II,

V và VI)

2.3.2 CRISPR–Cas12

Đặc điểm xác định của Cas12, protein Cas loại V lớp 2, có khả năng phân cắtDNA mạch kép (dsDNA) theo kiểu so le gần vị trí 50 PAM tạo ra các phần nhô ra từ 5đến 7 nucleotide CRISPR-Cas12a là loại được sử dụng rộng rãi nhất trong họ CRISPR-Cas12 Là một endonuclease DNA Đầu tiên, nó thực hiện hoạt động DNase có mục tiêu(cis-cleavage) để cắt DNA mục tiêu Sau đó, Cas12a đi vào trạng thái hoạt động của nó

và giải phóng hoạt động DNase sợi không đặc hiệu (trans-cleavage), cắt bất kỳ DNA sợiđơn nào Nó có thể xử lý quá trình trưởng thành của crRNA và tạo ra các đầu so le màkhông cần sự hỗ trợ của tracrRNA Trong khi đó, Cas12a có thể nhận ra các trình tựPAM giàu T 5′ và do đó hỗ trợ các phức hợp Cas12a/crRNA trong nỗ lực chỉnh sửa các vịtrí không được SpCas9 nhắm mục tiêu Cas12a có kích thước nhỏ giúp nó dễ dàng đượcđưa đến các tế bào và mô So với Cas9, Cas12a có thể nhận ra tới 18 bazơ trước khi kếthợp hoàn toàn với DNA mục tiêu, dẫn đến tỷ lệ lỗi thấp hơn và tính bảo mật cao hơn Hơnnữa, Cas12a được coi là một lựa chọn tốt để giải quyết những thiếu sót đã biết củaCRISPR

2.4 RT- RPA

Năm 2006, Piepenburg và cộng sự đã phát triển công nghệ RPA bằng cách sửdụng các protein tham gia vào quá trình tổng hợp, tái tổ hợp và sửa chữa DNA của tế bào.RPA là kỹ thuật khuếch đại AND/ARN đẳng nhiệt RPA sử dụng phức hợprecombinase/mồi để quét các vùng DNA mục tiêu trên khuôn mẫu dẫn đến trao đổi sợi.Sau đó, một DNA polymerase khuếch đại đoạn mục tiêu Bằng cách thêm một enzymephiên mã ngược vào phản ứng RPA, nó có thể phát hiện RNA cũng như DNA , mà khôngcần một bước riêng để tạo ra cDNA mà độ nhạy vẫn như RPA hai bước (Milena Euler,2012).

Mồi: Độ dài mồi được thiết kế dài khoảng 30 – 35 nucleotide, mồi của phản ứngRPA, số dài lên đến 45 nucleotide Hiện tại vẫn chưa có phần mềm nào giúp thiết kế mồitrong phản ứng này Mồi tránh thiết kế ở các đoạn mục tiêu có các trình tự lặp guanine dài

ở đầu 5′ trong khi đó trình tự lặp cytidine lại có lợi; còn ở đầu 3’ guanine và cytidine lại

có lợi cho gắn mồi Hàm lượng GC không dưới 30 % và lớn hơn 70 %

DNA/RNA mục tiêu: phù hợp để khuyeechs đại ra các amplicon có độ dài từ 100– 200 bp

Nhiệt độ: từ 22 – 45 0C và nhiệt độ tối ưu từ 37 – 42 0C Để nhiệt độ cho phản ứngđược tối ưu có thể sử dụng bồn ủ, các máy gia nhiệt, ngoài ra nhiệt độ môi trường vànhiệt độ cơ thể vẫn giúp phản ứng được sảy ra

Thời gian ủ: phụ thuộc vào lượng DNA ban đầu, đối với xét nghiệm virus thờigian từ 4–10 phút (Ahmed Abd El Wahed, 2013)

RPA có thể được sử dụng để khuếch đại DNA mạch kép, DNA mạch đơn, DNA đãmethyl hóa, cDNA được tạo ra thông qua phiên mã ngược của RNA hoặc miRNA.RPA có thể được theo dõi bằng dựa vào xét nghiệm dòng chảy bên (sau khi khuếch đại),hoặc theo thời gian thực (trong quá trình khuếch đại) và có thể sử dụng đầu dò

2.5 Ứng dụng RT-RPA-CRISPR/Cas12a trong phát hiện NeLV

Hoa lan hồ điệp sau khi bị NeLV tấn công sẽ biểu hiện các triệu chứng đốm vàng,khảm và hoại tử Hoa lan hồ điệp nổi tiếng với những bông hoa bền bỉ và quyến rũ, khiếnchúng trở thành lựa chọn phổ biến trong số các loại cây cảnh Tuy nhiên, nhiễm vi-rút ởnhững loài lan này có thể dẫn đến tổn thất kinh tế đáng kể do làm giảm chất lượng hoa

Do đó, việc có sẵn các phương pháp phát hiện chính xác và đáng tin cậy để chẩn đoánmầm bệnh virus sớm là rất quan trọng

CRISPR là một công nghệ mang tính cách mạng chủ yếu được công nhận nhờ khả năngchỉnh sửa gen của nó Trong lĩnh vực chuẩn đoán phân tử, các phương pháp như PCR,Real – time PCR và LAMP gần đây đều cho độ nhạy thấp hoặc tỷ lệ âm tính giả cao Pháthiện vi-rút dựa trên CRISPR/Cas12a đã cho thấy triển vọng rộng lớn trong lĩnh vực chẩnđoán phân tử do độ nhạy và độ đặc hiệu cao và chi phí thấp là một kỹ thuật chẩn đoánphân tử có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, sử dụng hệ thống CRISPR/Cas12 để xác định sựhiện diện của virus mục tiêu Sự liên kết của một RNA hướng dẫn cụ thể với một trình tựmục tiêu bổ sung sẽ kích hoạt Cas12, dẫn đến sự cắt các phân tử DNA mạch đơn gần đó.RPA là kỹ thuật khuếch đại trình tự mục tiêu đẳng nhiệt, các đoạn mục tiêu có thể đượckhuếch đại ở nhiệt độ không đổi, nên nhu cầu về các chu trình nhiệt bị loại bỏ, tương tựnhư RT-PCR, phiên mã ngược có thể được kết hợp với RPA, được gọi là RT-RPA, đểkhuếch đại vùng quan tâm trong khuôn mẫu RNA Việc xét nghiệm phát hiện NeLV có

độ nhạy và độ đặc hiệu cao dựa trên CRISPR/Cas12a, kết hợp khuếch đại polymerase tái

tổ hợp (RPA) để sử dụng cung cấp một phương pháp thuận tiện để chuẩn đoán bệnh Hệthống RT-RPA-CRISPR/Cas12a hoạt động bằng cách cắt sản phẩm RPA đặc hiệu trình tựcủa NeLV bằng RNA hướng dẫn trong quá trình phản ứng Sau đó, Cas12a gây ra sự cắtngẫu nhiên của DNA báo cáo mạch đơn, tạo ra tín hiệu huỳnh quang được khuếch đại Sửdụng các đoạn mồi RPA đặc hiệu với virus cho phép phát hiện NeLV mà không gặp phảiphản ứng chéo trong các mẫu có khả năng bị nhiễm các virus khác

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu và phương pháp

3.1.1 Thu thập mẫu và chiết xuất RNA

Hoa lan Phalaenopsis biểu hiện các triệu chứng đốm vàng, khảm và hoại tử được

thu thập từ Samcheok, Hàn Quốc vào tháng 8 năm 2021 và được bảo quản ở nhiệt độ -80

°C cho đến khi sử dụng Tổng RNA được chiết xuất bằng bộ dụng cụ chiết xuất RNABeniPrep® Super Plant (InVirusTech Co., Gwangju, Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhàsản xuất Nồng độ và chất lượng của RNA chiết xuất được đo bằng máy quang phổBioDrop (Biochrom, Ltd., Cambridge, Vương quốc Anh) Đối với việc chuẩn bị thư việnnanopore, RNA tinh khiết và làm giàu đã được thu được bằng phương pháp được mô tảtrong một nghiên cứu trước đây Sau đó, RNA cạn kiệt ribo được định lượng bằng máy

đo huỳnh quang Qubit™ 4 với bộ xét nghiệm RNA HS Qubit™ và được bảo quản ở nhiệt

độ -80 °C cho đến khi sử dụng

3.1.2 Quan sát các hạt virus bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Các hạt virus được quan sát bằng TEM trong các mẫu hoa lan Phalaenopsis bằng phương pháp nhuộm âm tính trực tiếp Các mẫu lá hoa lan Phalaenopsis được trộn với

đệm phosphate theo tỷ lệ 1:1 và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Hỗn hợp được ly tâm ởtốc độ 12.000 vòng/phút trong 20 phút và phần dịch trong được sử dụng để phân tíchTEM Các mẫu đã chuẩn bị được cố định trên lưới đồng (Electron Microscopy Sciences,Hatfield, PA, Hoa Kỳ), nhuộm âm tính bằng 1% amoni molybdate (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, Hoa Kỳ) và phân tích các hạt virus bằng TEM (200 kV; JEOL Ltd., Tokyo,Nhật Bản) tại Trung tâm Cơ sở Nghiên cứu của Đại học Quốc gia Chonnam

3.1.3 Chuẩn bị thư viện Nanopore và giải trình tự ONT

Thư viện được tạo ra bằng cách sử dụng bộ giải trình tự cDNA trực tiếp DCS109) kết hợp với gói Flongle Starter (Oxford Nanopore Technologies, Oxford,Vương quốc Anh) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và các phương pháp đã mô tả trước

(SQK-đó Hỗn hợp thư viện được nạp vào một cell dòng chảy Flongle R9.4.1 (FLO-FLG001)

và giải trình tự được thực hiện trên thiết bị MinlON của Oxford Nanopore Technologies.Cell dòng chảy đã chạy trong 24 giờ, được quản lý thông qua phần mềm MinKNOW(phiên bản 21.11.7) Việc gọi cơ sở theo thời gian thực của các lần đọc kết quả được thực

hiện bằng chế độ có độ chính xác cao (điểm chất lượng là 7) trong Guppy (phiên bản5.1.12) trong phần mềm MinKNOW.

3.1.4 Phân tích tin sinh học

Các tệp FASTQ được gọi là cơ sở đã được chuyển đổi thành các tệp FASTA bằngGeneious Prime (phiên bản 21.1.1) và các trình tự bộ điều hợp sau đó đã được xóa khỏiphần cuối cắt Để xác thực các trình tự của virus thực vật, một sự kết hợp của các phươngpháp đã được sử dụng Điều này bao gồm việc sử dụng quy trình làm việc FASTQ

"What's in my Pot?" (WIMP) trong EPI2ME Agent (phiên bản 3.4.2) và tiến hành tìmkiếm BLASTn (-outfmt 6) so với dữ liệu bộ gen virus của Trung tâm thông tin công nghệsinh học quốc gia (NCBI), cụ thể là Cơ sở dữ liệu RefSeq virus (VirDB) (phiên bản21.11.4) Để xác định các trình tự virus thực vật, các lần đọc trình tự đã được căn chỉnhvới các bộ gen virus thực vật thể hiện điểm BLAST đáng kể, được xác định bằng các lượttruy cập hàng đầu thu được từ các tìm kiếm BLASTn của NCBI Sự căn chỉnh này đã đạtđược bằng cách sử dụng công cụ "Ánh xạ đến tham chiếu" trong Geneious Prime với cáccài đặt mặc định, cụ thể là Độ nhạy trung bình/nhanh, cuối cùng dẫn đến các trình tựđồng thuận

3.1.5 Phân tích phát sinh loài

Đối với phân tích phát sinh loài, trình tự gene protein vỏ hoàn chỉnh (CP) của cácloại virus đã xác định được căn chỉnh với trình tự gene CP của các phân lập khác thuđược từ NCBI BLASTn Việc căn chỉnh được thực hiện bằng Trình chỉnh sửa căn chỉnhtrình tự BioEdit (phiên bản 7.0.5.3) với căn chỉnh nhiều ClustaIW Sau đó, các cây phátsinh loài có độ tin cậy tối đa được tạo ra bằng MEGAX (phiên bản 10.2.4), sử dụng môhình thay thế nucleotide Tamura–Nei Độ tin cậy của cây phát sinh loài được đánh giábằng cách tính toán các giá trị bootstrap dựa trên 1000 bản sao

3.1.6 RT-PCR để xác nhận

RT-PCR được sử dụng để xác nhận sự hiện diện của virus thực vật được xác địnhthông qua giải trình tự ONT trong mỗi thư viện Tổng RNA được khuếch đại bằng hỗnhợp RT-PCR SuPrimeScript (Genet Bio, Daejeon, Hàn Quốc), theo các giao thức củanhà sản xuất Tất cả các sản phẩm RT-PCR được giải trình tự bằng giải trình tự Sanger vàcác trình tự sau đó được xác minh bằng tìm kiếm BLASTn

3.1.7 Tính khả dụng của dữ liệu

Các tệp FASTQ được tạo cho mỗi thư viện trong nghiên cứu này đã được lưu trữtrong kho lưu trữ NCBI Sequence Read Archive (SRA) trong cơ sở dữ liệu NCBIBioProject, trong khi các trình tự virus thực vật đã được xác định đã được gửi vàoGenBank, mỗi trình tự được gán một số hiệu truy cập duy nhất.

3.1.8 Thiết kế mồi RT-RPA và chuẩn bị crRNA

Các đoạn mồi RT-RPA được thiết kế tỉ mỉ trong vùng CP có độ đặc hiệu cao củaNELV bằng cách sử dụng PrimedRPA, và tuân theo các hướng dẫn được cung cấp trong

sổ tay TwistDX RPA (TwistDX, Ltd., Cambridge, Vương quốc Anh) RNA CRISPR(crRNA) nhắm vào vùng liền kề với mô típ liền kề protospacer (PAM) trong đoạnkhuếch đại RT-RPA của NeLV được thiết kế theo các nguyên tắc thiết kế đã được thiếtlập Để tổng hợp crRNA, ban đầu T7-crRNA-F và NeLV-crRNA bị biến tính trong 5 phút

và sau đó được ủ bằng cách giảm dần nhiệt độ theo mức giảm 1 °C từ 95 °C xuống 20 °C.Sau đó, crRNA được tổng hợp bằng cách sử dụng oligo đã ủ làm khuôn mẫu, theo hướngdẫn của Bộ phiên mã năng suất cao TranscriptAid T7 (Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, Hoa Kỳ), với thời gian ủ ở 37 °C trong 4 giờ CrRNA tổng hợp được tinhchế bằng bộ RNA Clean and Concentrator-5 (Zymo Research, Irvine, CA, Hoa Kỳ) vànồng độ crRNA tinh khiết được định lượng bằng Máy đo huỳnh quang Qubit TM 4 với

Bộ xét nghiệm RNA HS Qubit TM (Thermo Fisher Scientific) Sau đó, crRNA được sửdụng ở nồng độ cuối cùng là 1 μM

3.1.9 Chuẩn bị bản sao virus chuẩn

Bộ mồi được thiết kế cho gene NeLV-CP được sử dụng để tạo cDNA cho quá trìnhphiên mã in vitro tiếp theo Amplicon thu được sau đó được nhân bản bằng bộ dụng cụnhân bản T&A (Yeastern Biotech, Đài Loan) theo giao thức được cung cấp Phiên mã invitro được thực hiện bằng T7 RNA polymerase (Promega, Madison, WI, Hoa Kỳ) Nồng

độ của bản sao NeLV-CP được xác định bằng máy quang phổ (BioDrop) và bản sao đượclưu trữ ở nhiệt độ –80 °C để tiến hành thử nghiệm tiếp theo

3.1.10 Xét nghiệm RT-RPA-CRISPR/Cas12a

Phản ứng RT-RPA được thực hiện bằng Bộ TwistAmp Basic (TwistDx,Cambridge, Vương quốc Anh) Tóm lại, hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị với thể tíchcuối cùng là 50 μL, bao gồm 4,8 μL mồi xuôi và mồi ngược (10 μM), 1,2 μL chất ức chếRNase tái tổ hợp (40 U/μL) từ Takara (Kyoto, Nhật Bản), 1 μL enzyme phiên mã ngược