Luận án tiến sĩ hóa học: Tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và nghiên cứu điều kiện tối ưu để nhuộm tế bào phục vụ chẩn đoán bệnh ung thư bạch cầu người

ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRAN VĂN TÍNH

TONG HỢP CƠ CHAT, CHE TẠO KIT

LUAN AN TIEN SI HOA HOC

Hà Nội,2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRAN VAN TÍNH

TONG HOP CO CHAT, CHE TAO KIT

VA NGHIEN CUU DIEU KIEN TOI UU DE

NHUOM TE BAO PHUC VU CHAN DOANBENH UNG THU BACH CAU NGUOI

Chuyên ngành: Hóa hữu co

Mã số: 62 44 27 01

LUẬN ÁN TIỀN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HOC

1 PGS.TSKH Luu Van Béi

2 GS.TS Nguyén Anh Tri

HA NỘI - 2012

CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁNMỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN TÀI LIỆU

Tính chất phổ

Tính chất hóa học

Ứng dụng của các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit

Ung dung dé sản xuất phẩm màu

Sản xuât cơ chât đê nhuộm tê bào bạch câu

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIEM

Phương pháp nghiên cứu

Hóa chất và thiết bịHóa chất

Các dụng cụ và thiết bịPhần thực nghiệm

Điều chế các dẫn xuất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit

Điều chế các dẫn xuất este 3-(N-thé)naphtalen-2-yl cacboxylat

Tối ưu hóa phản ứng nhuộm esteraza bang phương pháp đơn hình

3437

2.3.4 Nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người bang các co chat este tong hoptheo kỹ thuật đã tối ưu hóa

2.3.5 Nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người bằng naphtol AS-OLa-clopropionat naphtol AS-OL

2.3.6 Pha chế kit nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người bằng các cơ chất

naphtol AS-OL œ-clopropionat tổng hợp được

2.3.7 Đánh giá thời gian ồn định của bộ kit

2.3.8 Ứng dụng bộ kit dé chan đoán dòng tế bao trong bệnh bạch cầu cấp2.3.9 Nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính

CHƯƠNG 3 KÉT QUÁ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Tống hợp 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit

3.1.1 Tổng hợp các naphtol AS-X bằng phương pháp truyền thống

3.1.2 Tổng hợp các naphtol AS-X băng phương pháp lò vi sóng

3.1.3 Tông hợp 3-hiđroxi-[N-(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxyl)]naphtalen

3.2 Tổng hợp 3-(N-thé-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat

3.3 Nghiên cứu nhuộm tế bào bach cầu bang các cơ chất tong hợp được

3.3.1 Nghiên cứu tối ưu hoá phản ứng nhuộm esteraza tế bào bạch cầu3.3.2 Nghiên cứu các yếu tô ảnh hưởng của cơ chất đến kết quả nhuộm3.4 Nghiên cứu mối tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc của các cơ

chất bang phương pháp tính hóa lượng tử

3.5 Nghiên cứu chế tao kit bằng cơ chất mới naphtol AS-OL a-clopropionat

3.5.1 Thành phần bộ kít cho 100 tiêu bản nhuộm

3.5.2 Tài liệu hướng dan sử dụng bộ kit naphtol AS-OL a-clopropionat

3.5.3 Đánh giá chất lượng bộ kít

3.5.4 Nghiên cứu thời gian bảo quản và sử dụng kít

3.5.5 Ung dụng bộ kit dé chân đoán dòng tế bao trong bệnh bach cấpKÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ

Danh mục các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án

Tài liệu tham khảo

136

Bảng 1.1.

Bảng 1.2.

Bảng 1.3.Bảng 1.4.Bang 1.5.Bang 2.1.Bang 2.2.Bang 2.3.Bang 2.4.Bang 2.5.Bang 3.1.

Bang 3.8.

Bang 3.9.

Bang 3.10.Bang 3.11.

Bang 3.12.

DANH MUC CAC BANG

Các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit đã được thương

Dữ liệu phô 'H-NMR của các naphtol AS-X

Ảnh hưởng của hiệu ứng điện tử các nhóm thế lên độ chuyên dịch

hóa học của các proton OH và NH

Kết quả tổng hợp, một số hang số hóa lý, phổ IR va ESI-MS của

3-hidroxi-N-( xiclohexyl/phenyl/1-naphtyl/1-antraxyl) 2-cacboxamit

naphtalen-Phổ 'H-NMR của 3-hiđroxi-N-(xiclohexyl/phenyl/1-naphtyl/

Kết quả tông hợp, một số hang số hóa lý, số liệu phô IR và

ESI-MS của các naphtol AS-X cloaxetat

Dữ liệu phố 'H-NMR của các naphtol AS-X cloaxetat

Kết quả tong hợp, một số hăng số hóa lý, số liệu phổ IR và

ESI-MS của các naphtol AS-X a-clopropionat

Số liệu phổ 'H-NMR của các các naphtol AS-X a-clopropionat

5961

Bảng 3.19.Bảng 3.20.

Bang 3.21.

Bang 3.22.Bang 3.23.Bang 3.24.Bang 3.25.

Bang 3.26.

Bang 3.27.Bang 3.28.

Bang 3.29.Bang 3.30.

Bang 3.31.

Kết qua tong hợp, một số hang số hóa lý, các dữ liệu phố IR va

ESI-MS của 3-(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxylcacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat

Số liệu phé 'H-NMR của 3-(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxylcacbamoy]l)naphtalen-2-yl cacboxylat

Kết quả tổng hợp, một số hang số hóa lý, các dữ kiện phố IR,

ESI-MS của naphtol AS-D và naphtol AS-OL cacboxylatPhổ 'H-NMR của các naphtol AS-D và naphtol AS-OL

Lựa chọn mức gốc thực nghiệm

Kết quả nhuộm theo phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm

đơn hình

Kết quả thí nghiệm lặp lại ở đỉnh tối ưu

Tính đặc hiệu của 26 cơ chất naphtol AS-X cloaxetat và

a-clopropionat đối với phản ứng nhuộm esteraza các loại bạch

cầu máu ngoại vi

Điểm nhuộm của các este naphtol AS-X cloaxetat

Điểm nhuộm của các este naphtol AS-X a-clopropionat

Tính đặc hiệu của các cơ chất Va-h đối với phản ứng nhuộmesteraza các loại bạch cầu máu ngoai vi

Kết quả nhuộm tế bao bạch cau băng các cơ chat este dãy Va-hTính đặc hiệu của các cơ chất có gốc cacboxylat khác nhau đốivới phản ứng nhuộm esteraza các loại bạch cầu máu ngoại vi

Kết quả nhuộm bang naphtol AS-D và AS-OL cacboxylat có các

gốc hiđrocacbon khác nhau

Kết quả các góc nhị diện thu được từ tính toán lượng tử va điểm

nhuộm thực nghiệm

Điểm nhuộm thực tế và điểm tính theo phương trình hồi quy

Kết quả theo dõi tính ôn định của bộ kit

Độ đặc hiệu của cơ chất naphtol AS-OL ơ-clopropionat và kít của

hãng Sigma đối với phản ứng nhuộm esteraza các loại bạch cầu

trong tủy.

Kết quả nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người bằng kit naphtol

AS-OL ơ-clopropionat tổng hợp được va kit naphtol AS-Dcloaxetat hang Sigma.

121

Hình 1.1.

Hình 1.2.Hình 2.1.

Hình 2.2.Hình 2.3.Hình 3.1.Hình 3.2.

Hình 3.3.

Hình 3.4.Hình 3.5.Hình 3.6.Hình 3.7.Hình 3.8.Hình 3.9.Hình 3.10.Hình 3.11.Hình 3.12.Hình 3.13.Hình 3.14.Hình 3.15.Hình 3.16.

Cửa số cài đặt dung môi và câu lệnh thêm vào

Phổ IR của 3-hidroxi-N-(2-metylphenyl)-, N-(4-metylphenyl)-,

Phố MS của hợp chat Id

Sắc kí bản mỏng của naphtol AS-D và sản phẩm phản ứng

Biểu diễn điểm của các đơn hình (S) trong quá trình tối ưu hoá

Ảnh nhuộm enzym esteraza bach cầu ở điều kiện tối ưu hoá vớicơ chất naphtol AS-D cloaxetat (Sigma-Aldrich)

Ảnh nhuộm esteraza bạch cầu bằng các cơ chất Ia và Ili

Ảnh nhuộm esteraza bạch cầu bằng naphtol cơ chất Ve và Vg

Kết quả nhuộm esteraza bạch cầu người bằng các cơ chất naphtol

AS-D và naphtol AS-OL cloaxetat và a-clopropionat

Góc nhị diện của nhóm cacboxylat

Biểu đồ biểu thị độ ổn định của bộ kit theo thời gian

Kết quả nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người băng các cơ

chất naphtol AS-OL a-clopropionat tổng hợp được và naphtol

AS-D cloaxetat hãng Sigma.

122

Dimetyl Sunfoxit

Uy ban Enzym (The enzyme commission )

Kỹ thuật miiễn dich gan enzym (Enzyme-Linked Immuno Sorbent

Assay )

Nhuộm Esteraza không đặc hiệu (Esterase).

Esteraza (Essterase)

Nhuộm Esteraza không đặc hiệu với chất ức chế là NaF.

Hội các nhà Huyết học Anh-Pháp-Mỹ (French-American-British)

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Fluorescen Polary Immuno

Hiệp hội Hóa sinh quốc tế (International Union of Biochemistry)

Bệnh bach cầu cấp dòng lympho đã biệt hóa (Acute lymphoblastic)Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho chưa biệt hóa (Acute

Bệnh bach cầu cấp dòng tuy không có tế bao trưởng thành (Acute

myeloblastic without maturation).

Bệnh bach cầu cấp dòng tuy có tế bào trưởng thành (Acute

myeloblastic with maturation).

Bệnh bach cau cấp dòng tiền tuy (Acute promyelocytic).

Bệnh bach cau cấp dong tuy-monoxit (Acute myelomonocytic).Bénh bach cau cap dong monoxit (Acute monocytic).

Bệnh bach cầu cấp dòng hồng cau (Erythroleukemia).

Bệnh bạch cầu cấp dòng tiểu cầu (Acute megakaryoblastic).

ARN thông tin (messenger RiboNucleic Acid)

Natri Florua

Naphtol AS (Naphthol AS)

Naphtol AS-D (Naphthol AS-D)

Nhuộm esteraza đặc hiệu (Naphthol AS-D chloroacetate)New Eindhoven Architectural synthesis Toolbox

N-Metyl Pyrolidinon

Nhuộm photphataza axit.

Nhuộm glucozit bằng thuốc thử Periodic Axit Schiff.

FAB thì được ký hiệu từ MO đến M7 và L1 đến L3 [16] Việc xếp loại đúng, nhanhchóng và chính xác thé bệnh có vai trò quyết định giúp cho bác sỹ lâm sàng áp dụngcác phác đồ điều trị có hiệu quả cho người bệnh Đặc biệt trong thé M3 có nguy cơchảy máu cao thì việc chân đoán nhanh chóng, chính xác còn có ý nghĩa quyết địnhđến sinh mạng bệnh nhân [6] Tiêu chuẩn FAB dựa trên kết quả xét nghiệm của baphương pháp là miễn dịch, đi truyền và nhuộm hóa học tế bào Phương pháp miễn

dịch và di truyền sử dụng các kỹ thuật đòi hỏi máy móc hiện đại đắt tiền và nguồn

lao động có trình độ cao Phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ gồm các kỹthuật nhuộm PAS, peroxidaza, nhuộm sudan B, photphataza axit, photphataza kiềm,esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu ức chế với NaF và không ức chế Esteraza đặchiệu chỉ có mặt trên các tế bào dòng tủy còn các dòng khác âm tính hoặc dương tínhvới cường độ rất thấp Esteraza không đặc hiệu có mặt ở nhiều dòng tế bào khácnhau nhưng ở dong monoxit thì bị ức chế bằng NaF Ngoài hai kỹ thuật nhuộm PASvà nhuộm Sudan dùng dé phát hiện glucozit và lipit thì sáu kỹ thuật còn lại là

nhuộm phát hiện enzym Do độ đặc hiệu còn thấp, việc phân loại dòng tế bảo theo

tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điềuchỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dich và di truyền Phương pháp xác định tế

bào thuộc dòng tủy dựa chủ yếu vào kết quả nhuộm peroxidaza và esteraza đặc

hiệu Kỹ thuật nhuộm peroxidaza thường không ồn định do dé bị phân hủy bởi ánhsang vi thé cần bồ sung thêm kỹ thuật nhuộm esteraza có độ ôn định hơn Hiện nay,cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu là naphtol AS-D cloaxetat được được hãng Sigmabán trên thị trường với giá thành rat cao (13 triệu/1 gam) Qua nghiên cứu tài liệu cóthé thấy, cơ chất naphtol AS-D cloaxetat được tổng hop theo phương pháp truyềnthống là ngưng tụ axit 3-hidroxi-2-naphtoic với o-toluidin, sau đó este hóa bằng

cloaxetyl clorua Phản ứng ngưng tụ cần thời gian dài, hiệu suất thấp; quá trình

chuyên hóa naphtol AS-D thành dẫn xuất cloaxetat hiệu suất cũng không ổn định.

10

Do việc nghiên cứu thiếu hệ thong nên chưa xác định được mối tương quangiữa cau trúc và hoạt tính, chưa tìm được cơ chất có độ nhạy và độ đặc hiệu cao

nhất Quá trình nhuộm chưa được tối ưu hóa gây khó khăn cho cán bộ thực hiện và

tốn kém cho bệnh nhân Nước ta chưa sản xuất được cơ chất, phải nhập ngoại Cơ

chất dé bị phân huỷ ở nhiệt độ > -20°C, là một trong những khó khăn lớn cho việc

vận chuyên và bảo quản Những thách thức đó đã làm cho phương pháp xét nghiệmnày chưa được triển khai rộng rãi ở Việt Nam.

Vi vậy, đề tài nghiên cứu tổng hợp cơ chất, chế tao kit và tối ưu hóa quytrình nhuộm esteraza đặc hiệu dé phân loại tế bào bạch cầu phục vụ việc khám và

điều trị bệnh ung thư máu có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế - xã hội sâu sắc.Mục tiêu của đề tài là xây dựng phương pháp mới, hiệu quả cao đề tổng hợpcơ chất; khảo sát một cách có hệ thống mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính để

tìm kiếm cơ chất mới có độ nhạy và tính đặc hiệu cao; tối ưu hóa các điều kiệnnhuộm và chế tạo kít nhuộm esteraza đề phân loại tế bảo phục vụ việc khám và điều

trị bệnh ung thư máu.

Nội dung nghiên cứu

I- Nghiên cứu tổng hop các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyênliệu điều chế cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu nguoi.

2- Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thé-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làmcơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu nguoi.

3- Xác định cấu trúc của các hop chất điều chế được bang các phương pháp vật lý

và hóa lý hiện đại (Phố IR, 'H-NMR và MS) và nghiên cứu mối tương quan giữa

độ nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc phân tử cơ chất bằng phương

cơ chất đến độ nhạy và độ đặc hiệu đối với phản ứng nhuộm esteraza.

6- Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm bằng phương pháp đơn hình và ứng dụngdé chế tạo bộ kit nhuộm esteraza dùng phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu

người từ cơ chất tong hợp được.

II

CHUONG 1 TONG QUAN TÀI LIEUHOA HỌC CAC HOP CHAT

3-HIDROXI-(N-THE)NAPHTALEN-2-CACBOXAMIT3-Hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit có cau trúc như sau:

R¿ là các vòng thom có các nhóm thế thường ở vị trí ocfo- hoặc

para-Các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit được ứng dụng rấtrộng rãi trong thực tiễn Trong công nghiệp chúng được dùng làm nguyên liệu đầu

dé sản xuất phẩm màu, đặc biệt là mực in Do quy trình sản xuất đơn giản, gam màuphong phú, độ bền cao, nên loại hợp chất này đã có lúc chiếm tỷ trọng rất lớn đốivới thị trường phẩm màu thế giới Vai trò của họ hợp chất này trở nên đặc biệt quan

trọng khi người ta sử dụng chúng làm nguyên liệu sản xuất cơ chất để nhuộmesteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người Do những ứng dụng quan trọng như vậy,nên loại hợp chất này đã thu hút sự quan tâm to lớn của các nhà khoa học Số côngtrình công bố trong lĩnh vực này rất lớn và đa dạng Trong khuôn khổ tổng quan nàychi đề cập các phương pháp tông hợp quan trọng, những tinh chất hóa lý cơ bản vàmột số ứng dụng phô biến liên quan đến họ hợp chất này.

1.1 Tổng hợp các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit

Theo tai liệu [45] người ta tổng hợp amit chủ yếu theo phương pháp trực tiếp một giai đoạn hoặc phương pháp gián tiếp

3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacbox-hai giai đoạn.

1.1.1 Phương pháp một giai đoạn

Phương pháp này lần đầu tiên được Schopf là nhà hóa học người Đức dùngdé tông hợp naphtol AS vào năm 1892 [45], dựa trên phan ứng ngưng tụ giữa axit

3-hidroxi-2-naphtoic với anilin có mặt PCl; Phương pháp nay còn được dùng cho

tới ngày nay với một số cải tiến, thay vì dùng PCI; vừa làm tác nhân vừa làm dungmôi, người ta tiến hành phản ứng trong các dung môi dé tăng hiệu suất sản pham[11] Đây còn được gọi là phương pháp tông hợp trực tiếp Quá trình phản ứng đượcmô tả trên sơ đồ 1.1.

12

Phan ứng được thực hiện bằng cách khuấy hỗn hợp của anilin, axit

3-hiđroxi-2-naphtoic va một lượng dư PCI, trong dung môi hữu cơ như clobenzen hoặc toluen

ở nhiệt độ thấp, thường là dưới 40°C, tốt nhất là từ 0°C đến 25°C Khi phản ứng xảyra, nhiệt độ sẽ tự tăng lên trên 40°C Đề đuổi HCl người ta phải đun hỗn hợp ở nhiệtđộ 75°C đến 180°C trong thời gian vài giờ Hiệu suất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-

2-cacboxamit đạt từ 60-70%.

Theo phương pháp trực tiếp một giai đoạn, người ta còn có thể tổng hợp

3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit bằng cách cho axit 3-hidroxi-2-naphtoictác dụng với lượng dư SOCI; Sau khi khuấy 10 phút, người ta bắt đầu cho thêm danxuất anilin thế vào hỗn hợp [14] Dung môi sử dụng trong phương pháp này làaxetonitrin Quá trình phản ứng được mô tả trên sơ đồ 1.2.

Sơ đồ 1.2

OH PCI;/SOCI; NH

+ ——>

OH OH

Tuy nhiên trong quá trình thêm anilin thé vào hỗn hợp, HCI tach ra từ SOCI;

phản ứng rất mãnh liệt tạo kết tủa phenylamoni clorua làm cho hiệu suất (N-thé)naphtalen-2-cacboxamit thu được rất thấp.

3-hiđroxi-13

1.1.2 Tổng hợp 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit bằng phương pháp

hai giai đoạn

Ngoài phương pháp một giai đoạn, 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit

còn được tông hợp bằng phương pháp gián tiếp hai giai đoạn [10, 33, 35].

Trong giai đoạn 1, người ta tiến hành phan ứng giữa axit

3-hiđroxi-2-naphtoic với SOCI; dé điều chế sản phẩm trung gian 3-hiđroxi-2-naphtoyl clorua.

Phan ứng được mô tả trên sơ đồ 1.3.

Sơ đồ 1.4

COCI — Anlin re)

— -HỢOH

Do naphtoyl clorua dé phân huỷ trong không khí, nên phản ứng phải được

thực hiện trong điều kiện bảo ôn rất nghiêm ngặt Hiệu suất phản ứng này cũng

không cao, chỉ khoảng 60%.

Kock-Yee Law và cs [59] đã thực hiện phản ứng hai giai đoạn theo cách khác.

Ở giai đoạn một, các tac giả đã đun hỗn hợp 2,8-dihidroxi-3-naphtoic với phenol cómặt xúc tác ngưng tụ là POC; ở 125°C, dưới áp suất khí nitơ Dé tránh phản ứngphụ đối với nhóm 8-OH, lượng dư phenol đã được sử dụng vừa làm tác nhân vừa

làm dung môi Sau 2 giờ hiệu suất phenyl 2,8-dihidroxi-3-naphtoat đạt 76% Ở giaiđoạn 2, tiến hành đun hồi lưu hỗn hợp phenyl 2,8-đihiđroxi-3-naphtoat và các dẫn

xuất anilin thế tương ứng ở 250°C trong dung môi là N-metyl pyroliđinon (NMP)dưới áp suất nitơ Sau 2 giờ hiệu suất N-thé-2,8-dihidroxinaphtalen-3-cacboxamitđạt trên 89% Quá trình phan ứng được mô tả trên sơ đồ 1.5.

14

3-Hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit là những chat ran có nhiệt độ nóng

chảy 6n định và nhiệt độ sôi tương đối cao [45], như có thé thấy trên bang 1.1 Tùy

theo nhóm thế trong vòng benzen mà 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có

độ phân cực khác nhau, chúng gần như không tan trong nước, nhưng tan hoàn toànwt >

trong các dung môi hữu cơ như clobenzen, THF, DMF, DMSO

Bang 1.1 Các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit đã được thương mại hóa

ễ : "

Naphtol AS thé Rị R, R; R¿ | Tne(C) | Ts(°C)Naphtol AS H H H H 247 494,0

Naphtol AS-D CH; H H H 194 399,7

Naphtol AS-OL | OCH; | H H H 162 421,0

Naphtol AS-LT H H | CH; | H 220 436,8

Naphtol AS-E H H Cl H 264 416,5Naphtol AS-MX CH; H | CH; | H 226 412,5

15

1.2.2 Tính chất pho

Phổ IR: Các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit có ba dao động hóa trị

đặc trưng có cường độ mạnh [36] Một dao động của nhóm vC=O amit ở vùng

1695-1700 cm'!, dao động thứ hai của nhóm vNH amit ở vùng ~3400 cm’ và thứ ba

là dao động của nhóm vOH ở ~3500 em” Do trong phân tử của các (N-thé)naphtalen-2-cacboxamit chứa đồng thời nhóm OH và NHC=O có kha năngtạo liên kết hidro nội phân tử, nên tần số đao động các nhóm vyy Và Voy CÓ thé giamxuống đáng ké.

3-hiđroxi-Phổ MS: Vì cau trúc phân tử không phức tạp, nên nhìn chung phô MS của các

3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit tương đối đơn giản Dưới tác dụng củachùm điện tử, xác suất phân mảnh cao nhất sẽ xảy ra tại liên kết amit và phân tử sẽtạo thành hai gốc chính, sau đó tiếp tục phân huỷ tạo thành những mảnh nhỏ hơn.Phổ MS của naphtol AS-D có 5 đỉnh chính, đỉnh thứ nhất có số khối m/z = 277

tương ứng với ion phân tử chưa phân mảnh Dưới tac dụng của chùm điện tử đã liên

kết amit bị cắt đứt tạo thành hai mảnh ion m/z = 171 và 106, sau đó mảnh ion với sốkhối 171 tiếp tục phân huỷ tạo thành hai mảnh ion với m/z = 143 va 115 như sơ đồ

Phổ 'H-NMR: độ chuyền dịch hóa học của các proton trong các dẫn xuất

3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit xuất hiện ở ba vùng chính [46] Ở vùng từtrường yếu nhất là cộng hưởng của proton nhóm OH ở ~11,80 ppm và nhóm NH ở

~10,60 ppm, cộng hưởng của các proton vòng naphtyl ở vùng 7,60-8,70 ppm và các

proton vòng phenyl ở vùng 7,20-7,50 ppm Độ chuyền dich hóa học của các protonvòng naphtyl ít thay đổi, trong khi đại lượng này của các proton vòng phenyl phụ

thuộc vao ban chất của các nhóm thế X Nhóm thé đây điện tử sẽ làm tăng mật độđiện tử trong vòng phenyl và độ chuyên dịch hóa học của các proton sẽ chuyên vềphía trường mạnh và ngược lại.

16

1.2.3 Tính chất hóa học

Các phân tử 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit có chứa hai nhóm chức

chính là CO-NH và —OH Là những phân tử có nhiều trung tâm phản ứng, chúng có

thể tham gia các chuyên hóa khác nhau Trước hết, nhóm hiđroxyl đây điện tử làmdé dàng cho phản ứng thé ái điện tử vào vòng naphtyl, đặc biệt là nguyên tử cacbon

C¿ Thứ 2 là bản thân nhóm -OH dễ tham gia phan ứng este hóa Thứ 3 là nhóm

amit có thể bị anion hóa trong môi trường kiềm mạnh và bị axyl hóa băng các tác

nhân axyl halogenua.a) Phan ứng este hóa

Phan ứng este hóa trực tiếp các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit bằngcác axit cacboxylic thường cho hiệu suất thấp (40-50%) Vì vậy, để điều chế cáceste của chúng người ta thường tiến hành theo phương pháp kinh điển Schotten-Baumamn được mô tả trong nhiều tài liệu hữu cơ cơ bản [4, 5, 107], tức là cho cácdẫn xuất naphtol tác dụng với clorua axit hoặc anhiđrit axit hữu cơ trong môi trườngkiềm hoặc piridin như mô tả trên sơ đô 1.6.

17

với cloaxyl clorua tạo thành sản phẩm este 3-(N-thé-cacbamoyl)naphtalen-2-yl boxylat (sơ đồ 1.8).

Các sản phẩm este 3-(N-thé-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat hiện dang

được bán trên thị trường dưới có tên thương mại là naphtol AS-thé khác nhau:

-X -R Tén san pham

-H -H Naphtol AS axetat

-H -Cl Naphtol AS cloaxetat-CH; -H Naphtol AS-D axetat

-CH; -Cl Naphtol AS-D cloaxetat

b) Sự anion hóa trong môi trường kiểm mạnh

Hiệu suất este phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện tiến hành phản ứng Thứ

nhất phải thực hiện ở nhiệt độ thấp dé tránh phân huỷ sản phẩm este Thứ hai lànồng độ NaOH không quá cao (<5%) Nếu nồng độ NaOH > 5%, nhóm hiđroxyl sẽtan công vào nhóm amit tạo ra dinatri aminnolat theo sơ đồ 1.9, muối này sẽ kết tủa

làm cho hiệu suất este giảm xuống [45].

Sơ đồ 1.9

C ) R KS SQ NaOH, THF/60-90°C LY XY,

O O~Na

OH ONa

c) Phan ứng diazo hóa

Như đã nói ở trên, các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit dé tham giaphản ứng thé ái điện tử Phan ứng được nghiên cứu ty my và có ứng dụng thực tiễnrộng rãi nhất là điazo hóa ở nguyên tử cacbon C¿ (sơ đồ 1.10).

18

Theo Herbst W [45] thi phan ứng này được A.Winter và các cộng sự tìm ra từ

năm 1911 và được dùng dé sản xuất các phẩm màu azo nguồn gốc hữu cơ có ứng

dụng đặc biệt rộng rãi trên thực tế.

1.3 Ứng dụng của các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit

1.3.1 Ứng dụng để sản xuất phẩm màu

Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của các 3-hidroxi-(N-thé)

naphtalen-2-cacboxamit là dùng làm tác nhân ghép đôi với các muối điazo dé sảnxuất phâm mau azo Trong các loại phẩm màu sản xuất từ 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit thì nhóm naphtol AS thé là phổ biến nhất Chúng rất phong

phú về chủng loại, chiếm lĩnh thị trường phẩm nhuộm nửa đầu thế ky 20 nhờ có phố

màu rộng từ vàng nhạt đến hồng, đỏ boocđô, đỏ son, nâu va tím Tuy theo cau trúc

phẩm mau naphtol AS thé được chia làm 2 nhóm Ở nhóm thứ nhất, tác nhân diazo

điều chế từ dẫn xuất cloanilin cho màu từ vàng đến đỏ tươi; còn từ dẫn xuất

clotoluiđin chủ yếu có màu đỏ ánh xanh; từ dẫn xuất nitrotoluiđin và nitroanisiđin

lại cho màu đỏ boocđô Bảng 1.2 dưới đây cho ta thấy màu sắc đa dạng của một số

phẩm màu được sản xuất từ naphtol AS [45, 115].

Bảng 1.2 Một số phẩm màu từ naphtol AS

19

TT R7 R* RÌ R! R> | R® Mau1 2 3 4 5 6 7 8

6 | NO, Cl H OCH; H H | Nau sam

7 | CH; H NO, H H | NO, | Do son8 | Cl Cl H CH; H H_ | Vang9 |CI H Cl OCH; H | OCH; | Nau

10 |OCH; | CONHC,H; | CH; Naphtyl Tim

Nhóm thứ IT

12 |H CONH; H OC;H; H H |Đỏ

13 | OCH; CONHC,H; H H H NO; | Đỏ ánh xanh

14 |CI SO;N(CH;); Cl OCH; H H_ | Vang nhạt

15 | OCH; CONHC,H; H CH; H Cl Đỏ ngọc

16 |OCH; |CONHC,H; H CH; H Cl | Hồng

17 |CI CONH; H |NHCOCH; | H H |Dacam18 |OCH; | CONHC,H; H OCH; Cl | OCH; | Đỏ son19 |OCH; |CONHC,H; | OCH; H H H | Tim

20 |OCH; |CONHC,H; | CH; H H H | Tim

20

Sự phong phú của phẩm màu naphtol AS chính là ở chỗ chúng tồn tại ở ítnhất là hai dang tinh thé có thể chuyển hóa lẫn nhau Các nhóm thế khác nhau trongnhân aryl của muối điazo có ảnh hưởng lớn đến tính chất của phẩm màu naphtol AS

thé Ví dụ như xét về khả năng hòa tan, phẩm màu naphtol AS thế nhóm I thường

tan kém hơn so với nhóm II Sunfoamit và cacbonamit (nhóm II) tạo thành dung

dịch một cách nhanh chóng mặc dù cau trúc của chúng đồ sộ hơn rất nhiều so vớinhững naphtol AS thế nhóm I.

Khả năng tan trong dung môi (cũng như xu hướng chuyên hóa giữa hai dạngtồn tại) quyết định tính chất và ứng dụng của các loại phẩm màu Có những môi

trường trong đó phẩm màu có khả năng chuyên từ dạng bị phai màu mạnh sang

dạng không phai màu Số lượng các nhóm CONH càng nhiều thì khả năng tan củaphẩm màu càng tốt, không phụ thuộc vào cấu trúc của nó (bảng 1.3).

Bảng 1.3 Mối tương quan giữa độ tan và cấu trúc phâm màu [45]

Số nhóm | Độ tan trongCONH etyl axetat

ow `

4 NH, os ro 3 Tan tốt

Các phẩm mau naphtol AS thé được dùng rat rộng rãi, trong đó có ba lĩnhvực chủ yếu là mực In, sơn mạ và nhựa [45] (bảng 1.4).

Bảng 1.4 Các lĩnh vực ứng dụng của phẩm màu naphtol AS

Lĩnh vực | Mucin | Sơn,mạ | Nhựa | Dệt | Nhuộm sợi Giấy Khác

% 53 23 12 4 3 2 3

Trong lĩnh vực mực in, phẩm mau naphtol AS chiếm khoảng hon 50% tônglượng tiêu dùng của thé giới Lĩnh vực mà phẩm màu naphtol AS cũng được sửdụng không ít là công nghiệp mạ và sơn Các loại nhựa thường dùng phẩm màunaphtol AS thé là PVC, polystyren, polyeste Các phẩm màu được sử dụng thườngtan tốt trong dầu (dung môi hữu cơ) và có độ bền cao trong điều kiện khắc nghiệt.

1.3.2 Sản xuất cơ chất để nhuộm tế bào bạch cầu

Một ứng dụng quan trọng có tính đột phá của các 2-cacboxamit là dùng làm tiền chất tổng hợp các este 3-(N-thế-cacbamoyl)

3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-naphtalen-2-yl cacboxylat dé làm cơ chất cho phản ứng nhuộm hóa học tế bào Đặcbiệt trong phân loại thé bệnh bach cầu cấp 3-(N-thế-cacbamoyl) naphtalen-2-ylcacboxylat được sử dụng làm cơ chất cho phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu bạch

cầu người Thực chất đây là một phản ứng thủy phân dưới xúc tác của esteraza tạothành các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit tương ứng Hop chất này sẽ

được ghép đôi với muối điazo để tạo thành phẩm màu azo tại các vùng có chứa

enzym trong bào tương của tế bào Phương pháp nhuộm esteraza đặc hiệu giúp phânloại thể bệnh dòng tủy với các dòng tế bào khác theo tiêu chuẩn FAB, phục vụ điều

trị bệnh ung thư máu.

1.3.2.1 Giới thiệu về esteraza trong tế bào bạch cầu

Theo phân loại của tiểu ban enzym (EC) thuộc Hội Hóa sinh quốc tế (IUB),

esteraza là một enzym hidrolaza thuộc nhóm cacboxylesteraza (E.C.3.1.1.1) [101]

22

xúc tác các phản ứng thủy phân este cacboxylat thành axit và ancol, trong môi

trường nước được gọi là sự thủy phân:

Este cacboxylat + H;O = ancol + cacboxylat

Trong tế bào bạch cầu người, esteraza được chia làm hai nhóm là esterazađặc hiệu và không đặc hiệu Sở dĩ được gọi là esteraza đặc hiệu vì nó chỉ có trong

các tế bào dòng tủy từ nguyên tủy bào đến bạch cầu trung tính, các dòng tế bào khácâm tính Esteraza không đặc hiệu có ở nhiều loại tế bào khác nhau, như bạch cầumast, bạch cầu mono, bạch cầu trung tính nhưng khi ức chế băng NaF thì chỉ có

esteraza trong bạch cầu mono bị giảm hoạt tính, không hiện màu trong phản ứngnhuộm hóa học tế bảo bằng xúc tác bởi esteraza Dựa vào tính chất khác nhau trongquá trình nhuộm esteraza này mà các nhà Huyết học Pháp-Mỹ-Anh (FAB) [16] đãđề ra tiêu chuẩn phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy và các dòng tế bào khác.

Esteraza có mặt ở hầu hết các mô trong cơ thé Hàm lượng esteraza cao nhấtlà trong các tế bào thực bảo, sau đó đến tế bảo gan, ruột, dạ dày, phối, tiền liệt tuyến,tụy và ít nhất là trong tế bao não Trong tế bao, esteraza thường phân bố chủ yếu

trong lưới nội nguyên sinh chat, máy golgi, lysosom va màng tế bào [53, 90, 102].

Esteraza là một enzym serin có tâm hoạt động được cấu tạo bởi axit amin Ser

đóng vai trò nucleophin, axit amin His đóng vai trò bazơ và một axit amin thứ 3,

đóng vai trò axit là Asp Ở một số isoenzym thì Asp được thay bang Glu và vì théesteraza còn được gọi là enzym có tâm hoạt động theo cơ chế Ser-His-Asp/Glu [80,

Esteraza là nhóm enzym không đồng nhất về mặt cấu trúc [104] Các côngtrình công bố gần đây cho thấy trong các tô chức khác nhau thì esteraza có cấu trúc

khác nhau Trọng lượng phân tử từ 19.500-180.000 dalton (Da) [81, 83] Kích thước

của enzym vào khoảng 2-3 A Bằng kỹ thuật sắc ký cột sephadex Kaphalia và c.s

[58] đã xác định được esteraza gồm 2 chuỗi có trọng lượng phân tử là 60kDa và

phan kia là 180 kDa Phan 180 kDa là một trimer và bị ức chế bởi diisopropyl

flophotphat trong các phản ứng nhuộm, tức nó thuộc loại B esteraza (bị ức chế bởi

hợp chất florua) [52, 78] Về mặt điện tích thì esteraza là một enzym mang điện tíchâm và các isoenzym nam trong vùng dang điện (pl) từ 5,5-6,1 [94] Nhiều isoenzymcó tính đặc hiệu khá cao cho từng dòng tế bào và có thể coi nó như một giá trị thamchiếu để nhận dạng dòng tế bào SM Gignac và c.s [38] bằng phương pháp điện diđã tìm ra 5 isoenzym khác nhau của esteraza đặc hiệu cho các tế bảo máu, làesteraza mono 1/mono 2 tìm thấy trong các tế bào bạch cầu mono; My 1/My 2 dòngtủy, bệnh đa u tủy, dòng hồng cầu, dòng tiêu cầu; Lym 1/Lym 2 trong tế baolympho và cuối cùng là Unc trong tế bào chưa biệt hóa Như vậy có thể khang định

esteraza là một tập hợp gồm nhiều isoenzym không đồng nhất Bằng phương phápsắc ký điện di Scott và c.s [87] đã thu được esteraza tinh khiết từ các tế bào bạch

cầu dòng tủy và tìm ra hai isoenzym của esteraza A và B Hai isoenzym này thường

có mặt trong các bào quan của cả hai dòng bạch cầu đoạn và bạch cầu mono Nhiều

công trình nghiên cứu gần đây cũng cho thấy hai isozym này khác nhau về sự ứcchế bởi nhiệt độ và NaF [20, 27, 84, 90].

Năm 1991, bằng kỹ thuật Northern blot, Zschunke F và c.s [114] đã giải mã

ARN thông tin (mARN) tinh khiết chiết xuất từ tế bào bạch cầu mono và đã tìm ra

cấu trúc bậc 1 của enzym này gồm 503 axit amin Trên ban đồ gen người, esterazabạch cầu được mã hóa trên nhiễm sắc thê thứ 16 Trọng lượng phân tử là 60kDa và

bị ức chế bởi diisopropyl flophotphat nồng độ 2 mM Tác giả cũng chi ra sự giốngnhau đến 90% về cấu trúc của esteraza bạch cầu với esteraza ở microsome của tếbào gan Các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn của enzym đang tiếp tục được

nghiên cứu [87].

1.3.2.2 Phản ứng thủy phân este

Esteraza xúc tác cho quá trình thủy phân các este thành axit cacboxylic vaancol Các este này có thê là các este béo, este vòng thơm [44, 77] Đây là phản

ứng phô biên trong mọi tê bào, đặc biệt trong chuyên hóa các chât nội và ngoại sinh.

24

Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy các gốc Ser, His, Glu, Asp va Gly ở trong tâm

hoạt động của esteraza có vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác phản ứng thủy

phân este Điều này được minh chứng băng sự sụt giảm khả năng xúc tác trong phảnứng thủy phân este của enzym khi thiếu một hoặc một số axit amin nêu trên ở các

esteraza phân lập được [53].

Hiện nay, nhiều hợp chất được sử dụng làm cơ chất cho phản ứng nhuộmesteraza đặc hiệu bạch cầu người, trong đó phố biến nhất là naphtol AS axetat vànaphtol AS-D cloaxetat Cơ chế của phản ứng thủy phân các cơ chất này dưới tác

dụng của esteraza bạch cầu người xảy ra theo sơ d6 1.11 [23, 61, 78, 101].Sơ đồ 1.11

Day là phan ứng thủy phân dưới xúc tac của enzym nên nó đòi hỏi phải có

những điều kiện phù hợp với từng isoenzym như pH, nhiệt độ, dung dịch đệm Dac

biệt, cấu trúc của phân tử cơ chất (este) phải phù hợp với tâm hoạt động của enzym

như “6 khóa và chìa khóa” thi phan ứng mới diễn ra thuận lợi (hình 1.6).

25

Cơ chế xúc tác của esteraza được trình bay trên sơ đồ 1.12 [52].Sơ đồ 1.12

Glu His Glu His

Sơ đồ 1.12 cho thấy cơ chế của quá trình thủy phân xúc tác bởi esteraza gồm

các bước như sau:

1- Sự tạo thành phức hợp enzym - cơ chất, phân tử cơ chất được định hướng chính

xác và phù hợp vao tâm hoạt động của enzym.

2- Quá trình cắt đứt liên kết este được bắt đầu với việc nguyên tử oxi của nhómhiđroxi (axit amin Ser 230) tan công nucleophin vào nguyên tử cacbon (nhóm

cacbony]l) cua este.

3- Hình thành liên kết tứ diện giữa Oxi - Hidro (Ser) - O - C (este) và được bền hóanhờ liên kết hiđro của ba axit amin His, Gly, Glu Hình tứ diện này được gọi là“Oxianion hole” Tiếp theo là bước cắt đứt liên kết este bằng cách chuyên vịproton của Ser vào nhóm imidazol tạo thành ion His Phần axyl bị đứt ra củaphân tử este lập tức liên kết với enzym tạo thành phức axyl-enzym Phần ancol

26

được bền hóa nhờ liên kết hiđro với axit amin His và như vậy liên kết este đã bị

thủy phân hoàn toàn.

4- Một phân tử nước bị phân cực đo tạo liên kết hiđro với axit amin Asp sẽ tấn công

vào liên kết axyl-enzym và hình thành góc tứ diện thứ hai đồng thời giải phóng

phần ancol của phân tử cơ chất.

Proton của His được chuyển cho nguyên tử oxi của Ser dé giải phóng phanaxit của phân tử cơ chất và enzym trở lại cấu hình ban đầu sẵn sàng cho phản ứngxúc tác thủy phân tiếp theo.

Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra tính đa dạng trong hoạt động xúc tác

của esteraza ở các tê bao đê tham gia vào các chức năng sinh lý chủ yêu như sau:

- Chức năng chuyên hóa: esteraza tham gia vào các chu trình Krebs sinh

năng lượng, chu trình xitric dé tạo axyl - Co A, điều hòa chuyên hóa lipit và nhiều

chu trình chuyên hóa khác [28, 37, 47].

- Chức năng của hệ thần kinh: Trong tế bào thần kinh esteraza có mặt tronglưới nội nguyên sinh chất và xúc tác cho phản ứng thủy phân tạo temocapril,p-nitrophenyl axetat là các chất trung gian dẫn truyền tín hiệu thần kinh [78, 100].

- Chức năng chuyên hóa thuốc và thải độc: Esteraza có khả năng tham gia

vào chuyên hóa thuốc đặc biệt là các tiền được thông qua phản ứng thủy phân Lợidụng tính chất này, các nhà nghiên cứu dược đã sản xuất thuốc theo công nghệhướng đích Ngoài ra chúng còn giúp phân huỷ các sản phẩm chuyên hóa thuốctrung gian độc đối với co thé và vì vậy chúng cũng là nguyên nhân giảm hoạt tính

và tác dụng của nhiều loại thuốc khác nhau [40, 51, 73, 82, 113].

- Chức năng miễn dịch: Esteraza đóng vai trò quan trọng trong hệ thống

miễn dịch bảo vệ cơ thể băng cách xúc tác phản ứng thuỷ phân các dị nguyên [62,111] Shiotsuki và c.s dùng lipopolysaccharide của vỏ vi khuẩn E Coli tiêm vào tô

chức hạch, sau 6 giờ nồng độ của isoenzym của esteraza hCE-1 và hCE-2 tăng lên

rõ rệt [88] Như vậy các di nguyên như vỏ vi khuẩn, các độc tố chính là các chấtcảm ứng đã kích thích quá trình tổng hợp esteraza trong tế bào Trong bạch cầu,esteraza đã được chứng minh là tham gia trực tiếp vào việc thủy phân các dị nguyênxâm nhập vào co thé theo cơ chế kích hoạt bổ thé C3 [106].

27

1.3.2.3 Phương pháp phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB

Ung thư máu gồm nhiều thé bệnh Việc chân đoán đúng thé bệnh có vai tròquyết định trong việc điều trị Chính vi vậy dé thống nhất việc xếp loại thé bệnh

trong bệnh bạch cầu cấp, năm 1976 các nhà Huyết học Phap-My-Anh đã nhất trixây dựng tiêu chuẩn xếp loại thé bệnh bạch cầu cấp dùng trong chân đoán cũng như

phương pháp điều trị được gọi tắt là tiêu chuân FAB Năm 2001, WHO đã đưa rabảng xếp loại riêng, nhưng phương pháp xếp loại FAB vẫn được dùng phô biếntrong các cơ sở nghiên cứu và chữa bệnh [74] Tiêu chuẩn của FAB dựa trên baphương pháp: miễn dịch (marker), di truyền và hóa học tế bao [16, 20, 50, 90].

Phương pháp marker chủ yếu phát hiện các dấu ấn miễn dịch trên tế bào bạch cầunhư CD4, CD8, CD34 Hiện nay kỹ thuật marker kết hợp phương pháp phân tích

dòng chảy đã giúp cho việc nâng cao độ chính xác của việc chan đoán các thé bệnhbạch cầu cấp [3, 7, 8] Phương pháp di truyền phát hiện các kết quả đột biến hoặcđảo đoạn của các nhiễm sắc thê Phân tích đột biến dựa trên kỹ thuật PCR và giảitrình tự gen đã nâng cao rõ rệt độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này [6, 15].

Đối với phương pháp hóa học tế bào thì tiêu chuẩn FAB dựa vào các kết quả nhuộm

28

Như đã thay trong bang 1.5, nhuộm esteraza đặc hiệu bach cau người sử dungcơ chất naphtol AS-D cloaxetat có thé phân loại được dòng tủy với các dòng khác.

1.3.2.4 Các phương pháp nhuộm esteraza

a) Nhuộm hóa học tế bào phát hiện esteraza

Esteraza xúc tac cho phản ứng thủy phân liên kết este của co chat tạo thành

các ancol và axit tương ứng Ancol phản ứng với các chat thích hợp dé tạo ra cácchât màu Sự có mặt của các chât màu chứng tỏ có esteraza ở tê bào nghiên cứu.

Một số phương pháp chính dựa trên nguyên lý của kỹ thuật này là:- Phương pháp kết tủa muối kim loại

Được sử dụng lần đầu tiên bởi Gomori [39] nhằm phát hiện ATPaza,esteraza, lipaza nhờ sự kết tủa muối của sản pham thủy phân cơ chất là glycerol

photphat, glycin hoặc 8-hidroxiquinolin glucoronat với ion Ca**, sau đó muối nàyđược chuyên thành muối CoS có màu đen Do quá trình xử lý với cơ chất qua nhiều

giai đoạn và ion canxi dé tan trong nước nên phản ứng có độ nhạy kém Đến nayhầu hết các phòng xét nghiệm không còn sử dụng kỹ thuật này [29, 108].

- Phương pháp sử dụng phẩm màu indigo

Phương pháp do Barrnet, Seligman [14] áp dụng và phát triển nhằm phát

hiện esteraza trong tế bào Indigo và dẫn xuất của nó bị thủy phân tạo ancol sau đótiến hành oxi hóa đóng vòng tạo indigo có màu cham Day là một phương pháp cóđộ nhạy, độ đặc hiệu khá cao Các chất 5-bromoindoxil, 5-bromo-4-cloindoxil lànhững chất phù hợp nhất cho phản ứng nhuộm theo cách này Đây là một phươngpháp có rất nhiều triển vọng do các hợp chất chứa indoxil tăng nhanh chóng nhờ

công nghệ hóa dầu [29, 43, 46, 75].

- Phương pháp sử dụng phẩm màu azo

Theo Catovsky [20] thì phương pháp này do Menten, Junge và Green nghiên

cứu và phát triển dựa trên phản ứng ghép đôi dẫn xuất ancol thơm (từ cơ chat este bịthủy phân do xúc tác esteraza) với mudi diazo tạo thành phẩm màu azo Mau tạivùng có enzym phụ thuộc vào cấu trúc của muối điazo sử dụng Đây là phươngpháp tốt nhất trong các phương pháp nhuộm hóa học tế bào đơn thuần do có độnhạy và độ đặc hiệu rất cao Cơ chất sử dụng phô biến trong kỹ thuật này là dẫnxuất œ hoặc B-naphtol axetat hay butyrat Trong đó dạng ơ- tốt hơn, do tan it trong

dung dịch nước nên khả năng kêt tua tại vùng có enzym cao hon Các dan xuât

29

œ- hoặc B-naphtol được giải phóng ra từ sự thủy phân cơ chat este lập tức ghép vớimuối diazo có trong dung dịch nhuộm tạo phẩm azo có màu đỏ hoặc màu đen Nhờ

xuất hiện màu trên vùng enzym mà ta có thể xác định được có hay không có

esteraza [27, 39, 90, 105].

Co chế phản ứng nhuộm bằng naphtol AS cacboxylat trải qua hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: esteraza bạch cầu người thủy phân cơ chat este tạo thành dan

xuất của naphtol AS thé chứa nhóm -OH như sơ đồ 1.13.

Trong đó: X¡: -H, -CH3; X¿: -Cl và X:: —CHạ (Fast red violet LB base);

Xa, X3: -OCH; (Fast blue BB salt).

mau azo xanh den hoặc màu dé theo sơ đồ 1.14.

Sơ đồ 1.14

Nếu muối diazo sử dung fast red violet LB thì hợp chất azo tạo ra có mau đỏcòn fast blue BB thì có màu xanh đen.

Phương pháp nhuộm esteraza được chia làm hai loại: nhuộm esteraza đặc

hiệu và nhuộm esteraza không đặc hiệu Nhuộm esteraza đặc hiệu dùng dé phan loaitế bao dòng tủy còn nhuộm esteraza không đặc hiệu dùng dé phân loại tế bao dongmono theo tiêu chuan FAB [16].

Cho dén nay, CƠ chat nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bach cầu người vẫn lànaphtol AS-D cloaxetat và chủ yếu được hãng Sigma Aldrich hoặc Merck bán trên

thị trường Do độ đặc hiệu còn thấp, việc phân loại dòng tế bao theo tiêu chuẩn

FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều chỉnh tới 29,7%

nhờ vào kỹ thuật miễn dịch và di truyền [8].

30

b) Nhuộm hóa học tế bào kết hợp với phương pháp phân tích dòng chảy

Nguyên ly là tiến hành nhuộm esteraza trong các tế bao máu, sau đó cho cáctế bào này đi qua một khe đếm có chiếu một chùm tia laser hẹp, do tính chất bắtmàu khác nhau của tế bào mà chùm laser bị lệch đi một góc nhất định Nhờ các

sensor mà máy có thể nhận dạng được các tế bào cần phân tích Kỹ thuật này chophép tự động hóa quá trình phân tích [19, 93].

c) Nhuộm hóa học tế bào kết hợp với hóa miễn dịch, hóa phát quang vàphương pháp phân tích dòng chảy

Đây là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất Kỹ thuật dùng kháng

thé đơn dòng kẹp giữa cơ chất và chất đánh dau theo kiểu bánh Sanwich Chất đánh

dấu là các chất màu theo nguyên lý ELISA hay chất phát quang theo nguyên lý

FPIA Kỹ thuật này có độ nhạy cao nhất khi kết hợp với kính hiển vi điện tử hayphương pháp phân tích dòng chảy [91, 99, 110, 112] Ngoài ra, để phát hiện vùngcó enzym theo cơ chế trung gian tiếp nhận (receptor-mediated mechanism) tại bềmặt của các tiêu bào quan, người ta sử dụng các kháng thê đơn dòng của chuột hoặc

thỏ có gắn chất đánh dấu như chất màu huỳnh quang hoặc các đồng vị phóng xạ

chống lại một nhóm cấu trúc đặc hiệu (receptor) của esteraza tạo một phản ứngkháng nguyên - kháng thé Qua kính hién vi điện tử có gắn các thiết bị phát hiện cácchất đánh dau có thé phát hiện vùng có esteraza Bang kỹ thuật này S Medda và c.s

[70] đã phát hiện ra esteraza trong ống lumen của lưới nội nguyên sinh chất của tế bào.d) Kit nhuộm esteraza tế bào

Hiện nay toàn bộ các vật liệu dé nhuộm hóa học esteraza đã được các công tynhư Merck hoặc Sigma Aldrich sản xuất thành các kít thương phẩm Các bộ kítnhuộm esteraza thường dựa vào phản ứng tạo thành phâm màu azo Thanh phần bộkít được chia làm 3 bộ phận chính, là dung dịch cố định, dung dịch cơ chất và dung

dịch nhuộm nhân Quá trình nhuộm tiến hành tuần tự theo các bước sau đây:

- Dung dịch cô định enzym và giữ nguyên hình thái của tế bào

Đây là bước quan trọng quyết định ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu củacủa kỹ thuật nhuộm Nếu cố định không tốt thì sẽ làm mắt hoặc biến tính enzym gâymất hoạt tính dẫn đến giảm độ nhạy Ngoài ra việc cỗ định còn giúp giữ nguyênhình thái của tế bào, không gây trương phông cũng như co tế bào làm sai lệch kếtquả sau khi nhuộm Quá trình cố định tế bào thường bao gồm 2 bước: trước hết là

31

có định enzym bằng các phan ứng hóa học, bước hai là dehidrat hóa làm khô tế bao.Dung dịch cé định thường dùng là các dung môi như ancol, andehit và axeton Cácdung môi này có thé dùng dạng đơn chất hoặc hỗn hợp trong dung dịch đệm.Phương pháp cố định có thể bằng cách phủ trực tiếp lên tiêu bản, nhúng tiêu bảntrong bình chứa các chất cô định hoặc bay hơi bão hòa Gần đây, các nghiên cứu vềchất có định đã tìm được những công thức pha chế các chất cô định đa thành phan

trong dung dịch đệm cho phép dùng cho nhiều kỹ thuật nhuộm enzym Thời gian cố

định tiêu bản máu đã giảm xuống còn 30 giây - 1 phút [15, 22, 56, 71, 72].- Dung dịch cơ chất:

Dung dịch nhuộm bao gồm cơ chất và các muối điazo để tạo màu với sảnphẩm của quá trình thủy phân cơ chat este Trong phương pháp nhuộm có tạo pham

màu azo thì thành phần của cơ chất gồm các este là dẫn xuất của naphtol AS hoặc

AS thé Muối diazo thường sử dụng là fast blue hoặc fast red, khi ghép đôi với

naphtol AS hoặc AS thế sẽ tạo hợp chất azo có màu đỏ hoặc màu đen [109] Thànhphần quan trọng thứ ba là dung dịch đệm, thường là hệ dung dịch photphat hoặc

tris-photphat Tuy theo loại enzym mà chọn hệ đệm với pH thích hợp dé enzym cannhuộm có thê hoạt động xúc tác tốt nhất cho phản ứng.

- Dung dịch nhuộm nhân và màng tế bào:

Chat màu dùng dé nhuộm nhân tế bào đòi hỏi phải cho màu tương phan vớimàu nhuộm enzym dé khi đọc kết quả được thuận lợi và chính xác Ví dụ, nhuộm

enzym màu đen thì dung dịch nhuộm nhân có mau đỏ; enzym màu đỏ, vàng thì

dung dịch nhuộm nhân màu đen Các chất màu nhuộm nhân cũng như nhuộmenzym đòi hỏi phải là màu rõ ràng và màu nhuộm nhân là màu có độ tỉnh khiết caodé không che lap màu enzym Các chất màu nhuộm nhân va màng tế bào phổ biếnhay sử dụng trong kỹ thuật nhuộm hóa học tế bao là hematoxylin, nuclear fast red

Tóm lại, kết qua phân tích tai liệu cho thấy, sử dụng cơ chất trên cơ sở este của

3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit (naphtol AS thế cacboxylat) dé nhuộmesteraza là một thành tựu quan trong trong kỹ thuật phân loại tế bao bach cầu người.

Phương pháp này dễ thực hiện, giá thành rẻ, có thé dùng để khám và chữa bệnh cho

đa số bệnh nhân có thu nhập không cao.

Tuy nhiên, như đã đề cấp ở trên, việc sử dụng phương pháp này còn bị hạn chếvì một số nguyên nhân sau đây: một là, cho đến nay việc tổng hợp naphtol AS thếđang được thực hiện theo phương pháp truyền thống, mất nhiều thời gian, tốn năng

32

lượng, hiệu suất thấp, nên giá thành sản phẩm cao; thứ hai, do việc nghiên cứu chưa

có hệ thống, nên chưa tìm được mối tương quan có tính quy luật giữa cấu trúc vớiđộ nhạy và tính đặc hiệu của cơ chất, chưa tìm được cơ chất có tính năng tốt nhấtcho quá trình nhuộm esteraza đặc hiệu; ba là, quá trình nhuộm chưa được chuẩn hóa

kỹ thuật tại Việt Nam Ngoài ra cơ chất rất dễ phân hủy ở nhiệt độ trên -20°C, là

một khó khăn lớn cho quá trình vận chuyền va bảo quản Tất cả các yếu tố trên lànguyên nhân gây nên sự sai lệch về kết quả phân loại dòng tế bào trong bệnh bạchcầu cấp khi sử dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào so với các phương pháp

miễn dich và di truyền (29,7%), hạn chế việc áp dụng kỹ thuật này trong các khoa

Huyét học- Truyên máu ở nước ta.

Vì vậy “Tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và nghiên cứu điều kiện tối ưu đểnhuộm tế bào phục vụ chan đoán bệnh ung thư bạch cầu người” là dé tài có ý nghĩa

khoa học, thực tiên và kinh tê - xã hội sâu sac.

33

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp tông hợp hữu cơ;

- Phương pháp vi sóng trong tổng hợp các chất hữu cơ;- Phương pháp Vật lý và Hóa lý xác định cau trúc;

-Phương pháp kế hoạch hóa thực nghiệm và thống kê xử lý số liệu;- Phương pháp nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào;

- Phương pháp FAB phân loại dong tế bào;

- Phương pháp tính toán Hóa lượng tử Gaussian 2003.

Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu nghiên cứu:

- Mẫu máu người khỏe mạnh được lựa chọn từ người đến khám sức khỏe tại Bệnh

viện 19-8, Bộ Công an dùng trong ba nghiên cứu sau:

+ Tối ưu hóa kỹ thuật esteraza đặc hiệu bạch cầu người;

+ Nhuộm esteraza bằng cơ chất mới tổng hợp;

+ Đánh giá độ ôn định của kit điều chế.

- Mẫu tủy 20 bệnh nhân bị bệnh bạch cầu cấp đã biết dòng tế bao bạch cầu ung thư

được dùng để đánh giá mức độ phù hợp của kết quả phân loại dòng tế bào sửdụng kit chế tạo với cơ chất naphtol AS-OL ơ-clopropionat tông hợp được và kit

nhuộm hãng Sigma dùng cơ chất naphtol AS-D cloaxetat.

2.2 Hóa chất và thiết bị2.2.1 Hóa chất

- Naphtol AS-D cloaxetat 98%, sản phâm của Sigma Aldrich;- Focmandehit 36,5% loại ACS, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Axit 3-hidroxi-2-naphtoic 98% loại P, sản phâm của Sigma Aldrich;- 2-cloaxetyl clorua 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- 2-clopropionyl clorua 97%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;- 2-cloaxetyl phenyl clorua 97%, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- 2-clobutyryl clorua 97%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;- Butyryl clorua 98%, loại P, sản pham của Sigma Aldrich;

- Nuclear fast red dùng nhuộm nhân và hồng cau, sản pham của Sigma Aldrich;- Axeton 99,5%, loai ACS, san pham cua Sigma Aldrich;

34

- Xyclohexylamin 99,5%, loại PA, sản phẩm cua Sigma Aldrich;- Anilin 99,5%, loai PA, san pham cua Sigma Aldrich;

- I-naphtylamin 98%, loại P, san pham của Sigma Aldrich;- 1-aminoantraxen 90% loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;- 2-bromanilin 98%, loai P, san phẩm của Sigma Aldrich;

- 4-bromanilin 97%, loai P, san pham cua Sigma Aldrich;- 2-cloanilin 98%, loai P, san pham cua Sigma Aldrich;

- 4-cloanilin 98%, loai P, san pham cua Sigma Aldrich,;- 2-nitroanilin 98%, loai P, san pham cua Sigma Aldrich;- 4-nitroanilin 98% loại P, san pham cua Sigma Aldrich;- o-Anisidin 99%, loại P, san pham cua Sigma Aldrich;

- p-anisidine 99% loại P, san pham của Sigma Aldrich;

- o-Toluidin 99%, loại P, san pham cua Sigma Aldrich;- p-Toluidin 99%, loại P, sản pham của Sigma Aldrich;

- Metyl-2-aminobenzoat 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Metyl-4-aminobenzoat 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;- Na;HPO¿ 99%, loại P, san phẩm của Sigma Aldrich;

- KH,PO, 99%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Axit Xitric 99%, loại P, san pham cua Sigma Aldrich;

- Natri Xitrat 99%, loai P, san pham cua Sigma Aldrich;- THF 99%, loai P, san pham cua Sigma Aldrich;

- PC]: 97%, loại P, san pham cua Sigma Aldrich;- Pyridin 98%, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Thionyl clorua 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich;

- Muối diazo: Fast blue RR salt, sản pham cua Acros;

- DMF 99,5%, loại PA, sản phẩm của Labosi;- Etanol 99,9%, loại PA, sản phẩm của Merck.

Tất cả những hóa chất trên được dùng ngay không phải tinh chế lại.35

2.2.2 Các dụng cụ và thiết bị

Do nhiệt độ nóng chảy trên máy Stuard STP3, Anh quốc, phòng thí nghiệm Hữu

co III, khoa Hóa học, trường Dai học KHTN- ĐHQGHN.

Sắc ký bản mỏng được thực hiện với bản mỏng làm từ silicagel 60 F254 trángtrên lá nhôm của hãng Merck (Đức) , hiển thị bằng iốt.

Lò vi sóng Q Pro M cai đặt nhiệt độ chính xác tới ÚC.

Pho hồng ngoại (IR) được do trên máy:Y GX của hãng PerkinElmer (Mỹ)

ĐHQGHN; 400-10.000cm; mẫu

tại khoa Hóa học, trường Dai học

KHTN-được ép viên với KBr.

v SIGNA của hãnh Nicolet, Viện Hóa học -Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam; 600-4000 cm `; mẫu được ép viên với KBr.

Phổ khói lượng (MS) được ghi trên máy:

¥ LC-MSD-Trap-SL của hãng Agilent Technologies (Mỹ), Viện Hóa học -Viện

Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

v¥ GC-MS phân giải cao (EI, 70ev) của hãng Micromass Waters, Khoa Hóa học,

trường Đại học KHTN-DHQGHN.

v«x LC-MS-ORBITRAP-XL của hãng Thermo Scientific (Mỹ), tại Khoa Hóa học,

trường Đại học KHTN-DHQGHN.

- Phổ cộng hưởng từ ghi trên máy: ADVANCE Spectrometer (Bruker 500Mv), tan

số 500MHz, tại Viện Hóa hoc -Viện Khoa học va Công nghệ Việt Nam; dungmôi DMSO-d6; chất chuẩn nội TMS.

The nghiệm hoạt tính sinh học:

Y Cân các chất bằng cân phân tích Shinko độ chính xác 10', tại Bệnh viện 19-8.

Y Do pH dung dich bang máy InoLab pH 730, CHLB Đức, độ chính xác 10°, tạiBệnh viện 19-8.

Y U nhiệt tiêu bản nhuộm bằng máy Stat-Fax 2200, hãng Awareness Technology

INC, USA, 0-50°C, độ chính xác 4+0,1°C, tại Bệnh viện 19-8.

Y Soi tiêu bản bằng kính hiển vi hai mat Nikon với độ phóng đại 1.000 lần, tạiBệnh viện 19-8.

Y Kit nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người của hang Sigma số 91C-1KT lô

090M4337, tại Bệnh viện 19-8.

36

2.3 Phần thực nghiệm

2.3.1 Điều chế các dẫn xuất 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit

2.3.1.1 Điều chế naphtol AS (IIb) bằng phương pháp trực tiếp

Hòa tan 2 g axit 3-hidroxi-2-naphtoic (10,4 mmol) trong 12 ml axetonitrin,

thêm 0,04 ml SOCI, (10,52 mmol), khuay trong 10 phút; sau đó cho 0,97 g anilin

(10,4 mmol) vào hỗn hop phản ứng Khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, sau đó cấtloại dung môi rồi hòa tan hỗn hợp trong dung dịch NaOH, lọc bỏ cặn không tan.Kết tủa naphtol AS băng dung dịch HCI loãng, kết tinh lại trong cồn Hiệu suất IIb

đạt 0,507 g (18,5%), nhiệt độ nóng chảy 246 - 247°C (246-248 ”C [24) Sắc ký trênbản mỏng (benzen : etylaxetat = 7 : 3) có một chấm (Rf= 0,74).

2.3.1.2 Điều chế naphtol AS (IIb) bằng phương pháp gián tiếp

Giai đoạn 1: tong hợp 3-hidroxi-2-naphtoyl clorua

Hòa tan 2 g axit 3-hidroxi-2-naphtoic (10,4 mmol) trong 15 ml ete dau hỏa,thêm 0,04 ml SOCI; (10,52 mmol) và 0,01 ml pyridin khuấy trong 10 phút; sau đóđun hồi lưu trên nồi cách thủy trong 4h Lọc kết tủa pyridin hidroclorua Sau đó catloại dung môi, đuổi SOCI, dư dưới áp suất thấp Sản pham thu được có nhiệt độ

nóng chảy 87-89°C Sắc ký trên bản mỏng (benzen : etylaxetat = 7 : 3) có một chấm

(Rf = 0,82) chứng tỏ đủ độ tinh khiết dé thực hiện các chuyên hóa tiếp theo.Giai đoạn 2: tổng hợp naphtol AS

Nhỏ từ từ dung dịch 3-hidroxi-2-naphtoyl clorua trong 5 ml dioxan ở trên vào

0,97 g anilin (10,4 mmol), khuấy hỗn hợp phản ứng trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.Thêm 10 ml nước cất lạnh vào, lọc kết tủa, kết tinh lại trong cồn Hiệu suất IIb đạt

0,878 g (32%), nhiệt độ nóng chảy 246 - 247°C Sắc ký trên bản mỏng (benzen :

etylaxetat = 7 : 3) có một chấm (Rf = 0,74).

2.3.1.3 Điều chế naphtol AS-D (Ia) bang phương pháp truyền thong một giai đoạn

a) Quy trình chung: Tỷ lệ axit 3-hidroxi-2-naphtoic : o-toluidin : PC]: là 1: 1: 0,3Hòa tan 2 g axit 3-hidroxi-2-naphtoic (10,4 mmol) và 1,118 ml o-toluidin(10,4 mmol) vào 16 ml clobenzen khan Nhỏ từ từ dung dịch 0,281 ml PCI; (3,125

mmol) trong 3,5 ml clobenzen vào hỗn hợp phản ứng Sau khi nhỏ giọt hết PCl:,đun hồi lưu hỗn hợp trong thời gian 3 giờ Trong suốt thời gian đó HCI bay ra vànhiệt độ phản ứng tăng lên, dao động trong khoảng 130-135°C Khi HCI hết bay ra,

cất loại clobenzen, làm lạnh từ từ đến nhiệt độ phòng Lọc kết tủa, kết tinh lại trong

37

cồn Hiệu suất Ia đạt 1,736 g (60,1%) Sắc ký trên bản mỏng (benzen : etylaxetat =

7: 3) có một cham (Rf = 0,72) Nhiệt độ nóng chảy 194 - 195°C (195 - 196°C [69]),

chứng tỏ sản phẩm Ia đủ tinh khiết dé tiến hành các bước tong hợp tiếp theo.

b) Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ các tác nhân đối với hiệu suất sản pham

bl) Tỷ lệ axit 3-hidroxi-2-naphtoic : o-toluidin : PCI; là 1 : 1 : 1 trongclobenzen Quá trình phản ứng thực hiện như quy trình chung (xem quy trình chung

2.3.1.3.a) Sau khi xử lý, hiệu suất sản phẩm naphtol AS-D đạt 1,675 g (58,0%), Sắc

ký trên bản mỏng (benzen : etylaxetat = 7 : 3) có một chấm (Rf = 0,72) Nhiệt độ

nóng chảy 194-195°C, chứng tỏ sản phẩm là hợp chất Ia.

b2) Lap lai phan ứng với tỷ lệ tác nhân 1:1:10 trong clobenzen Quá trình phảnứng thực hiện như quy trình chung (xem quy trình chung 2.3.1.3.a), nhưng không sửdụng dung môi Sau khi xử lý, hiệu suất sản phẩm đạt 1,441 g (50,1%) Sắc ký trên

bản mỏng (benzen : etylaxetat = 7:3) có một chấm (Rf = 0,72) Nhiệt độ nóng chảy

194-195°C, chứng tỏ sản phẩm là hợp chất Ia.

c) Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi đôi với hiệu suat sản phâm

cl) Tỷ lệ axit 3-hidroxi-2-naphtoic : ø-toluidin : PC]: là 1 : 1 trong điều kiện

không dung môi với 0,937 ml (10mmol) PC]; (xem thí nghiệm b2).

c2) Lặp lại phản ứng này với các điều kiện tương tự như quy trình chung

(2.3.1.3.a) trong dung môi axetonitrin ở nhiệt độ 82°C (nhiệt độ sôi của hỗn hợp).

Sau khi phản ứng kết thúc, lọc kết tủa, kết tỉnh trong cồn Hiệu suất sản phẩm đạt

0,719 g (22%) Sắc ký trên ban mỏng (benzen : etylaxetat = 7 : 3) có một cham

(Rf = 0,72) Nhiệt độ nóng chảy 195-196°C, chứng tỏ sản phẩm là Ia.

c3) Lặp lại phản ứng với các điều kiện tương tự như quy trình chung

(2.3.1.3.a) trong dung môi toluen ở nhiệt độ 117°C (nhiệt độ sôi của hỗn hợp) Sau

khi phản ứng kết thúc, lọc kết tủa, kết tinh trong cồn Hiệu suất sản phẩm đạt 1,496g(52%) Sắc ký trên bản mỏng (benzen : etylaxetat = 7 : 3) có một chấm (Rf = 0,72).

Nhiệt độ nóng chảy 195-196°C, chứng tỏ sản phẩm là hợp chất Ia.

38

d) Nghiên cứu ảnh hưởng quy trình xử lý nhiệt độ lên hiệu suất phản ứng

Hòa tan 2 g axit 3-hidroxi-2-naphtoic (10,4 mmol) va 1,118 ml o-toluidin ty

(10,4 mmol) vào 16 ml clobenzen khan Hỗn hop được khuay, lam lanh dén khoang10°C Nhỏ từ từ 0,281 ml dung dich PC]ạ (3,125 mmol) trong 3,5 ml clobenzen vàohỗn hop phan ứng, giữ nhiệt độ hỗn hop ở 10°C Khoảng 15 phút sau khi nhỏ giọt

hết PCl;, đun hồi lưu hỗn hợp trong thời gian ba giờ Nhiệt độ phan ứng tăng lên và

dao động trong khoảng 130-135°C Phản ứng kết thúc khi HCI bay hết, cất loại bớt

clobenzen, làm lạnh từ từ đến nhiệt độ phòng Lọc kết tủa, kết tinh trong cồn Hiệusuất sản pham đạt 2,016 g (69,8%) Sắc ký trên bản mỏng có một cham (Rf = 0,72;

benzen : etylaxetat = 7:3) Nhiệt độ nóng chảy 194-195°C, chứng tỏ sản phẩm là

hợp chat Ia.

Như vậy, bằng phương truyền thống thu được sản phẩm Ia với hiệu suất caonhất ở thí nghiệm 2.3.1.1.d với tỷ lệ axit 3-hidroxi-2-naphtoic : o-toluidin : PCI; là

1: 1: 0,3 và phản ứng được làm lạnh ở giai đoạn đầu trước khi đun hồi lưu.

2.3.1.4 Điều chế naphtol AS-D bằng phương pháp sử dụng lò vi sóng

a) Quy trình chung: Tỷ lệ axit 3-hidroxi-2-naphtoic : o-toluidin : PC]: là 1: 1 : 0,3

Hòa tan 1g axit 3-hidroxi-2-naphtoic (5,208 mmol) và 0,559 ml o-toluidin(5,208 mmol) vao 7 ml clobenzen, khuấy đều, làm lạnh đến 10°C Nhỏ từ từ dungdịch 0,141 ml PC]: (1,562 mmol) trong 1,75 ml clobenzen vào hỗn hợp Khuấy vàgiữ nhiệt độ hỗn hợp ở 10-25°C 15 phút Sau khi nhỏ hết PCI;, đun hồi lưu hỗn hợptrong lò vi sóng, công suất 200 w, nhiệt độ 135°C, thời gian 10 phút Phản ứng kết

thúc khi HCI bay hết, để nguội đến nhiệt độ phòng Lọc sản phẩm, kết tỉnh lại trongcồn Hiệu suất sản phẩm Ia dat 0,942 g (65,2%) Sắc ký bản mỏng có một cham

(Rf = 0,72, benzen : etylaxetat = 7 : 3) Nhiệt độ nóng chảy 194-195°C.b) Nghiên cứu anh hưởng của thời gian đối với hiệu suất phản ứng

b1) Phan ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự quy trình chung(mục 2.3.1.4.a), thời gian phản ứng trong lò vi sóng là 15 phút Sau khi xử lý hiệu

suất sản phẩm Ia đạt 1,118 g (77,5%) Sắc ký trên bản mỏng có một cham(Rf=0,72; benzen : etylaxetat = 7 : 3) Nhiệt độ nóng chảy 194-195C.

b2) Phản ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự quy trình chung

(mục 2.3.1.4.a), thời gian phan ứng trong lò vi sóng là 20 phút Sau khi xử lý hiệu

39

suất sản phẩm la đạt 1,166 g (80,8%) Sắc ký trên bản mỏng có một chấm

(Rf=0,72; benzen : etylaxetat = 7 : 3) Nhiệt độ nóng chảy 194-195.

b3) Phản ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự quy trình chung

(mục 2.3.1.4.a), thời gian phản ứng trong lò vi sóng là 20 phút, thời gian phan ứng

trong lò vi sóng là 30 phút Sau khi xử lý hiệu suất sản pham Ia đạt 1,168 g(80,9%) Sắc ký trên bản mỏng có một chấm (Rf = 0,72; benzen : etylaxetat = 7 : 3).

Nhiệt độ nóng chảy 194-195C.

c) Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi đối với hiệu suất phản ứng

cl) Phản ứng tiến hành trong các điều kiện tương tự quy trình (mục 2.3 I.4.a),

thời gian phản ứng trong lò vi sóng là 20 phút với dung môi axetonitrin Sau khi xử

lý, hiệu suất sản phẩm Ia đạt 0,449 g (31% ), nhiệt độ nóng chảy 194-195°C Sắc ký

trên bản mỏng có một chấm (Rf = 0,72; benzen : etylaxetat = 7 : 3).

c2) Phản ứng tiễn hành trong các điều kiện tương tự quy trình (mục 2.3.1.4.a),

thời gian phản ứng trong lò vi sóng là 20 phút với dung môi toluen Sau khi xử lý,hiệu suất sản phẩm Ia đạt 1,029 g (71% ), nhiệt độ nóng chảy 194-195°C Sắc ký

trên bản mỏng có một chấm (Rf = 0,72; benzen : etylaxetat = 7 : 3).

c3) Phản ứng tiễn hành trong các điều kiện tương tự quy trình (mục 2.3.1.4.a),

thời gian phản ứng trong lò vi sóng là 20 phút, không dùng dung môi Sau khi xử lý,

hiệu suất sản phẩm la dat 0,729 g (51%) Sac ký trên ban mỏng có một chấm

(Rf = 0,72; benzen : etylaxetat = 7 : 3) Nhiệt độ nóng chảy 194-195°C.

d) Nghiên cứu anh hưởng của ty lệ các tác nhân đối với hiệu suất san pham

d1) Phan ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự quy trình chung

(mục 2.3.1.4.a), thời gian phản ứng trong lò vi sóng là 20 phút, tỷ lệ axit

3-hidroxi-2-naphtoic : ø-toluidin : PCl; là 1: 1: 1 Sau khi xử lý hiệu suất sản phẩm Ia đạt1,010 g (70%) Sắc ký trên bản mỏng có một chấm (Rf=0,72; benzen : etylaxetat =

7: 3) Nhiệt độ nóng chảy 194-1959.

d2) Phản ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự quy trình chung

(mục 2.3.1.4.a), thời gian phan ứng trong lò vi sóng là 20 phút, tỷ lệ axit

3-hidroxi-2-naphtoic : o-toluidin : PCl; là 1 : 1 : 10 Sau khi xử lý hiệu suất sản phẩm Ia đạt

0,721 g (50%) Sắc ký trên bản mỏng có một cham (Rf=0,72; benzen : etylaxetat =

7:3) Nhiệt độ nóng chảy 194-195C.

d3) Tỷ lệ axit 3-hidroxi-2-naphtoic : o-toluidin : PCl, = 1: 1 : 0,3 (xem2.3.1.4.a).

40