Nhóm 10 chuẩn Đoán bệnh thực vật bằng shpt

Sản xuất protein tái tổ hợp: Vì cây này có khả năng dễ dàng tiếp nhận và biểu hiện các gen ngoại lai, nó được sử dụng để sản xuất các protein tái tổ hợp, bao gồm các kháng thể và các sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO LÝ THUYẾT

CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH

HỌC PHÂN TỬ

BẰNG SHPT

TP Thủ Đức, 12/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO LÝ THUYẾT

SỰ CAN THIỆP CỦA VIRUS RNA THÔNG QUA HỆ

THỐNG CRISPR/CAS13A Ở THỰC VẬT

Thủ Đức, 12/2024

PGS TS NGUYỄN BẢO QUỐC THẠCH VINH

TRẦN VĂN PHÚC NGUYỄN PHÚC THIỆN

LÊ QUỐC ĐẠT

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH HÌNH ẢNH ii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu chính 1

1.3 Mục tiêu cụ thể 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về cây Nicotiana benthamiana 2

2.1.1 Đặt điểm sinh học 2

2.1.2 Tầm quan trọng trong sinh học 3

2.1.3 Ứng dụng trong công nghệ sinh học 3

2.2 Tổng quan về kỹ thuật CRISPR/CAS13 3

2.2.1 Khái niệm về kỹ thuật CRISPR/CAS1 3

2.2.2 Cơ chế hoạt động của kỹ thuật CRISPR/CAS13 4

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 5

3.1 Vật liệu nghiên cứu 5

3.2 Phương pháp thực hiện 5

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ, THẢO LUẬN VÀ KẾT LUẬN 7

4.1 Kết quả 7

4.1.1 Kỹ thuật CRISPR/CAS13a để biểu hiện trong cây 7

4.1.3 pCas13a xử lý poly-crRNA thành crRNA chức năng 8

4.2 Thảo luận từ tác giả 9

4.3 Kết luận 10

4.3.1 Kết luận từ bài nghiên cứu 10

4.3.2 Kết luận của nhóm 10

TÀI LIỆU THAM KHẢO 11

DANH SÁCH HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Cây Nicotiana benthamiana 2

Hình 2.2 Cơ chế hoạt động của kỹ thuật Crispr/Cas13 4

Hình 3.1 Tái tạo bộ máy CRISPR/Cas13a ở thực vật 6

Hình 4.1 Phức hợp pCas13a–crRNA can thiệp vào TuMV-GFP ở cây trồng 8

Hình 4.2 Poly-crRNA được xử lý bằng pCas13a làm trung gian cho sự can thiệp với TuMV-GFP 9

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Kỹ thuật CRISPR/Cas13, một phương pháp chỉnh sửa gen tiên tiến, đang mở ra những tiềm năng lớn trong việc điều trị các bệnh di truyền liên quan đến RNA, tuy nhiên, công nghệ này cũng đặt ra nhiều vấn đề cần được giải quyết Một trong những thách thức lớn nhất là đảm bảo độ chính xác của Cas13 trong việc tác động chỉ lên RNA mục tiêu mà không gây ảnh hưởng đến các RNA khác trong tế bào, tránh các hiệu ứng ngoài mục tiêu Bên cạnh đó, việc ứng dụng CRISPR/Cas13 trong điều trị bệnh vẫn gặp khó khăn về an toàn và hiệu quả lâu dài, đặc biệt khi xét đến khả năng gây ra các tác dụng phụ không mong muốn Ngoài ra, vấn đề đạo đức trong việc chỉnh sửa RNA con người và các rủi ro pháp lý liên quan đến việc thử nghiệm trên người cũng là những câu hỏi cần được giải quyết trước khi công nghệ này có thể được ứng dụng rộng rãi

1.2 Mục tiêu chính

Chỉnh sửa RNA, khác với các phiên bản trước như CRISPR/Cas9, chủ yếu tác động vào DNA Cas13, một enzyme thuộc họ CRISPR, có khả năng nhận diện và cắt RNA, giúp điều chỉnh quá trình biểu hiện gene mà không làm thay đổi bản thân di truyền của tế bào

1.3 Mục tiêu cụ thể

Điều trị các bệnh di truyền liên quan đến RNA: CRISPR/Cas13 có thể được sử dụng để điều chỉnh hoặc sửa chữa các lỗi trong RNA, từ đó điều trị các bệnh di truyền do đột biến trong RNA

Khử bỏ hoặc sửa chữa RNA gây bệnh: Một trong những ứng dụng tiềm năng lớn của CRISPR/Cas13 là khả năng loại bỏ hoặc sửa chữa các RNA không mong muốn, chẳng hạn như các RNA virut trong các bệnh như HIV hay các bệnh do virus RNA

Điều chỉnh biểu hiện gene tạm thời: CRISPR/Cas13 có thể điều chỉnh biểu hiện của các gene mà không cần thay đổi di truyền lâu dài, giúp điều trị các bệnh liên quan đến việc biểu hiện quá mức hoặc thiếu hụt một số protein

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây Nicotiana benthamiana

Nicotiana benthamiana, một loài cây thuốc lá hoang dã có nguồn gốc từ Úc, đã trở thành một hệ thống mô hình quan trọng trong nghiên cứu sinh học thực vật Với chu kỳ sống ngắn và khả năng biến nạp gen cao, N benthamiana được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu các quá trình sinh lý học cơ bản, phát triển vaccine, và sản xuất các protein tái

tổ hợp Khả năng biểu hiện protein dị loại hiệu quả của cây đã làm cho nó trở thành một công cụ hữu ích trong việc đánh giá chức năng của các gen và phát triển các loại thuốc mới So với các loài thực vật mô hình khác như Arabidopsis thaliana, N benthamiana có

ưu điểm là dễ nuôi trồng trong điều kiện phòng thí nghiệm và có kích thước lá lớn, thuận lợi cho các thí nghiệm quy mô lớn

Hình 2.1 Cây Nicotiana benthamiana.

2.1.1 Đặt điểm sinh học

Tên khoa học: Nicotiana benthamiana

Họ: Solanaceae (họ Cà)

Nguồn gốc: Loài cây này có nguồn gốc từ Úc, nhưng hiện nay được trồng rộng rãi

ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu

Dạng cây: Là cây thân thảo, cao khoảng 0.5 - 2 mét, có thân mảnh mai và lá lớn, hình elip hoặc hình mũi mác

Lá: Lá của cây có kích thước lớn, màu xanh đậm và thường mọc đối xứng

Hoa: Hoa của cây này có màu trắng hoặc hồng nhạt, hình ống, mọc thành chùm

2.1.2 Tầm quan trọng trong sinh học

Mô hình nghiên cứu: Nicotiana benthamiana là một mô hình cây trồng phổ biến trong các nghiên cứu sinh học phân tử và di truyền học, đặc biệt là trong việc nghiên cứu tương tác giữa virus và vật chủ Cây này được lựa chọn vì dễ dàng chuyển gene và dễ trồng trong môi trường thí nghiệm

Vật chủ virus: Cây này là vật chủ tự nhiên của nhiều loại virus, bao gồm cả các virus RNA và DNA Chính điều này khiến Nicotiana benthamiana trở thành mô hình lý tưởng để nghiên cứu các bệnh cây và các biện pháp phòng chống virus

Sản xuất protein tái tổ hợp: Vì cây này có khả năng dễ dàng tiếp nhận và biểu hiện các gen ngoại lai, nó được sử dụng để sản xuất các protein tái tổ hợp, bao gồm các kháng thể và các sản phẩm sinh học quan trọng khác

2.1.3 Ứng dụng trong công nghệ sinh học

Biến đổi gen: Nicotiana benthamiana là cây thường xuyên được sử dụng trong các thí nghiệm chuyển gen, như để tạo ra cây trồng có khả năng kháng bệnh, kháng thuốc trừ sâu hoặc để sản xuất các hợp chất sinh học

Sản xuất vaccine và protein tái tổ hợp: Nhờ vào khả năng biểu hiện các protein lạ, Nicotiana benthamiana được sử dụng trong việc phát triển các vắc-xin và các sản phẩm dược phẩm từ thực vật

Công nghệ phân tử và sinh học hệ thống: Cây này cũng được sử dụng để nghiên cứu các quá trình sinh học cơ bản, bao gồm sự biểu hiện gene, tương tác protein và các mối quan hệ giữa virus và tế bào

2.2 Tổng quan về kỹ thuật CRISPR/CAS13

2.2.1 Khái niệm về kỹ thuật CRISPR/CAS1

CRISPR/Cas13 là một kỹ thuật chỉnh sửa gen tiên tiến, sử dụng hệ thống CRISPR-Cas để tác động trực tiếp vào RNA thay vì DNA như các phiên bản trước đó như CRISPR/Cas9 Cas13 là một enzyme RNA-guided endonuclease, có khả năng nhận diện

và cắt các RNA mục tiêu, mở ra những cơ hội mới trong điều trị các bệnh di truyền liên quan đến RNA, như các bệnh rối loạn di truyền do đột biến trong RNA hoặc bệnh lý do virus RNA gây ra Công nghệ này không thay đổi cấu trúc DNA của tế bào, giúp điều chỉnh biểu hiện gene một cách tạm thời và có thể ứng dụng trong nghiên cứu gene, điều

trị các bệnh di truyền, khử virus RNA, và phát triển các phương pháp mới trong điều trị ung thư và bệnh viêm CRISPR/Cas13 hứa hẹn mang lại những tiến bộ vượt bậc trong y học và công nghệ sinh học, nhưng cũng đặt ra nhiều thách thức về độ chính xác và an toàn khi áp dụng trong điều trị lâm sàng

2.2.2 Cơ chế hoạt động của kỹ thuật CRISPR/CAS13

Cas13: Đây là một loại enzyme có khả năng cắt các phân tử RNA Khi được hướng dẫn bởi một đoạn RNA dẫn đường (gRNA), Cas13 sẽ tìm kiếm và cắt chính xác đoạn RNA mục tiêu

gRNA: Đoạn RNA ngắn này được thiết kế để bổ sung với trình tự RNA mà nhà khoa học muốn chỉnh sửa Nó đóng vai trò như một "hộ chiếu" dẫn đường cho enzyme Cas13 đến đúng vị trí cần thiết

Hình 2.2 Cơ chế hoạt động của kỹ thuật Crispr/Cas13.

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

Cây N benthamiana biểu hiện Cas13a được tái sinh bằng giao thức đã phát triển trước đó Cấu trúc pK2GW7-pCas13a được sử dụng để tạo ra cây (N benthamiana hoặc kháng thuốc) để lập trình khả năng kháng TuMV Tất cả các cây được chọn lọc trên 50mg kanamycin trong môi trường thạch Murashige-Skoog ½

3.2 Phương pháp thực hiện

Bước 1: Thiết kế protein pCas13a:

Một protein pCas13a được thiết kế với các vị trí đặc biệt như 3x-HA (cho việc nhận diện và kiểm tra), NLS (tín hiệu dẫn đường nhân), và các trình tự attL1 và attL2 (cho phản ứng tái tổ hợp LR Gateway) Trình tự nucleotide của pCas13a được thiết kế thành bốn đoạn chồng chéo, mỗi đoạn có enzyme hạn chế duy nhất để hỗ trợ quá trình nhân bản và lắp ráp tuần tự

Bước 2: Tổng hợp gen và lắp ráp:

Các đoạn này được tổng hợp tùy chỉnh vào plasmid pUC19(-MCS) bởi dịch vụ tổng hợp gen Blue Heron Biotech

Bốn đoạn được lắp ráp qua các bước tiêu hóa hạn chế và tái tổ hợp với các enzyme hạn chế như XbaI, PpuM1, NotI và Avr2 Sau đó, các mảnh được lắp ráp thành một đoạn duy nhất để tạo plasmid pUC19-pCas13a

Bước 3: Kiểm tra cấu trúc pCas13a :

Cấu trúc của plasmid pUC19-pCas13a được xác nhận bằng phương pháp giải trình

tự Sanger, sử dụng các đoạn mồi chồng chéo để kiểm tra tính chính xác

Bước 4: Chuyển plasmid vào vectơ nhị phân pK2GW7:

Sau khi xác nhận, plasmid pCas13a được chuyển vào vectơ nhị phân pK2GW7 bằng phương pháp tái tổ hợp LR Gateway để tạo plasmid pK2GW7-pCas13a, giúp biểu hiện gene trong cây dưới sự kiểm soát của trình khởi động 35S (một promoter mạnh mẽ dùng cho biểu hiện ở thực vật)

Bước 5: Thiết kế crRNA:

Các crRNA (RNA điều hướng cho CRISPR) được thiết kế dưới dạng các cặp mồi

có phần nhô ra và nhân bản dưới trình khởi động PEBV trong TRV RNA2 Các crRNA

này được tạo thành và sao chép vào TRV RNA2 thông qua các enzyme hạn chế như XbaI

và BamHI

Bước 6: Tổng hợp poly-crRNA và ns-poly-crRNA:

Các loại poly-crRNA và ns-poly-crRNA được tổng hợp tùy chỉnh trong plasmid pUC19, với các enzyme hạn chế như BamHI và SacI Cả hai dạng này sau đó được sao chép vào TRV RNA2 bằng cách sử dụng BamHI và SacI

Hình 3.1 Tái tạo bộ máy CRISPR/Cas13a ở thực vật.

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ, THẢO LUẬN VÀ KẾT LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Kỹ thuật CRISPR/CAS13a để biểu hiện trong cây

4.1.1.1 Nhân bản và chuyển gen vào cây:

pCas13a được nhân bản vào vectơ nhị phân pK2GW7 và chuyển vào

Agrobacterium tumefaciens Các Agrobacterium chứa vectơ pCas13a được sử dụng để chuyển gen vào cây N benthamiana qua phương pháp nhiễm trùng Các dòng cây biểu hiện pCas13a (pCas13a-OE) đã được xác nhận bằng phương pháp Western blotting với kháng thể gắn thẻ HA, cho thấy sự biểu hiện thành công của protein pCas13a

4.1.1.2 Thiết kế crRNA để nhắm mục tiêu TuMV-G FP:

Các crRNA được thiết kế nhắm vào bốn vị trí khác nhau trên bộ gen TuMV-GFP, bao gồm các vị trí trong gene GFP (GFP1, GFP2), gene HC-Pro (proteinase ức chế im lặng) và CP (protein vỏ) Các crRNA này được biểu hiện tạm thời trong hệ thống TRV RNA2 dưới sự điều khiển của trình tự khởi động PEBV, tạo ra các crRNA để kiểm tra chức năng của hệ thống CRISPR/Cas13a

4.1.2 CRISPR/CAS13a can thiệp vào TuMV-GFP trong cây trồng

CRISPR/pCas13a đã được thử nghiệm trong các xét nghiệm tạm thời ở lá cây N benthamiana Các cây này được đồng xâm nhập với Agrobacterium mang pK2GW7:pCas13a và các crRNA nhắm vào các trình tự của TuMV-GFP

Sau 7 ngày (dpi), tín hiệu GFP được quan sát dưới ánh sáng cực tím (UV) để đánh giá mức độ lây lan của virus Kết quả cho thấy rằng các cây có crRNA nhắm vào HC-Pro và GFP2 cho thấy sự giảm ~50% tín hiệu GFP, trong khi các cây có crRNA nhắm vào CP và GFP1 chỉ giảm nhẹ tín hiệu GFP

4.1.2.1 Đánh giá can thiệp trong cây chuyển gen pCas13a-OE:

Các cây pCas13a-OE (biểu hiện liên tục protein pCas13a) được tạo ra thông qua quá trình chuyển đổi gen và biểu hiện pCas13a đã được xác nhận qua phương pháp

Western blotting Các cây này sau đó được đồng xâm nhập với TuMV-GFP và các crRNA nhắm vào HC-Pro, CP, GFP1, hoặc GFP2 Kết quả, sau 7 ngày (dpi), mức độ GFP giảm

rõ rệt (lên tới 50%) ở các cây có rRNA nhắm vào HC-Pro và GFP2, trong khi các cây có crRNA nhắm vào CP và GFP1 chỉ giảm mức độ GFP nhẹ

4.1.2.2 Kết luận

ns-crRNA, không có trình tự tương đồng với TuMV-GFP, không làm giảm mức độ GFP, chứng minh tính đặc hiệu và khả năng lập trình của hệ thống CRISPR/pCas13a trong việc nhắm mục tiêu và can thiệp vào các RNA virus cụ thể

Hình 4.1 Phức hợp pCas13a–crRNA can thiệp vào TuMV-GFP ở cây trồng.

4.1.3 pCas13a xử lý poly-crRNA thành crRNA chức năng

4.1.3.1 Thiết kế poly-crRNA và ns-poly-crRNA:

Các poly-crRNA được thiết kế với các đoạn lặp lại 28-nt, bao gồm các trình tự nhắm vào HC-Pro, GFP1, và GFP2 trong bộ gen TuMV-GFP Các ns-poly-crRNA (không đặc hiệu) cũng được thiết kế và sử dụng làm đối chứng Các mảng CRISPR này được chuyển vào cây N benthamiana WT (dòng hoang dã) và cây pCas13a-OE (biểu hiện protein pCas13a) thông qua hệ thống TRV, với mục tiêu tạo ra các pre-crRNA dài

4.1.3.2 Phân tích xử lý pre-crRNA bằng Northern blotting:

Northern blotting cho thấy sự tích tụ đáng kể các sản phẩm RNA nhỏ, tương ứng với kích thước của crRNA trưởng thành từ cả poly-crRNA và ns-poly-crRNA Kết quả này chứng minh rằng pCas13a có thể xử lý pre-crRNA thành crRNA chức năng Tuy

nhiên, trong một số cây chuyển gen pCas13a-OE, mức crRNA xử lý từ poly-crRNA vẫn dưới mức phát hiện, cho thấy sự biến đổi có thể khác nhau tùy thuộc vào các dòng cây khác nhau

4.1.3.3 Kết quả đánh giá sự can thiệp virus TuMV-GFP:

Cây pCas13a-OE sau khi thâm nhiễm với poly-crRNA và ns-poly-crRNA đã được thử thách với virus TuMV-GFP Tín hiệu GFP của virus được quan sát dưới ánh sáng UV sau 7 ngày (dpi) cho thấy sự giảm đáng kể tín hiệu GFP ở những cây có poly-crRNA (giảm ~50%), trong khi cây có ns-poly-crRNA không có sự giảm đáng kể nào Định lượng GFP xác nhận rằng tín hiệu GFP giảm trung bình khoảng 50% ở cây có poly-crRNA

Northern blotting cho thấy sự giảm tích tụ rõ rệt của bộ gen RNA TuMV-GFP ở cây có poly-crRNA

Western blotting cũng xác nhận mức độ protein GFP biểu hiện trong cây có poly-crRNA giảm rõ rệt, chứng minh sự can thiệp của pCas13a vào virus

Hình 4.2 Poly-crRNA được xử lý bằng pCas13a làm trung gian cho sự can thiệp với

TuMV-GFP

4.2 Thảo luận từ tác giả

Hệ thống CRISPR/Cas13a có tiềm năng lớn trong việc can thiệp và phân hủy bộ gen RNA của virus, đặc biệt là virus RNA ở thực vật Phương pháp này có thể được sử dụng hiệu

quả để nhắm mục tiêu và can thiệp vào các vi-rút RNA như TuMV (TuMV-GFP), với khả năng xử lý pre-crRNA thành các crRNA chức năng, giúp giảm sự sao chép và lây lan của virus Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng CRISPR/Cas13a có thể cung cấp một công cụ mạnh

mẽ và hứa hẹn trong việc điều chỉnh và can thiệp RNA, mở ra cơ hội sử dụng hệ thống này trong sinh học chức năng, công nghệ sinh học và y học di truyền

Tuy nhiên, để tối ưu hóa khả năng nhắm mục tiêu của hệ thống CRISPR/Cas13a, cần chú

ý đến việc lựa chọn các vị trí mục tiêu RNA cẩn thận và tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tiếp cận của Cas13a đối với RNA mục tiêu Thêm vào đó, nghiên cứu về các biến thể Cas13a mạnh mẽ hơn và khả năng kết hợp với các protein ổn định có thể giúp nâng cao hiệu quả và tính chính xác của can thiệp RNA, cũng như mở rộng ứng dụng trong việc phát triển cây trồng kháng virus

4.3 Kết luận

4.3.1 Kết luận từ bài nghiên cứu

Phương pháp CRISPR/Cas13a có tiềm năng áp dụng trong chuẩn đoán bệnh sinh học phân tử trên thực vật Phương pháp này sử dụng Cas13a, một ribonuclease được hướng dẫn bởi RNA, có khả năng nhắm mục tiêu và phân hủy RNA virus Điều này mở ra cơ hội

sử dụng CRISPR/Cas13a để phát hiện và can thiệp vào các virus RNA trong thực vật, giúp nhận diện bệnh sớm và can thiệp hiệu quả

4.3.2 Kết luận của nhóm

Qua bài nghiên trên chúng em kỹ thuật CRISPR/CAS13a có tiềm năng cao trong chuẩn đoán bệnh thực vật với những ưu điểm vượt trội như phát hiện chính xác bệnh, can thiệp trực tiếp vào sự phát triển của bệnh và có thể nhắm đến nhiều mục tiêu virus Mặc dù vẫn còn một số hạn chế nhất định nhưng với sự phát triển của công nghệ sinh học hiện nay thì những hạn chế này đang dần được cải thiện