Nhóm 4 th chuẩn Đoán bệnh thực vật bằng shpt

Nội dung 3: Thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea stewartii subsp.. Nội dung 4: Thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea stewartii subsp.. Nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH HỌC PHÂT TỬ

Tp Thủ Đức, tháng 12 năm 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH HỌC PHÂT TỬ

PGS.TS NGUYỄN BẢO QUỐC TRẦN KHÔI NGUYÊN – 21126432

NGUYỄN HOÀI AN – 21126267 HUỲNH KHÔI MINH UYÊN – 21126572BÀNG ĐỨC QUÂN – 21126476

TRẦN THỊ KIM NGÂN – 21126419

TP Thủ Đức, tháng 12 năm 2024

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH BẢNG iii

DANH SÁCH HÌNH iv

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu thực hiện 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về mít (Artocarpus heterophyllus Lam.) 3

2.2 Tổng quan về Pantoea stewartii subsp stewartii 4

2.3 Ly trích DNA vi khuẩn 6

2.4 Điện di tổng số 6

2.5 PCR DNA 16S 6

2.6 Phản ứng PCR 6

2.7 Nghiên cứu trong và ngoài nước 7

2.7.1 Nghiên cứu trong nước 7

2.7.2 Nghiên cứu ngoài nước 8

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 10

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 10

3.2 Nội dung 1: Ly trích DNA vi khuẩn Pantoea stewartii subsp stewartii và điện di tổng số DNA 10

3.2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 10

3.2.2 Phương pháp thực hiện 10

3.3 Nội dung 2: Thực hiện phản ứng PCR 16S và điện di sản phẩm PCR 16S 12

3.3.1 Vật liệu, thiết bị, hóa chất 12

3.3.2 Phương pháp thực hiện 12

3.3.3 Thực hiện phản ứng PCR 16S 12

3.3.4 Điện di 13

3.4 Nội dung 3: Thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea

stewartii subsp stewartii. 13

3.4.1.Dụng cụ 13

3.5 Nội dung 4: Thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea stewartii subsp stewartii được lấy trên bài báo. 14

3.5.1 Thiết bị và dụng cụ 14

3.5.2 Thành phần phản ứng PCR 14

3.5.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 15

3.5.4 Điện di 15

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

4.1 Nội dung 1: Ly trích DNA vi khuẩn Pantoea stewartii subsp stewartii và điện di tổng số DNA 16

4.1.1 Kết quả 16

4.1.2 Thảo luận 16

4.2 Nội dung 2: Thực hiện phản ứng PCR 16S và điện di sản phẩm PCR 16S 16

4.2.1 Kết quả 16

4.2.2 Thảo luận 17

4.3 Nội dung 3: Thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea stewartii subsp stewartii. 17

4.3.1 Kết quả 17

4.3.2 Thảo luận 17

4.4 Nội dung 4: Thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea stewartii subsp stewartii được lấy trên bài báo. 17

4.4.1 Kết quả 17

4.4.2 Thảo luận 18

TÀI LIỆU THAM KHẢO 19

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Thành phần của phản ứng 12 Bảng 3.2 Thành phần của phản ứng 13 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 15

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cây mít Artocarpus heterophyllus Lam .3

Hình 2.2 Vi khuẩn Pantoea stewartii trên môi trường thạch King’s B .5

Hình 3.1 Kết quả sau ly tâm .10

Hình 3.2 DNA và dung dịch STE .11

Hình 3.3 Kết quả sau khi ủ 1 giờ .11

Hình 3.4 Sau khi hút bỏ phần nổi ly tâm .11

Hình 4.1 Kết quả điện di tổng số .16

Hình 4.2 Kết quả điện di 16S .16

Hình 4.3 Kết quả điện di với mồi đặc hiệu .17

Hình 4.4 Kết quả điện di DNA mẫu A (nhóm 4, sáng thứ 6) .18

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây mít (Artocarpus heterophyllus Lam.) là một loại cây ăn quả phổ biến tại Việt

Nam, với diện tích trồng đạt hơn 80.000 ha vào năm 2023 Cây mít được trồng chủ yếu ởcác tỉnh miền Tây Nam Bộ, Đông Nam Bộ và khu vực Tây Nguyên, nơi có khí hậu nhiệtđới phù hợp Tiền Giang là địa phương có diện tích trồng mít Thái lớn nhất khu vựcĐồng bằng sông Cửu Long với tổng diện tích 13.141,09 ha (Võ, H T N 2023) Năngsuất bình quân đạt khoảng 15-20 tấn/ha/năm, góp phần đáng kể vào nguồn thu nhập củanông dân Cây mít không chỉ mang lại giá trị kinh tế lớn trong nước mà còn có tiềm năngxuất khẩu cao Trong năm 2022, tổng giá trị xuất khẩu mít của Việt Nam đạt khoảng 200triệu USD, với các thị trường lớn bao gồm Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc Các sảnphẩm từ mít bao gồm mít tươi, mít sấy khô và mít đóng hộp, trong đó mít tươi chiếm hơn70% tổng kim ngạch xuất khẩu

Gần đây, hiện tượng xơ mít bị đen do vi khuẩn Pantoea stewartii subsp stewartii

gây ra đã trở thành vấn đề nghiêm trọng đối với ngành trồng mít tại Việt Nam Bệnh nàylàm giảm chất lượng và giá trị thương mại của trái mít, ảnh hưởng lớn đến năng suất và

khả năng xuất khẩu Theo báo cáo từ Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam,

diện tích bị ảnh hưởng bởi bệnh xơ đen vào năm 2023 lên tới 15.000 ha, chiếm gần 20%tổng diện tích trồng mít Thiệt hại kinh tế ước tính khoảng 50 triệu USD/năm, gây khókhăn lớn cho người nông dân và ngành xuất khẩu

1.2 Mục tiêu thực hiện

Sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để chẩn đoán nhanh và chính xác tácnhân gây bệnh từ đó đưa ra biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Ly trích DNA vi khuẩn Pantoea stewartii subsp stewartii và điện di

tổng số DNA

Nội dung 2: Thực hiện phản ứng PCR 16S và điện di sản phẩm PCR 16S

Nội dung 3: Thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea

stewartii subsp stewartii.

Nội dung 4: Thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea

stewartii subsp stewartii được lấy trên bài báo.

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về mít (Artocarpus heterophyllus Lam.)

Phân loại khoa học:

Loài: Artocarpus heterophyllus Lam.

Hình 2.1 Cây mít Artocarpus heterophyllus Lam.

Cây mít (Artocarpus heterophyllus Lam.) là một loài cây ăn quả thuộc họ

Moraceae, có nguồn gốc từ Nam Á, đặc biệt là Ấn Độ, Bangladesh và Đông Nam Á.Đây là một trong những loại cây trồng lâu đời nhất ở khu vực nhiệt đới Tại Việt Nam,cây mít được trồng rộng rãi ở cả ba miền Bắc, Trung, Nam do khả năng thích nghi tốt vớiđiều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm và đất đai đa dạng

Cây mít là cây thân gỗ lớn, thường cao từ 8-25 m, đường kính thân lên tới 50 cm

Lá cây mít đơn, mọc cách, có phiến lá bầu dục hoặc thuôn dài, với mặt trên bóng và mặtdưới nhám Hoa mít thuộc loại hoa đơn tính cùng gốc, hoa đực và hoa cái cùng mọc trên

một cây Quả mít là dạng quả kép (compound fruit), có kích thước lớn nhất trong số các

loại cây ăn quả, có thể nặng từ 10-30 kg, thậm chí đạt trên 50 kg Mít là loại trái cây giàu

dinh dưỡng, chứa nhiều carbohydrate, vitamin A, vitamin C, kali, canxi, và chất xơ Tráimít được sử dụng để ăn tươi, chế biến thành mít sấy khô, mứt mít, nước ép, hoặc làmnguyên liệu trong các món ăn Ngoài ra, hạt mít giàu tinh bột, được luộc hoặc rang để ăn

Gỗ mít cũng có giá trị cao trong việc sản xuất đồ nội thất và nhạc cụ, đặc biệt là ở ĐôngNam Á Cây mít chủ yếu được trồng ở khu vực nhiệt đới, trong đó Việt Nam, Ấn Độ,Bangladesh, Thái Lan và Philippines là các nước trồng nhiều nhất Ở Việt Nam, cây míttập trung tại các vùng Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Đồng bằng sông Cửu Long, nơi cókhí hậu nóng ẩm quanh năm Loại mít phổ biến tại Việt Nam bao gồm mít thái, mít nghệ,mít tố nữ và mít dai, mỗi loại có giá trị kinh tế và đặc điểm sinh học riêng Trong văn hóaViệt Nam, cây mít được xem như biểu tượng của sự mộc mạc, gắn bó với làng quê Lámít thường được dùng trong các nghi lễ truyền thống, và quả mít được coi là biểu tượngcủa sự sung túc Ở một số quốc gia khác như Ấn Độ, mít còn mang ý nghĩa tôn giáo vàđược sử dụng trong các nghi lễ linh thiêng

2.2 Tổng quan về Pantoea stewartii subsp stewartii

Phân loại khoa học của vi khuẩn Pantoea stewartii subsp stewartii:

Giới: Bacteria (Vi khuẩn)

Loài: Pantoea stewartii

Phân loài: Pantoea stewartii subsp stewartii (Roper, 2011)

Hình 2.2 Vi khuẩn Pantoea stewartii trên môi trường thạch King’s B.

Pantoea stewartii subsp stewartii là vi khuẩn gram âm, có hình que, kích thước

dao động từ 0,5–0,8 µm x 1,0–3,0 µm Vi khuẩn này di động nhờ tiên mao và có khảnăng sống trong môi trường hiếu khí Trên môi trường nuôi cấy thạch dinh dưỡng, vikhuẩn hình thành các khuẩn lạc màu vàng nhạt đặc trưng do sản xuất sắc tố carotenoid(Roper, 2011)

Loại vi khuẩn này có khả năng tồn tại trong đất, nước, hoặc trên bề mặt lá cây kýchủ Nó xâm nhập vào cây chủ thông qua các vết thương cơ học hoặc qua các côn trùngtrung gian như Chaetocnema pulicaria (bọ nhảy ngô), gây ra triệu chứng đặc trưng nhưhéo lá, tổn thương mô cây, và làm thối hoặc đổi màu trái cây (Nadarasah & Stavrinides,

2011) Pantoea stewartii subsp stewartii được biết đến chủ yếu là tác nhân gây bệnh

Stewart's wilt trên cây ngô (Zea mays) Bệnh đen xơ trên mít Thái xuất hiện nhiều và gâythiệt hại lớn cho người trồng, song các thông tin về bệnh còn nhiều hạn chế Theo diễnbiến, bệnh đen xơ mít Thái xuất hiện từ lúc đậu trái đến thu hoạch, với tỷ lệ bệnh đạt caonhất 55,56% vào mùa khô và 88,89% vào mùa mưa vào giai đoạn 20 ngày sau đậu trái(Võ, H T N 2023) Khi xâm nhập, vi khuẩn phát triển trong mạch dẫn, làm nghẽn dòngchảy dinh dưỡng và nước, dẫn đến triệu chứng héo rũ và hoại tử mô Ở cây mít, bệnhthường biểu hiện bằng các xơ đen trên trái, làm giảm chất lượng thương mại Vi khuẩnphát triển mạnh ở nhiệt độ 25–30°C, đặc biệt trong điều kiện nóng ẩm của vùng nhiệtđới Độ ẩm cao và sự xuất hiện của côn trùng vector là yếu tố quan trọng làm gia tăngkhả năng lây lan và bùng phát dịch bệnh (Roper, 2011; Nadarasah & Stavrinides, 2011).Trong điều kiện nóng ẩm, vi khuẩn phát triển mạnh và gây triệu chứng héo rũ, tổn

thương mô cây, hoặc làm thối trái cây Gần đây, chúng đã được ghi nhận là tác nhân gâybệnh xơ đen trên trái mít ở Đông Nam Á, đặc biệt tại Việt Nam (Nguyễn Văn B, 2023).

2.3 Ly trích DNA vi khuẩn

Ly trích DNA là bước quan trọng và cần thiết để thu nhận DNA tinh sạch, phục vụcác phân tích di truyền hoặc nhận diện vi khuẩn bằng các kỹ thuật hiện đại như PCRhoặc giải trình tự gen Mục tiêu chính của ly trích DNA là tách rời DNA khỏi các thànhphần tế bào khác như protein, lipid, và RNA

Phương pháp thủ công truyền thống sử dụng các hóa chất phổ biến để phá vỡ cấutrúc tế bào và loại bỏ tạp chất:

 Dung dịch SDS (Sodium Dodecyl Sulfate): Đây là một chất tẩy mạnh giúpphá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA vào dung dịch (Green

& Sambrook, 2017)

 Phenol-Chloroform: Hỗn hợp này được sử dụng để loại bỏ protein vàlipid Phenol giúp tách protein ra khỏi DNA, trong khi chloroform tăngcường hiệu quả phân tách pha nước và pha hữu cơ

 Ethanol Precipitation: Sau khi loại bỏ tạp chất, ethanol được sử dụng đểkết tủa DNA, giúp thu được DNA ở dạng tinh sạch

Phương pháp này tuy hiệu quả và tiết kiệm chi phí, nhưng mất thời gian và yêucầu kỹ năng thực hành cao để đảm bảo DNA không bị tổn hại

2.4 Điện di tổng số

Điện di DNA tổng số trên gel agarose là một phương pháp quan trọng để kiểm trachất lượng và kích thước DNA sau khi ly trích Mục tiêu chính là đánh giá mức độ tinhsạch và sự nguyên vẹn của DNA

2.5 PCR DNA 16S

PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp quan trọng trong nghiêncứu vi sinh vật, cho phép khuếch đại một đoạn gen cụ thể từ mẫu DNA với độ nhạy và độđặc hiệu cao Trong trường hợp nghiên cứu vi khuẩn, gen 16S rRNA là một mục tiêu phổbiến nhờ khả năng cung cấp thông tin di truyền cần thiết để phân loại và nhận diện vikhuẩn ở cấp độ loài

2.6 Phản ứng PCR

PCR là viết tắt của cụm từ "Polymerase Chain Reaction" (Phản ứng chuỗipolymerase), là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để sao chép chính xác mộtđoạn DNA cụ thể từ một mẫu chứa rất ít DNA, và tạo ra nhiều bản sao của nó để có thểphân tích và nghiên cứu.

Trong PCR, một phản ứng hỗn hợp được chuẩn bị với các thành phần bao gồm:mẫu DNA, primers (một cặp oligonucleotide đặc hiệu cho chuỗi DNA cần sao chép),enzyme polymerase (thường là Taq polymerase) và nucleotide (đơn vị cấu tạo của DNA)

để tạo nên các chuỗi mới

Quá trình PCR bao gồm một chu trình lặp lại liên tục của ba giai đoạn: thủy phân(denaturation), ghép nối (annealing) và sao chép (extension) Trong giai đoạn thủy phân,mẫu DNA được nung nóng để phá vỡ liên kết hai mắt của nó và tách ra thành hai chuỗiđơn lẻ Trong giai đoạn ghép nối, primers được sử dụng để điều hướng enzymepolymerase đến vị trí phù hợp với chuỗi DNA cần sao chép Trong giai đoạn sao chép,enzyme polymerase sẽ tự động sao chép và tạo ra bản sao của chuỗi DNA, bắt đầu từ vịtrí của primer

Quá trình PCR được lặp lại nhiều lần, mỗi lần tăng số lượng bản sao của DNAgấp đôi, cho đến khi đạt được số lượng DNA cần thiết để phân tích PCR được sử dụngrộng rãi trong nhiều lĩnh vực như di truyền học, y học, thực phẩm và môi trường

2.7 Nghiên cứu trong và ngoài nước

2.7.1 Nghiên cứu trong nước

Vào năm 2023, Võ Thị Ngọc Hà đã thực hiện nghiên cứu nhằm điều tra hiệntrang bệnh đen xơ trên mít Thái tại tỉnh Tiền Giang thông qua phỏng vấn trực tiếp cácnông hộ và đánh giá diễn biến bệnh đen xơ trên mít Thái trong hai mùa chính của năm.Bệnh đen xơ trên mít Thái xuất hiện nhiều và gây thiệt hại lớn cho người trồng, song cácthông tin về bệnh còn nhiều hạn chế Bệnh đen xơ trên mít Thái xuất hiện ở tất cả vùngtrồng tại Tiền Giang cả hai mùa mưa và mùa khô, gây hại với tỷ lệ bệnh trung bình tạicác huyện được điều tra từ 5,29% đến 10,19% vào mùa khô và từ 25,43% đến 33,05%vào mùa mưa, tỷ lệ bệnh vào mùa mưa cao hơn mùa khô Một số hộ nông dân cho rằngbệnh đen xơ trên mít Thái có thể được nhận dạng qua triệu chứng bên ngoài ở màu sắc vàhình dạng cuống trái, mầu trái, hình dạng trái và gai, và được khẳng định bằng kết quảđiều tra diễn biến bệnh trong năm Phun thuốc và tuyển chọn trái sớm trong giai đoạn

nuôi trái có thể hạn chế sự gây hại của bệnh Theo diễn biến, bệnh đen xơ mít Thái xuấthiện từ lúc đậu trái đến thu hoạch, với tỷ lệ bệnh đạt cao nhất 55,56% vào mùa khô và88,89% vào mùa mưa vào giai đoạn 20 ngày sau đậu trái.

2.7.2 Nghiên cứu ngoài nước

Vào năm 2021, Abidin và các cộng sự thực hiện nghiên cứu biến thể gây bệnh của

vi khuẩn gây bệnh xơ đồng trên mít Pantoea stewartii phân loài stewartii đối với các giống mít và các cây ký chủ quan trọng tại Malaysia Nhiễm vi khuẩn Pantoea stewartii subsp stewartii, nguyên nhân gây bệnh "xơ đồng" trên mít, là một vấn đề lớn đối với

ngành công nghiệp mít ở Malaysia Nghiên cứu này được thực hiện để đánh giá mức độ

gây bệnh và khả năng gây hại của 28 chủng Pantoea stewartii subsp stewartii phân lập

từ trái mít bị bệnh xơ đồng, được thu thập từ bốn khu vực (Jenderam ở bang Selangor,Maran và Muadzam Shah ở bang Pahang, và Ipoh ở bang Perak) thuộc bán đảoMalaysia Các chủng vi khuẩn được tiêm vào các giống mít (Tekam Yellow J33, HongJ34 và Subang Chap Boy J39), giống ngô ngọt Mas Madu (cây con 2 tuần tuổi và 9 tuần

tuổi), giống dưa leo Rocky, và giống dứa MD2 Kết quả cho thấy Pantoea stewartii

subsp stewartii gây ra triệu chứng trên tất cả các loại cây trong thử nghiệm tính gây

bệnh, qua đó đáp ứng tiêu chuẩn của Koch, ngoại trừ trường hợp giống mít J39 và ngôngọt (cây con 2 tuần tuổi) Không xuất hiện triệu chứng bệnh (điểm số bệnh = 0) trêngiống J39 và ngô ngọt (cây con 2 tuần tuổi) trong vòng 14 ngày sau khi tiêm (14 dpi).Quá trình tiến triển của bệnh (dựa trên điểm số bệnh) chứng minh rằng giống mít J39 làgiống kháng bệnh tốt nhất, trong khi J33 và J34 nhạy cảm với bệnh xơ đồng Điểm sốbệnh trong giai đoạn 14 dpi cho thấy sự khác biệt về tiến triển bệnh giữa 28 chủng vikhuẩn Trong đó, chủng JEN-14 có mức độ gây bệnh nhanh và cao nhất khi được tiêmvào giống J33, J34, cây ngô ngọt 9 tuần tuổi, dưa leo và dứa Tương tự, giá trị AUDPC(diện tích dưới đường cong tiến triển bệnh) dựa trên điểm số bệnh từ 28 chủng cho thấyJEN-14 là chủng gây hại mạnh nhất và có ý nghĩa thống kê (đối với giống J33, J34, câyngô ngọt 9 tuần tuổi, dưa leo và dứa; p < 0.05) Mặc dù các chủng từ Jenderam (ngoại trừJEN-14) và Maran có điểm số bệnh và giá trị AUDPC tốt hơn các chủng từ MuadzamShah và Ipoh, không có sự khác biệt đáng kể nào giữa các chủng (p < 0.05) Dựa trên cácphát hiện này, nghiên cứu của Abidin và các cộng sự xác định chủng JEN-14 là ứng viêntiềm năng nhất để hỗ trợ trong chương trình lai tạo khả năng kháng bệnh xơ đồng trên