Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn được gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (prrsv bn 10)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - NGUYỄN THỊ NGỌC ANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN ĐƯỢC GÂY BỆNH THỰC NGHIỆM BẰNG CHỦNG VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN (PRRSV-BN-10) CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y MÃ SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS NGUYỄN HỮU NAM HÀ NỘI – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan, giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 16 tháng 10 năm 2014 Tác giả Nguyễn Thị Ngọc Anh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS – Nguyễn Hữu Nam, người hướng dẫn khoa học, giúp đỡ nhiệt tình có trách nhiệm tơi q trình thực đề tài hồn thành luận văn Lời cảm ơn chân thành xin gửi tới Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhiều bạn bè đồng nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên, giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Nhân dịp này, tơi xin bày tỏ lịng cám ơn chân thành sâu sắc tới tất giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày 16 tháng 10 năm 2014 Tác giả Nguyễn Thị Ngọc Anh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục v Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii DBảng 1anh mục hình ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích nghiên cứu yêu cầu đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu tình hình dịch bệnh PRRSV gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn 1.1.1 Tình hình Hội chứng PRRS giới 1.1.2 Tình hình hội chứng PRRS Việt Nam 1.2 Virus PRRSV 1.2.1 Hình thái, cấu tạo 1.2.2 Phân loại virus PRRS 11 1.2.3 Sức đề kháng virus PRRS 12 1.2.4 Khả gây bệnh 13 1.3 Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản 13 1.3.1 Đặc điểm chung 13 1.3.2 Động vật cảm nhiễm 13 1.3.3 Cơ chế sinh bệnh phương thức truyền lây 13 1.3.4 Triệu chứng lâm sàng lợn mắc PRRS 16 1.3.5 Bệnh tích lợn mắc PRRS 17 1.3.6 Các phương pháp chẩn đốn PRRS 18 1.4 Các biện pháp phịng chống dịch 20 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.3 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 23 2.4 Nguyên liệu 23 2.4.1 Virus 23 2.4.2 Động vật thí nghiệm 23 2.4.3 Hóa chất 24 2.4.4 Dụng cụ 24 2.5 Phương pháp nghiên cứu 24 2.5.1 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm 24 2.5.2 Phương pháp ELISA 25 2.5.3 Phương pháp RT – PCR 27 2.5.4 Phương pháp quan sát, mô tả 29 2.5.5 Phương pháp mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể 29 2.5.6 Phương pháp làm tiêu kiểm tra bệnh tích vi thể 29 2.5.7 Phương pháp thống kê, xử lý số liệu 32 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết trước gây bệnh thực nghiệm cho lợn 33 3.1.1 Kết theo dõi thân nhiệt lợn trước gây bệnh thực nghiệm 33 3.1.2 Kết xét nghiệm kháng thể kháng virus PRRS phương pháp Elisa 3.1.3 34 Kết xét nghiệm có mặt virus PRRS số virus khác phương pháp RT – PCR 35 3.2 Kết sau gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 37 3.2.1 Triệu chứng lâm sàng lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 3.2.2 37 Bệnh tích đại thể lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN -10 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 51 Page iv 3.2.3 Một số bệnh tích vi thể lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 52 3.2.4 Kết xét nghiệm có mặt PRRSV quan 56 3.2.5 Hàm lượng kháng thể kháng PRRSV phương pháp ELISA 59 3.2.6 Sự phân bố virus chủng PRRSV- BN-10 quan lợn sau gây bệnh thực nghiệm 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65 Kết luận 65 Đề nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA TRONG ĐỀ TÀI 70 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TN Thí nghiệm BED Blue Ear Disease cs Cộng ĐTB Đại thực bào ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay HLB Hạch lâm ba HE Hematoxylin & Eosin IPMA Immuno – Peroxidase Monolayer Assay NXB Nhà xuất OIE Organisation of International Epidemiology (Tổ chức Dịch tễ học Thế giới) OD Optical Density (Mật độ quang) PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus RNA Ribonucleic Acid RT – PCR Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction BCĐNTT Bạch cầu đa nhân trung tính Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng 1.1 Protein cấu trúc PRRSV 1.2 Sự tương đồng nucleotide chủng PRRS so sánh với Trang 10 chủng Bắc Mỹ VR2332 11 1.3 Sức đề kháng virus với điều kiện ngoại cảnh 12 3.1 Bảng đo thân nhiệt lợn trước gây bệnh thực nghiệm (0C) 33 3.2 Kết xét nghiệm kháng thể kháng PRRSV phương pháp ELISA 3.3 34 Kết xét nghiệm có mặt virus PRRS số virus khác phương pháp RT – PCR 3.4 36 Thân nhiệt lợn sau gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN -10 (0C) 3.5 38 Tần số hô hấp lợn trước sau gây bệnh thực nghiệm cho lợn chủng virus PRRSV-BN-10 (lần/phút) 3.6 41 Tần số tim lợn trước sau gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 (lần/phút) 43 3.7 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu lợn gây bệnh thực nghiệm 45 3.8 Bệnh tích đại thể chủ yếu lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN10 Kết nghiên cứu bệnh tích vi thể phổi lợn gây bệnh thực nghiệm chủng PRRSV-BN-10 3.10 53 Bệnh tích vi thể số quan lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 3.11 51 53 Kết xét nghiệm PRRSV phương pháp RT-PCR sau gây bệnh thực nghiệm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 57 Page vii 3.12 Hàm lượng kháng thể kháng PRRSV phương pháp ELISA sau gây bệnh thực nghiệm cho lợn 3.13 59 Sự phân bố virus quan lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 62 Page viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Bản đồ lịch sử xuất PRRS giới 1.2 Cấu trúc hạt PRRS virus 1.3 Cấu trúc gen PRRS virus 1.4 Bộ gen virus PRRS 10 1.5 Virus PRRS xâm nhập phá hủy tế bào đại thực bào 14 3.1 Đồ thị biểu diễn thân nhiệt lợn trước gây bệnh thực nghiệm 34 3.2 Đồ thị biểu diễn hàm lượng kháng thể kháng PRRSV trước gây bệnh thực nghiệm 3.3 35 Kết phản ứng RT – PCR với mồi ORF5 trước gây bệnh thực nghiệm 36 3.4 Gây bệnh thực nghiệm cho lợn thí nghiệm 37 3.5 Đồ thị thân nhiệt độ lợn trước sau gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 3.6 39 Biểu đồ tần số hô hấp lợn trước sau gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV- BN-10 3.7 42 Đồ thị biểu diễn nhịp tim lợn sau gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 44 3.8 Kết phản ứng RT- PCR với mồi ORF5 58 3.9 Đồ thị biểu diễn hàm lượng kháng thể kháng PRRSV sau gây bệnh thực nghiệm cho lợn Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 61 Page ix MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trong năm gần đây, ngành chăn nuôi ngày phát triển mạnh giữ vị trí quan trọng kinh tế nước ta Đặc biệt, chăn nuôi lợn có nhiều thay đổi đáng kể, đáp ứng phần lớn nhu cầu thực phẩm cho người dân Sản phẩm ngành chăn nuôi lợn cung cấp nguồn thực phẩm chủ yếu cho nhân loại Ở nhiều nước giới, mức tiêu thụ thịt lợn tính đầu người chiếm tỷ lệ cao so với loại thịt khác Ở Việt Nam, tỷ lệ thịt lợn tính theo đầu người chiếm 72,94% tổng số loại thịt tiêu thụ hàng năm Chăn nuôi lợn trở thành nguồn thu nhập quan trọng hộ nông dân nghề góp phần chuyển dịch cấu kinh tế nơng nghiệp Cùng với phát triển chăn nuôi, lưu lượng động vật sản phẩm động vật lớn, kèm theo gia tăng tình hình dịch bệnh Đã có nhiều bệnh du nhập vào nước ta theo đường lưu thông, vận chuyển có Hội chứng rối loạn hơ hấp sinh sản lợn (PRRS) Đây bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi Bệnh có tốc độ lây lan nhanh đàn lợn lứa tuổi với tỷ lệ ốm tỷ lệ loại thải cao, gây thiệt hại nghiêm trọng kinh tế Để tìm mơi trường phân lập virus phù hợp làm sở khoa học cho việc nghiên cứu sản xuất vacxin đặc hiệu phịng bệnh cho lợn việc hiểu rõ biến đổi bệnh lý, phân bố virus, đặc điểm bệnh lý số quan lợn gây bệnh thực nghiệm cần thiết Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu số đặc điểm bệnh lý lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus gây Hội chứng rối loạn hơ hấp sinh sản (PRRSV-BN-10)” Mục đích nghiên cứu yêu cầu đề tài - Đánh giá khả gây bệnh lợn thực nghiệm chủng virus PRRSV- BN-10 gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản - Làm rõ diễn biến bệnh chủng virus PRRSV- BN-10 gây nên Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu tình hình dịch bệnh PRRSV gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn 1.1.1 Tình hình Hội chứng PRRS giới * Tình hình dịch bệnh: Cho đến nay, trải qua 22 năm kể từ lần phát Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản đàn lợn Mỹ, dịch bệnh lan tràn lưu hành nhiều quốc gia để lại nhiều hậu nghiêm trọng kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn giới Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (Porcine respiratory and reproductive syndrome - Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản) ghi nhận lần giới vào năm 1987 Mỹ vùng bắc bang California, bang Iowa Minnesota Năm 1988 bệnh lan sang Canada Sau bệnh xuất Đức năm 1990, Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ Anh năm 1991 Pháp năm 1992 Bệnh bùng phát gây rối loạn hô hấp, sinh sản lợn lứa tuổi với triệu chứng chủ yếu bỏ ăn hàng loạt, hắt hơi, sổ mũi, tăng tần số hơ hấp, thở khó, há mồm để thở Lợn thường có tỷ lệ chết cao, lợn lớn tỷ lệ chết thấp thường bị bội nhiễm thêm loại vi khuẩn gây bệnh khác, đặc biệt vi khuẩn gây bệnh hệ hô hấp (Phạm Gia Ninh biên dịch, 2000) Kể từ xuất nay, bệnh gọi với nhiều tên khác Thời gian đầu chưa xác định nguyên nhân nên người ta đặt tên gọi cho dịch bệnh Bệnh bí hiểm lợn (Mystery swine disease – MDS); số tác giả khác vào bệnh tích tai gọi bệnh Tai xanh (Blue Ear disease – BED); vào hậu dịch bệnh gây gọi Hội chứng hơ hấp xảy thai lợn (Porcine endemic abortion and respiratory syndrome – PEARS) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Đến năm 1992, Hội nghị Quốc tế hội chứng tổ chức Minesota (Mỹ), tổ chức Dịch tễ học giới (OIE) thống tên gọi Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (Porcine respiratory and reproductive syndrome - Hội chứng rối loạn hơ hấp sinh sản) Kể từ nay, tên trở thành tên gọi thức bệnh Về tình hình diễn biến dịch giới cho thấy, từ năm 2005 trở lại đây, có 25 nước vùng lãnh thổ thuộc tất châu lục giới có dịch Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lưu hành (trừ châu Úc Newzeland) Do vậy, khẳng định Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản nguyên nhân gây tổn thất lớn kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn nhiều quốc gia giới (Nguyễn Bá Hiên cs, 2007) Hình 1.1 Bản đồ lịch sử xuất PRRS giới Tại Trung Quốc, dịch bệnh PRRS xuất năm gần tồn Theo Tian cs ( 2007) virus PRRS gây đại dịch lây lan 10 tỉnh thành Trung Quốc làm chết 2.000.000 lợn, Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page có 400.000 sảy thai, đẻ non Tính từ đầu năm đến tháng 7/2007, dịch bệnh xảy 25 tỉnh, với 180.000 lợn mắc bệnh 45.000 chết Qua số nghiên cứu với qui mô lớn, người ta xác định virus gây bệnh PRRS Trung Quốc thuộc chủng Bắc Mỹ thể cường độc gây Tại Thái Lan, nghiên cứu quy mô rộng lớn từ năm 2000 – 2003 cho thấy virus PRRS phân lập từ nhiều địa phương gồm chủng Châu Âu chủng Bắc Mỹ, virus thuộc chủng Bắc Mỹ chiếm 33,58% Dịch bệnh PRRS lần xuất nước vào năm 1989 tỷ lệ lưu hành huyết bệnh thay đổi khác nhau, từ 8,7% vào năm 1991 76% vào năm 2002 Nguồn gốc PRRS Thái Lan việc sử dụng tinh lợn nhập nội bị nhiễm virus PRRS đàn nhập nội mang trùng * Tình hình nghiên cứu : Nhiều nhà khoa học giới sâu nghiên cứu nguyên nhân, chế truyền lây, phương pháp chẩn đốn phịng chống Hội chứng rối loạn sinh sản lợn Riera Pujadas Pere cs, (1997) nghiên cứu chủng virut suy yếu gây Hội chứng rối loạn sinh sản (Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản) lợn, với việc điều chế vacxin phịng ngừa kít chẩn đoán Joo Han Soo, (1997) đưa phương pháp điều chế vacxin sử dụng virut Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản làm yếu Eichhorn – G, Frost – JM, (1997) nghiên cứu sử dụng sữa non lợn nái vào giai đoạn thích hợp để chẩn đốn huyết phát Hội chứng rối loạn sinh sản (Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản) Segales.J cs (1998) nghiên cứu siêu cấu trúc đại thực bào túi phổi lợn bị nhiễm in – vitro với virut gây Hội chứng rối loạn sinh sản trường hợp có khơng có Haemophilus – Parasuis Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Burch Reina Alemany cs, (1997) tìm hiểu chủng virut suy yếu gây Hội chứng rối loạn sinh sản (Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản) lợn, với việc chế vacxin Van Niewstadt cs, (2002) nêu loại kháng nguyên Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản dùng để phát chuỗi peptide đồng đẳng virut Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản dùng điều chế vacxin xét nghiệm chẩn đoán Calvert Jay G cs, (2007) thuộc khoa Thú y trường Đại học Minesota Mỹ nghiên cứu đặc điểm phân loại, cấu tạo, khả gây bệnh virut triệu chứng lâm sàng thường gặp lợn bị bệnh Mỹ số nước Châu Âu thấy chủng virut Mỹ châu Âu có khác biệt gen, tức virut nơi có biến đổi cấu trúc Calvert Jay G cs, (2007) nghiên cứu chuỗi AND bị nhiễm virut Hội chứng rối loạn sinh sản lợn Bắc Mỹ phương pháp sử dụng Joo Han - Soo cs (2007) sâu vào tìm hiểu phương pháp chuẩn bị virut Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản, Protein lây nhiễm kít để kiểm tra phát Lunney Joan K cs (2007), X.J.Meng (2000) thông số miễn dịch giúp giải thích nguyên nhân số lợn đàn lại không bị nhiễm virut Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản Calvert Jay G cs, (2007) nghiên cứu trình tự gen chủng virut cường độc gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản Bắc Mỹ cho biết: số ổ dịch gen virut Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản tương đồng 93,2 – 94,2% với gen chủng VR2332 (Bắc Mỹ) số ổ dịch khác gen virut Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản tương đồng 63,4 – 64,5% với chủng gây bệnh Lelystad (châu Âu) virut phân lập có đột biến số axit amin Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Pensaert Maurice cs, (2008) nghiên cứu chuỗi Polypeptit mã hoá axit nucleic bên tế bào nhiễm virut Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản 1.1.2 Tình hình hội chứng PRRS Việt Nam * Tình hình dịch bệnh Lần PRRS xuất Việt Nam vào năm 1997, PRRS phát đàn lợn nhập từ Mỹ vào tỉnh miền Nam Kết kiểm tra thấy 10/51 lợn giống nhập có huyết dương tính với PRRS theo Cục Thú y (2007) Toàn số lợn xử lý vào thời gian Tuy nhiên, năm tiếp theo, nghiên cứu bệnh trại lợn giống tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết dương tính với bệnh khác nhau, từ 1,3% 68,29% theo Bộ NN PTNT(2007) Dịch bệnh PRRS xuất gây thành dịch nhiều địa phương, làm tổn thất lớn kinh tế cho người chăn nuôi thực tháng năm 2007, cụ thể: Đợt dịch thứ nhất: Ngày 12/3/2007, lần dịch PRRS xuất nước ta đàn lợn Hải Dương Sau dịch lây lan nhanh phát triển mạnh 146 xã, phường thuộc 25 huyện, thị xã tỉnh là: Hải Dương, Hưng Yên, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Bắc Kạn, Nam Định Hải Phòng Số lợn mắc bệnh 31.928 con, số lợn chết xử lý 7.464 Đợt dịch thứ 2: Ngày 25/6/2007, dịch bắt đầu xuất tỉnh Quảng Nam, sau dịch lây lan diện rộng: 178 xã, phường 40 huyện, thị xã thuộc 14 tỉnh, thành phố là: Cà Mau, Long An, Bà Rịa - Vũng Tàu, Khánh Hoà, Bình Định, Quảng Ngãi, Quảng Nam, Đà Nẵng, Thừa Thiên Huế, Quảng Trị, Lạng Sơn, Hà Nội, Thái Bình, Hải Dương Tổng số lợn ốm 57.017 con, số chết xử lý 11.753 Như vậy, năm 2007, dịch PRRS xuất 405 xã, thuộc 75 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page huyện 21 tỉnh, thành phố Tổng số gia súc mắc bệnh 88.945 con, số chết phải tiêu huỷ 19.217 Năm 2008: tính từ ngày 20/3/2008 dịch xuất nhiều xã thuộc tỉnh Hà Tĩnh Dịch xuất 949 xã, phường 99 huyện, thị xã thuộc 28 tỉnh là: Bạc Liêu, Lâm Đồng, Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Hà Tĩnh, Nghệ An, Thanh Hố, Ninh Bình, Nam Định, Thái Bình, Thái Ngun… Tổng số lợn mắc bệnh 298.095 con, số chết phải tiêu huỷ 286.351 Năm 2009: Từ đầu năm 2009 đến dịch xảy 49 xã thuộc 14 huyện tỉnh, thành phố: Hưng Yên, Quảng Ninh, Bắc Giang, Quảng Nam, Gia Lai, Bạc Liêu, Bà Rịa - Vũng Tầu Đắk Lắk với 5.044 lợn mắc bệnh 4.363 lợn buộc phải tiêu huỷ Năm 2010: tháng 3/2010 dịch bệnh PRRS tái xuất Hải Dương sau thời gian lắng xuống nhanh chóng phát tán miền Bắc, Trung, Nam Theo Cục thú y tính đến 05/10/2010 nước 621.000 lợn mắc dịch, chết tiêu hủy 336.000con Tình hình dịch PRRS diễn biến phức tạp khơng có chiều hướng giảm xuống (nguồn phịng dịch tễ Cục thú y) * Tình hình nghiên cứu nước Virus PRRS xâm nhập vào Việt Nam năm 1997 qua lợn nhập khẩu, sau lưu hành chủ yếu phía Nam lúc có nhiều thơng báo đáp ứng huyết dương tính virus PRRS lợn số tỉnh phía Nam từ tháng 3/2007 khơng có thông báo dịch bệnh virus PRRS lợn Việt Nam Do đặc điểm virus gây thể bệnh kinh điển nên từ xâm nhập vào Việt Nam năm 2007, khơng có nghiên cứu virus bệnh Căn bệnh lần phát Bộ mơn Hố sinh - Miễn dịch - Bệnh lý, Viện Thú y vào ngày 19/3/2007, phân lập xác định dương tính với RT – PCR đặc hiệu, thức Cục Thú y công bố vào tháng 4/2007 Hội thảo chuyên ngành Về chẩn đoán Hội chứng PRRS, trước tháng 3/2007, phịng thí Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page nghiệm Cục Thú y (trừ phòng thí nghiệm Cơ quan thú y vùng VI) khơng chẩn đoán bệnh lý Hiện phịng thí nghiệm chẩn đốn sử dụng kỹ thuật RT- PCR để chẩn đoán bệnh PRRS Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ương Cơ quan thú y vùng VI tiến hành phân lập PRRSV đặn từ bệnh phẩm tế bào Marc – 145 Hiện chưa có biện pháp hữu hiệu phòng chống bệnh này, theo đánh giá khơng thức Hội chứng PRRS trở nên phổ biến trại chăn nuôi lợn Việt Nam 1.2 Virus PRRSV 1.2.1 Hình thái, cấu tạo * Cấu trúc hạt: PRRSV virus có hình cầu, đường kính 50 70nm, chứa nucleocapsid kích thước có cấu trúc đối xứng 20 mặt, đường kính 35nm, bao bọc bên lớp vỏ bọc dính chặt với cấu trúc bề mặt giống tổ ong, bề mặt có gai nhơ ra, vỏ có chứa lipid Bộ gen virus PRRS chuỗi dương ARN có kích thước từ 1315kb Sợi ARN virus có đầu 5’ đầu 3’ Gen ARN polymeraza chiếm khoảng 75% đầu 5’ gen, gen mã hoá cho protein cấu trúc virus nằm đầu 3’ Hình 1.2: Cấu trúc hạt PRRS virus Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Hạt virus bao gồm protein nucleocapsid N có khối lượng phân tử 1.200bp, protein màng khơng có đường glucose hình cầu M với khối lượng phân tử 16.000bp, protein peplomer N – glycosylate GS có khối lượng phân tử 25.000bp GL có khối lượng phân tử 42.000 Acid Nucleic: Sự nhân lên virus không bị ảnh hưởng dùng hợp chất ức chế tổng hợp ADN 5-bromo-2-deoxyuridin, 5-iodo-2deoxyuridin mitomycin C chứng tỏ axit nucleic ARN Sợi ARN có kích thước khoảng 15kb Hình 1.3: Cấu trúc gen PRRS virus Cấu trúc hệ gen PRRSV bao gồm khung đọc mở (ORF), gồm: ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 ORF7 Trong đó, ORF1 chia làm hai phần bao gồm ORF1a ORF1b, chiếm tới khoảng 80% tổng số độ dài hệ gen virus, chịu trách nhiệm mã hố ARN thơng tin tổng hợp enzym ARN polymerase virus ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7 phần gen tạo nên khung đọc mở mã hoá protein tương ứng, GP2 (glycoprotein 2), GP3, GP4, GP5 (hay gọi glycoprotein vỏ (E, envelope), protein màng M (membrane protein), protein cấu trúc nuclêocapsid N (nucleocapsid protein) Các protein glycosyl hóa (là tượng gắn thêm hydrat cacbon vào vị trí axit amin xác định) là: GP2, GP3, GP4, GP5, protein khơng glycosyl hóa M N Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Bảng 1.1: Protein cấu trúc PRRSV Protein KL phân tử Gen mã hoá Vai trò GP 45 KD ORF GP 31 KD ORF GP 29 KD ORF GP 25 KD ORF Bám dính tế bào đa dạng M 19 KD ORF Có tính bảo tồn cao N 19 KD ORF Tính kháng nguyên cao Quan trọng miễn dịch Các nghiên cứu dựa vào phân tích trình tự axit amin virus chủng 2332 chủng Lelystad cho thấy virus tiến hóa đột biến ngẫu nhiên tái tổ hợp gen Hình 1.4: Bộ gen virus PRRS (www.porcilis-prrs.com/pathogenesis-prrs.asp) Những nghiên cứu Benfield, Wensvoort cs (1992) cho thấy chủng virus thuộc dòng Châu Âu tương tự cấu trúc kháng nguyên chúng có sai khác định so với chủng virus Châu Mỹ Tương tự, dòng virus Châu Mỹ có tương đồng cấu trúc kháng nguyên Trong tế bào bị nhiễm virus PRRS, virus sinh ARNm Tất Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 10 ARNm có trình tự xếp chung đầu 5' hệ gen ARN tất chúng có 3' polyA Muelenberg kết luận dựa chuỗi nucleotit, tổ chức hệ gen, cách nhân lên virus xếp chúng vào nhóm virus động mạch (Arterivirus) (Meulenberg cs, 1993) 1.2.2 Phân loại virus PRRS Virus PRRS virus ARN chuỗi đơn, có màng bọc, thuộc giống Arterivirus, họ Arteriviridae, Nidovirales (Cavanagh cs, 1997) Hiện có kiểu gen PRRS cơng nhận là: Kiểu gen (Nhóm 1): Các nhóm virus thuộc dịng Châu Âu với tên gọi phổ thơng virus Lelystad (Meulenberg cs, 1993) Kiểu gen (Nhóm 2): Các nhóm virus thuộc dịng Bắc Mỹ mà tiêu biểu cho chủng chủng virus VR-2332 (Nelsen cs, 1999) Bảng 1.2: Sự tương đồng nucleotide chủng PRRS so sánh với chủng Bắc Mỹ VR2332 Chủng Nước phát Tỷ lệ % tương đồng VR2332 Hoa Kỳ 100 Taiwan Đài Loan 97 807/94 Canada 92 Olot Tây Ba Nha 66 110 Hà Lan 66 Khi so sánh di truyền thấy khác rõ rệt (khoảng 40%) kiểu gen Những nghiên cứu gần cho thấy có khác biệt tính di truyền virus phân lập từ vùng địa lý khác Bản thân virus nhóm có thay đổi chuỗi nucelotid cao đến 20%, đặc biệt chủng virus thuộc dòng Bắc Mỹ Chủng Bắc Mỹ có subtyp: VR- 2332, Taiwan 807/94 phân lập Canada Chủng Châu Âu có Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11 subtyp: I 10 phân lập Hà Lan Olot Tây Ban Nha Chính khác biệt đa dạng tính kháng nguyên, khả biến đổi cấu trúc kháng nguyên virus làm tăng khó khăn cho việc sản xuất vacxin chống lại chúng 1.2.3 Sức đề kháng virus PRRS Mặc dù virus PRRS có vỏ bọc, sống sót chúng bên ngồi vật chủ chịu tác động nhiệt độ, pH tiếp xúc với chất tẩy uế PRRSV có khả sống sót khoảng thời gian dài tháng nhiệt độ dao động khoảng – 700C đến – 200C, 20 phút 560C, 24 300C ngày 210C (Benfield cs, 1992) Tuy nhiên khả sống virus PRRS giảm nhanh nhiệt độ tăng lên Bảng 1.3: Sức đề kháng virus với điều kiện ngoại cảnh Điều kiện môi trường Khả đề kháng Virus bệnh phẩm: - 70 C đến -200C Nhiều năm tuần C Giảm 90% hiệu giá tháng 40C Vẫn phát virus ngày 20-21 C Đề kháng tốt 24 37 C Đề kháng tốt 20 phút 56 C Đề kháng tốt pH = 6,5 -7,5 Đề kháng tốt pH7,5 Đề kháng Virus huyết thanh: 72 250C Vẫn phát virus 72 C – 20 C PRRSV bền vững pH dao động khoảng 6,5 đến 7,5 Tuy nhiên tính gây bệnh thực nghiệm giảm pH < 6,0 pH > 7,65 (Paton cs, 1991) Các chất sát trùng thông thường môi trường có pH axit dễ dàng tiêu diệt virus Ánh sáng mặt trời tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12 1.2.4 Khả gây bệnh PRRSV gây bệnh cho lợn, lợn tất lứa tuổi cảm nhiễm, lợn lợn nái mang thai thường mẫn cảm Lợn rừng mắc bệnh Về mặt độc lực, người ta thấy PRRSV tồn dạng: Dạng cổ điển: có độc lực thấp, dạng lợn mắc bệnh có tỷ lệ chết thấp, từ - 5% tổng đàn Dạng biến thể độc lực cao: gây bệnh thực nghiệm chết nhiều lợn (Kegong Tian Yu, 2007); (Tô Long Thành Nguyễn Văn Long, 2008) 1.3 Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản 1.3.1 Đặc điểm chung Đây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn Là bệnh phức tạp, có đặc trưng gây xẩy thai giai đoạn cuối, chết thai thai khô lợn sinh yếu Bệnh có triệu chứng đặc trưng hệ hơ hấp lợn theo mẹ cai sữa lợn thịt đực giống 1.3.2 Động vật cảm nhiễm Virus PRRS gây bệnh cho lợn lứa tuổi, nòi giống mẫn cảm lợn lợn nái mang thai Thông thường virus PRRS gây bệnh cho lợn không gây bệnh cho người động vật khác Tuy nhiên, số loại gia cầm vịt trời (Mallard duck) chứng minh mẫn cảm với virus PRRS virus nhân lên lồi vịt Do đó, vấn đề phát tán virus diện rộng khó tránh khỏi 1.3.3 Cơ chế sinh bệnh phương thức truyền lây *Cơ chế sinh bệnh: Sau xâm nhập vào thể, đích cơng virus đại thực bào, đặc biệt đại thực bào phế nang, phế quản (hình đây) Đây tế bào có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus, virus hấp thụ Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13 thực trình nhân lên tế bào phá huỷ Một tỷ lệ lớn tế bào đại thực bào nang phổi bị virus xâm nhiễm sớm Hình 1.5: Virus PRRS xâm nhập phá hủy tế bào đại thực bào Lúc đầu, PRRSV kích thích tế bào này, sau ngày virus giết chết chúng, virion giải phóng ạt xâm nhiễm sang tế bào khác Ở giai đoạn đầu trình xâm nhiễm PRRSV, dường hiệu giá kháng thể kháng lại loại virus vi khuẩn khác không liên quan thể lợn tăng cao kích hoạt đại thực bào hệ thống miễn dịch Điều dễ gây nhầm lẫn việc đánh giá mức độ miễn dịch bệnh truyền nhiễm thể lợn Khi tế bào đại thực bào bị virus phá huỷ, phản ứng miễn dịch không xảy được, lợn nhiễm bệnh rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch dễ dàng mắc bệnh nhiễm trùng thứ phát Có nhiều báo cáo nhiễm trùng kế phát đàn lợn ổ dịch PRRS, đặc biệt chuồng nuôi lợn sơ sinh Tác nhân chủ yếu liên quan đến nhiễm trùng kế phát là: Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis, Pasteurella multocida Actinobacillus pneuropneumoniae, SIV, EMCV, virus giả dại (Aujeszky), Porcine cytomegalovirus, Porcine respiratory coronavirus Porcine paramyxovirus Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 14 Điều thấy rõ đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, bị nhiễm PRRSV có tăng đột biến tỷ lệ viêm phổi kế phát vi khuẩn vốn sẵn có đường hơ hấp Viêm phổi làm thiếu oxy nên gây rối loạn chuyển hóa thai, thai bị suy dinh dưỡng gây chết thai, sảy thai Lợn chửa kỳ cuối nhu cầu oxy tăng cao phải ni thai, thời kỳ cuối thai tăng trưởng nhanh nên nhu cầu oxy tăng gấp bội, lượng thiếu hụt oxy nghiêm trọng, nên thai hay sảy vào kỳ cuối Sau sảy thai tế bào nội mạc tử cung bị thối hóa, hoại tử nên làm chậm trình sinh lý khác * Phương thức truyền lây Virus có dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu lợn ốm, mang trùng phát tán môi trường Tinh dịch lợn đực giống xác định nguồn phát tán mầm bệnh, virus tinh dịch lây nhiễm sang bào thai Ở lợn mẹ mang trùng, virus lây nhiễm qua bào thai từ giai đoạn thai kỳ trở virus thải qua nước bọt sữa Lợn trưởng thành thải virus 14 ngày lợn lợn choai thải virus tới – tháng Virus có khả phân tán thơng qua hình thức: vận chuyển lợn mang trùng, phân tán theo gió (có thể xa tới km), qua bụi, bọt nước, dụng cụ chăn nuôi dụng cụ bảo hộ lao động nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo số chim hoang dã Sự truyền lây qua khơng khí quan trọng việc phát tán virus PRRS Thực tế chứng minh: vụ dịch nổ Tây Âu gần sau ổ dịch xảy Đức Nguyên nhân vụ dịch giải thích virus có khả truyền qua khơng khí, theo gió tới vùng Tây Âu gây bệnh cho lợn trang trại khu vực chứng minh virus truyền qua khơng khí với khoảng cách lên tới km Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15 Sự lây lan bệnh từ đàn lợn sang đàn lợn khác thường theo tinh dịch phối giống Ngồi cịn đường kim tiêm, nước uống, khơng khí, trùng, vật liệu nhiễm khuẩn, kí chủ khơng phải lợn Ở Pháp 56% đàn mắc bệnh tiếp xúc với lợn bệnh, 20% tinh dịch, 21% vật dụng 3% từ nguồn chưa xác định Zimmerman cs, (1997) gây bệnh qua đường miệng cho vịt trời, ngan, gà lôi với khoảng 104 TCID50/ ml virus PRRS Qua thí nghiệm có khả phân lập virus phân gà ngày sau gây bệnh, gà lôi ngày 12 ngày, vịt trời khoảng ngày Trong thí nghiệm triệu chứng lâm sàng khơng thấy lồi chim chúng khơng có thay đổi phản ứng huyết virus PRRS Nhưng có nghiên cứu chứng minh chim di trú (như vịt trời) bị nhiễm, chúng có khả truyền virus xa Ở sở có lưu hành bệnh, môi trường bị ô nhiễm, bệnh lây lan quanh năm tập trung vào thời kỳ có nhiều lợn nái phối giống bệnh phát sinh thành dịch, với tỷ lệ cao, lợn nái có hội chứng rối loạn sinh sản lợn bị viêm đường hô hấp phổ biến Sự vận chuyển lợn bệnh, lây lan cục qua khơng khí coi phương tiện truyền lây phổ biến 1.3.4 Triệu chứng lâm sàng lợn mắc PRRS Theo ghi nhận nhiều nghiên cứu triệu chứng lâm sàng lợn mắc PRRS cho thấy, lợn bệnh thường có triệu chứng sốt cao, bỏ ăn, mẩn đỏ da, khó thở, táo bón ỉa chảy số triệu chứng khác tuỳ thuộc vào bệnh kế phát loại lợn: - Lợn nái: Các triệu chứng chủ yếu tím âm hộ, sảy thai, thai chết lưu, thai gỗ hàng loạt, đẻ non, lợn đẻ yếu ớt, tỷ lệ tử vong cao Tỷ lệ thai chết tăng lên theo độ tuổi thai: Thai 2,5 tháng tuổi tỷ lệ chết 20%, thai 2,5 tháng tỷ lệ chết 93,75% (Phạm Ngọc Thạch cs, 2007) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 16 Lợn nái giai đoạn nuôi thường lười uống nước, viêm vú, sữa, viêm tử cung âm đạo, mí mắt sưng, táo bón ỉa chảy, viêm phổi - Lợn đực giống: Sốt cao, bỏ ăn, đờ đẫn mê, số có tượng tai xanh Đặc biệt xuất hiện tượng viêm dịch hồn, bìu dái nóng đỏ (chiếm 95%), dịch hồn sưng đau, lệch vị trí (85%), giảm hưng phấn (Lê Văn Năm, 2007) lượng tinh ít, chất lượng biểu hiện: nồng độ tinh trùng C 25% Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18 Tuy nhiên, tính đa dạng loại bệnh lợn nên việc chẩn đoán dựa vào lâm sàng thường khó, dễ nhầm lẫn (về bệnh phổi, bệnh sinh sản khác) Ngoài việc phân lập virus khó 1.3.6.2 Chẩn đốn phương pháp giải phẫu bệnh Đối với lợn con, lợn vỗ béo, lợn chuẩn bị xuất chuồng: Khi mổ khám thấy phổi rắn, có vùng xám hồng Trên tiêu vi thể cho thấy viêm phổi kẽ tăng sinh đa điểm lan tràn làm vách phế nang dầy lên, giảm số lượng tế bào lympho tổ chức lympho… 1.3.6.3 Chẩn đoán phương pháp huyết học Để phát có mặt virus PRRS người ta sử dụng phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA); phương pháp miễn dịch enzym thảm tế bào lớp phản ứng trung hịa virus mơi trường tế bào lớp (VNT); phương pháp miễn dịch bệnh lý sử dụng kháng thể chuẩn để phát virus có mẫu bệnh phẩm lợn bệnh PRRS (Bưtner cs, 2000); (Anette, 1997) Phương pháp ELISA chẩn đốn số lượng mẫu huyết lớn kết nhanh Khi dùng phương pháp phát chủng virus có nguồn gốc Bắc Mỹ chủng có nguồn gốc từ Châu Âu Phản ứng trung hòa virus môi trường tế bào lớp (Virus neutralization test) thị tốt để đánh giá tình trạng bệnh q khứ kháng thể trung hịa tồn năm (Anette, 1997) Tuy nhiên phản ứng trung hòa virus nhạy phản ứng huyết khác kháng thể trung hịa xuất chậm Có thực tế đánh giá kết phản ứng huyết phải cân nhắc đến trạng thái miễn dịch đàn sau tiêm phịng vacxin chưa có phản ứng huyết học phân biệt kháng thể lợn mắc bệnh tự nhiên hay tiêm phịng vac-xin (Anette, 1997) Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19 Kỹ thuật RT- PCR: Dùng phản ứng RT- PCR phân tích mẫu máu (được lấy giai đoạn đầu pha cấp tính) để xác định có mặt virus, phản ứng tương đối nhạy xác Có thể phân lập virus PRRS từ huyết thanh, phổi, hạch amidan,… nhiên virus PRRS có đặc điểm khó phân lập khó quan sát bệnh tích tế bào Virus thích hợp tế bào đại thực bào phổi lợn, nhiên lần phân lập phải sản xuất lại tế bào, lơ tế bào sản xuất có biến đổi khác độ mẫn cảm với virus PRRS khác Trong phịng thí nghiệm PRRS thích ứng loại tế bào như: CL2621, PAM, Marc-145…trong tế bào thận khỉ châu Phi Marc-145 thường sử dụng nhiều (Anette, 1997) 1.3.6.4 Phương pháp nuôi cấy virus tế bào tổ chức Là phương pháp khoa học tiên tiến sử dụng rộng rãi Y học để nghiên cứu virus như: nuôi cấy, phân lập, giám định, chuẩn độ, quan sát hình thái siêu cấu trúc virus đặc biệt dùng môi trường tế bào tổ chức để nuôi cấy vac-xin virus Với nhiều loại virus nhân lên chúng tiến triển song song với thoái hoá tế bào nuôi, số virus gây bệnh cho tế bào đặc trưng Những biến đổi có tính chất đặc trưng gọi huỷ hoại tế bào chủ (Cyto Pathogenic Effect - CPE) ổ tế bào bị hoại tử Có tế bào bị nhiễm virus chưa đến mức bị chết chức tế bào bị thay đổi Căn vào CPE quan sát kính hiển vi quang học đánh giá hiệu ni cấy virus 1.4 Các biện pháp phòng chống dịch Hiện chưa có thuốc đặc trị với PRRS, để làm giảm thiệt hại bệnh chủ yếu theo hướng nâng cao sức đề kháng cho vật nuôi, chữa triệu chứng lâm sàng, giảm nhẹ tập trung vào điều trị bệnh kế phát + Đối với lợn nái giai đoạn chửa kỳ cuối, dùng antiprostaglandin, Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20 acetylsalicylic để làm giảm sốt kéo dài việc mang thai giai đoạn đầu ổ dịch (Tơ Long Thành) + Có thể dùng Clotetracylin bổ sung vào thức ăn để phòng vi khuẩn kế phát (Tô Long Thành) + Giai đoạn lợn ăn cần bổ sung thức ăn có lượng cao + Đảm bảo đủ sữa cho lợn bú + Điều trị ỉa chảy lợn bệnh Cần thực nghiêm ngặt quy trình phịng bệnh thú y: + Đảm bảo chất lượng giống + Vệ sinh môi trường chăn nuôi, đảm bảo ngăn ngừa xâm nhập chủng virus vào trang trại + Vệ sinh phương tiện vận chuyển, làm khô phương tiện vận chuyển giảm lây nhiễm PRRSV + Tiêm phòng định kỳ theo hướng dẫn quan chức + Nâng cao lực cán thú y ý thức người chăn nuôi Một số chế phẩm vacxin PRRS dùng để phòng bệnh * Vacxin BSL-PS1000 Vacxin PRRS nhược độc đơng khơ hệ có nguồn gốc từ chủng JKL-100 thuộc họ Châu Mỹ, liều chứa 105TCID50/1ml Có độ an tồn cao, vacxin an toàn dù chủng cao gấp 20 liều * Vacxin BSK-PS100 Vacxin vơ hoạt chứa chủng PRRSV dịng Châu Âu Một liều vacxin chứa 107,5TCID50/1ml.Vacxin có độ an toàn cao, thử nghiệm chứng minh BSK-PS100 an toàn dù chủng cao gấp 10 liều, vacxin an toàn vật mang thai * Vacxin Amervac-PRRS (nhà sản xuất Laboratorias HIPRA, Si–Tây Ban Nha) Vacxin nhược độc dạng đông khô, chứa PRRSV chủng Châu Âu VP046BIS, liều chứa 103,5TCID50/1ml Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21 * Vacxin Solvente/A3 (Blanco), Solvent/A3 (White), lọ 20ml Tiêm bắp cổ sâu, liều 2ml/con * Vacxin Porcillis PRRS Hà Lan Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu lợn tuần tuổi gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV – BN10 cung cấp phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú Y 2.2 Nội dung nghiên cứu - Gây bệnh thực nghiệm cho lợn chủng virus PRRSV-BN-10 - Xác định triệu chứng lâm sàng, hàm lượng kháng thể lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 - Nghiên cứu bệnh tích đại thể lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 - Nghiên cứu bệnh tích vi thể quan, tổ chức lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 2.3 Địa điểm, thời gian nghiên cứu - Địa điểm: Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú y, phịng thí nghiệm Bộ mơn Bệnh lý thú y, phịng ni động vật thí nghiệm – Khoa Thú y – Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội 2.4 Nguyên liệu 2.4.1 Virus Virus sử dụng chủng virus PRRS – BN10, cung cấp phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú Y, chủng virus phân lập từ lợn mắc PRRS, hiệu giá virus 106TCID50/ml 2.4.2 Động vật thí nghiệm Động vật thí nghiệm gồm lợn tuần tuổi có khối lượng kg/con Lợn thí nghiệm chọn lợn không mắc PRRSV số virus khác Dịch tả lợn, Lở mồm long móng, Circo virus, Rota virus khơng có kháng thể kháng PRRSV Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23 2.4.3 Hóa chất Hố chất sử dụng làm tiêu vi thể, ni cấy tế bào, nhuộm hóa miễn dịch: Formol 10%, cồn, xylen, parafin, thuốc nhuộm haematoxylin, thuốc nhuộm eosin, môi trường nuôi cấy DMEM, FBS, kháng sinh, DMSO, trypsin, EDTA, PBS, kháng thể kháng PRRS, kháng kháng thể tương ứng chẩn đoán PRRS, muối NaHCO3… 2.4.4 Dụng cụ - Tủ lạnh, tủ ấm 370C, tủ sấy, buồng cấy vô trùng - Máy đúc tự động, máy cắt Microtom, máy ly tâm lạnh, máy votex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp ảnh gel - Các dụng cụ khác gồm: Lam kính, kính hiển vi, bình ni cấy tế bào, ống eppendoft, pipet, găng tay… 2.5 Phương pháp nghiên cứu 2.5.1 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm - Bố trí thí nghiệm: Lơ thí nghiệm dùng con, lơ đối chứng dùng Thí nghiệm: Khu thí nghiệm đảm bảo có độ an tồn sinh học cấp II: Khu ni động vật thí nghiệm vệ sinh sẽ, thường xuyên phun thuốc sát trùng dụng cụ sử dụng quy định vô trùng khơng để lây nhiễm mầm bệnh từ bên ngồi vào từ phòng gây nhiễm sang phòng đối chứng Quy trình gây nhiễm PRRS cho lợn thực nghiệm bao gồm bước sau: Bước 1: Chọn lợn Chọn lợn tháng tuổi có trọng lượng từ kg/con, giống lợn Landrac Lợn chọn lợn không mắc PRRSV số virus khác Dịch tả lợn, Lở mồm long móng, Circo virus, Rota virus khơng có kháng thể kháng PRRSV Bước 2: Theo dõi lợn trước gây nhiễm Chọn lợn xong cần phải theo dõi lợn thời gian trước gây nhiễm, vừa để lợn thích nghi với điều kiện sống vừa để quan sát biểu bất thường lợn Ở tiến hành theo dõi ngày trước gây nhiễm Hằng ngày phải theo dõi nhiệt độ lợn, kiểm tra nhiệt độ lần ngày vào buổi sáng sáng trước cho ăn (7- sáng), theo dõi tình trạng sức khỏe, Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 24 tình hình ăn uống, tình trạng lơng da cân nặng lợn Lấy máu kiểm tra xem có kháng thể PRRS máu hay không, đồng thời kiểm tra xem lợn có mắc bệnh truyền nhiễm khác khơng… Lợn gây nhiễm phải khỏe mạnh, âm tính với PRRS không mắc bệnh truyền nhiễm khác FMD, PCV2, Rota virus… Lợn khơng có kháng thể kháng PRRSV, âm tính với bệnh truyền nhiễm ta tiến hành gây nhiễm cho lợn Bước 3: Gây nhiễm cho lợn Gây nhiễm cho lợn phương pháp khí dung Đưa virus PRRS vào thể lợn qua đường nhỏ mũi với liều 106 TCID50 3ml/con Bước 4: Theo dõi lợn sau gây nhiễm Sau gây nhiễm PRRSV cần phải theo dõi lợn ngày: + Theo dõi nhiệt độ lợn ngày vào buổi sáng buổi chiều + Theo dõi tình trạng ăn uống,tình trạng sức khỏe + Cần lấy máu định kì vào thời điểm 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17 21 ngày sau gây nhiễm để kiểm tra virus huyết + Lấy dịch swab, dịch mắt, phân ngày để kiểm tra nồng độ virus thể lợn + Theo dõi xem gây nhiễm có thành cơng hay khơng dựa triệu chứng điển hình lợn mắc bệnh PRRS xét nghiệm máu Bước 5: Mổ khám Khi lợn chết hay kết thúc gây nhiễm tiến hành mổ khám lợn để quan sát bệnh tích đại thể làm tiêu kiểm tra bệnh tích vi thể, đồng thời làm tiêu nhuộm hóa mơ miễn dịch để xem phân bố virus quan thể đưa kết luận độc lực virus dựa khả gây bệnh chúng cho lợn 2.5.2 Phương pháp ELISA Các bước thực phản ứng ELISA: Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ kit ELISA để nhiệt độ phòng Lấy từ túi dụng cụ có giếng chứa kháng thể Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 Bước 2: Bổ sung 100µl mẫu pha lỗng DWP (Deep-wellplate) vào giếng Bước 3: Tiếp tục bổ sung thêm 100µl thuốc thử đối chứng dương đối chứng âm vào giếng xác định Bước 4: Ủ giếng ELISA có phủ kháng nguyên nhiệt độ 220C - 270C thời gian 30 phút Bước 5: Dùng 300ul buffer 1X rửa đĩa ELISA có phủ kháng nguyên, rửa lần mày rửa ELISA tự động Bước 6: Đổ bỏ dung dịch buffer thừa Bước 7: Bổ sung 100µl kháng thể HRPO (anti – swine IgG) vào giếng, sau ủ ấm vịng 30 phút Bước 8: Dùng 300ul buffer 1X rửa kháng nguyên lần sau đổ bỏ dung dịch cịn thừa, giống bước bước Bước 9: Bổ sung thêm 100µl TMB substrate Ủ 15 phút nhiệt độ phịng phản ứng dương tính phủ kháng ngun rõ màu xanh Bước 10: Thêm vào 50µl TMP để dừng phản ứng, lúc màu sắc chuyển sang màu vàng Bước 11: Đọc kết máy đọc ELISA bước sóng 450nm - Kết quả: Độ hấp thụ quang (OD) mẫu phân tích Kiểm tra hiệu lực: * Nếu OD ≥ 0,5 dương tính (PC) * Nếu OD ≤ 0,3 âm tính (NC) Tính tốn: CPC = OD (PC) – OD (NC) SP = [OD (của mẫu phân tích) – OD (NC)]/CPC + Nếu SP ≥ 0,4 dương tính + Nếu 0,3 ≤ SP ≤ 0,4 nghi ngờ + Nếu SP ≤ 0,3 âm tính Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26 2.5.3 Phương pháp RT – PCR a Phương pháp tách chiết RNA tổng số hóa chất Hóa chất cần chuẩn bị: Trizol, Chloroform, Isopropyl alcohol (2 – propanol), Ethanol 75%, RNAse – free water Các bước tiến hành: Bước 1: Lấy 100µl virus PRRS vào ống eppendorf 1,5ml Bước 2: Bổ sung 1ml Trizol vào ống lắc đều, giữ phút nhiệt độ phòng Bước 3: Bổ sung thêm 0,2ml chloroform vào ống lắc giữ phút nhiệt độ phòng Bước 4: Ly tâm dung dịch 12 000 vòng 15 phút 40C Bước 5: Chuyển 350µl dịch phía sang ống bổ sung 500µl isopropyl alcohol, giữ nhiệt độ phòng 10 phút Bước 6: Ly tâm dung dịch 12 000 vòng 10 phút 40C Bước 7: Loại bỏ dịch giữ lại cặn, bổ sung 1ml ethanol 75% lắc đều, ly tâm dung dịch 7500 vòng phút 40C Bước 8: Loại bỏ dịch giữ lại cặn để khơ tự nhiên nhiệt độ phịng Bước 9: Bổ sung 50µl Rnase – free water, lắc bảo quản RNA b Phương pháp RT – PCR Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR: Mẫu RNA sau tách chiết hỗn hợp với thành phần phản ứng trình bày bảng sau: Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (µl) 2X Reaction Mix 12,5 Mẫu RNA 5,0 Primer Forward 0,5 Primer Reverse 0,5 RT/Platium Taq Mix 0,5 Nước cất 6,0 Tổng thể tích 25 Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27 Các mồi sử dụng phản ứng RT-PCR: Mồi xuôi: ATG TTG GGG AAG TGC TTG ACC Mồi ngược: CTA GAG ACG ACC CCA TTG TTC Các mồi nhằm khuếch đại đoạn gen ORF5 có kích thước 603 bp virus PRRS Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau: Nhiệt độ (oC) Thời gian Tổng hợp cDNA 50 30 phút Duỗi mạch 95 phút Duỗi mạch 95 15 giây Gắn mồi 50 30 giây Tổng hợp sợi 72 phút Hoàn chỉnh 72 phút Giữ sản phẩm ∞ Giai đoạn Bước tổng hợp Số chu kỳ 35 Sản phẩm phản ứng RT – PCR kiểm tra phương pháp điện di c Phương pháp điện di Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm gel Dung dịch đệm thường sử dụng điện di agarose polyacrylamid TBE TAE, nghiên cứu sử dụng TAE agarose để tạo gel Bản gel chuẩn bị dung dịch đệm TAE 1X hòa tan với 1,5 gram agarose đặt lị vi sóng 1000C phút, đổ vào khn có lược cài sẵn để tạo gel với giếng tra mẫu cần điện di Khi gel đông cứng đặt gel vào bể điện di đổ dung dịch đệm TAE ngập gel khoảng – 5mm Bước 2: Tra mẫu điện di Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT – PCR, trộn hỗn dịch pipet chuyển vào giếng thạch Điện di đồng thời thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng – 6µl DNA Marker Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28 Bước 3: Chạy điện di Nguồn điện điện di thường sử dụng hiệu điện 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di 30 phút Bước 4: Nhuộm gel đọc kết Kết thúc điện di, gel lấy nhuộm Ethidium bromide SYBR green từ đến phút Sau nhuộm gel chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết điện di Vị trí đoạn DNA phát vệt sáng tương ứng thuốc nhuộm, chụp ảnh lưu kết 2.5.4 Phương pháp quan sát, mô tả Lợn theo dõi ngày: đo thân nhiệt, đo nhịp hô hấp nhịp tim, quan sát ghi chép biểu lâm sàng 2.5.5 Phương pháp mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể Mổ khám theo quy trình Bộ môn Bệnh lý Thú y để xác định biến đổi đại thể quan, tổ chức lợn mắc PRRS Chúng mổ khám lợn chết vào ngày 12, số lợn thí nghiệm khơng chết đối chứng mổ khám vào ngày thứ 21 sau gây nhiễm Xác lợn bệnh cố định cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ, thu dịch swabs (dịch tự nhiên thể nhử mắt, nước mũi, dịch ngoáy hầu họng) từ thể có Bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách quan nội tạng khỏi thể quan sát biến đổi chụp ảnh Tiến hành thu mẫu quan như: phổi, hạch, tim, gan, lách, thận, não để làm tiêu vi thể 2.5.6 Phương pháp làm tiêu kiểm tra bệnh tích vi thể Từ mẫu bệnh phẩm có biến đổi đại thể cần tiến hành làm tiêu để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu bệnh Phương pháp làm tiêu vi thể theo quy trình tẩm đúc parafin, nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE) theo phương pháp Bộ môn Bệnh lý Thú y, Khoa thú y Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Các bước trình làm tiêu vi thể sau: - Khử formol: + Mục đích để rửa formol + Sau cố định bệnh phẩm dung dịch formol 10% từ – 10 ngày, Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29 lấy tổ chức khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng tổ chức theo chiều dài có độ dài - mm xâu thành dây cho miếng bệnh phẩm cách 0,5 cm Trên đầu dây có gắn mẩu giấy ghi tên bệnh phẩm Sau đem rửa nước chảy nhẹ tối thiểu 24 - Khử nước: Lấy bệnh phẩm khỏi hệ thống cồn thấm nhẹ giấy lọc, cho qua hệ thống gồm lọ cồn: + Cồn 900I: + Cồn 900II: + Cồn 1000I: + Cồn 1000II: 12 - Khử cồn: Lấy bệnh phẩm khỏi hệ thống cồn thấm nhẹ giấy lọc, cho vào hệ thống cốc đựng xylen: + Xylen I: + Xylen II: + Xylen III: 12 - Khử xylen: Cho qua hệ thống cốc đựng paraffin: + Paraffin I: (Ở 560C) + Paraffin II: (Ở 560C) + Paraffin III 12 (Ở 560C) - Đúc Block: + Tháo tổ chức khỏi xâu đặt vào ngăn chứa paraffin lỏng Đổ paraffin lỏng vào khn Dùng kẹp hơ nóng nhúng nhanh vào ngăn để gắp miếng tổ chức đặt vào khuôn + Chừng 10 giây chất paraffin lỏng tiếp xúc với khuôn tạo nên màng mỏng bệnh phẩm định hướng Sau đặt khn đúc sang bàn lạnh máy làm nguội block + Bóc khuôn, chỉnh sửa lại block cho vuông vắn gắn nhãn tránh nhầm lẫn - Cắt mảnh dán mảnh: Cắt dán mảnh: Cắt miếng tổ chức máy cắt microtom với độ dày - Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 30 3µm Miếng tổ chức sau cắt tãi phẳng phiến kính nhờ cho vào bình nước ấm Chờ cho miếng tổ chức khô cho vào tủ ấm 370C 12 - 24 - Nhuộm tiêu bản: Nhuộm tiêu theo phương pháp nhuộm kép thuốc nhuộm Hematoxylin - Eosin Các bước nhuộm sau: + Tẩy paraffin: Cho qua hệ thống lọ xylen: Xylen I: 1h, Xylen II: 1h, Xylen III: 1h Sau phải lau hết phần xylen quanh tiêu chuyển sang cồn + Tẩy Xylen: Cho tiêu qua hệ thống gồm hai lọ gồm lọ cồn ethylic: Lọ 1: Cồn 1000 I: 10 phút, Lọ 2: Cồn 1000 II: 10 phút, Lọ 3: Cồn 1000: 10 phút + Nhuộm Hematoxylin: Sau rửa tiêu qua nước chảy vòng 10 phút ta đem lau khô nước xung quanh tiêu bản, đặt tiêu lên giá để nhỏ Hematoxylin ngập tiêu bản, để vòng 10 - 15 phút Sau đổ thuốc nhuộm đi, cho rửa nước chảy vòng 10 phút cho hết Hematoxylin thừa Đem lau nước xung quanh tiêu vẩy khô Kiểm tra màu sắc, thấy tiêu có màu xanh tím Nếu nhạt màu nhúng tiêu qua NaHCO3 1% (30 giây) Nếu đậm nhúng tiêu vào lọ cồn axit (cồn 600 + HCl, tỷ lệ HCl 1%) 30 giây + Nhuộm Eosin: Nhỏ Eosin ngập tiêu khoảng 10 phút tùy theo thực tế màu eosin Sau rửa nước chảy 10 phút cho hết eosin thừa Sau rửa nước ta lau phần nước xung quanh bệnh phẩm cho vào nước cất lam kính + Tẩy nước: Ta cho tiêu qua hệ thống : Cồn 900I: 15 giây Cồn 1000I: 15 giây Cồn 1000II: 15 giây + Tẩy cồn làm tiêu bản: Cho tiêu qua xylen I sang xylen II, ta lau cồn xung quanh lam kính rối chuyển sang xylen III sang xylen IV, sau Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 31 cho vào xylen làm nóng tủ ấm 370 vòng phút - Gắn Baume canada: Nhỏ giọt Baume canada, xylen ấm lên lamen gắn nhanh lên tiêu xylen ấm lên tiêu Ấn nhẹ để dồn hết bọt khí ngồi - Đánh giá kết quả: Đem soi kính hiển vi quang học với vật kính 10 Nếu thấy nhân bắt màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu sáng, nước, khơng có bọt khí 2.5.7 Phương pháp thống kê, xử lý số liệu Thống kê triệu chứng, nhiệt độ, số lượng bạch cầu, hàm lượng kháng thể… sau thời gian gây nhiễm virus, xử lý số liệu vẽ biểu đồ biểu diễn tiến triển bệnh, nhiệt độ, số lượng bạch cầu, số lượng kháng thể …bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2003 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết trước gây bệnh thực nghiệm cho lợn 3.1.1 Kết theo dõi thân nhiệt lợn trước gây bệnh thực nghiệm Thân nhiệt thể gia súc tương đối ổn định, thay đổi phạm vi hẹp Nhiệt độ thể gia súc yếu tố quan trọng để đánh giá trạng thái sinh lý vật Nhiệt độ sinh lý bình thường lợn dao động 38 – 39oC Để đánh giá trạng thái sinh lý lợn trước gây bệnh thực nghiệm, tiến hành theo dõi ăn uống, đo thân nhiệt lợn hàng ngày vào thời điểm khoảng – sáng trước cho ăn ngày trước gây bệnh thực nghiệm Kết kiểm tra thân nhiệt lợn chuẩn bị làm thí nghiệm trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1: Bảng đo thân nhiệt lợn trước gây bệnh thực nghiệm (0C) Ngày Lợn TN1 Lợn TN2 Lợn TN3 ĐC1 ĐC2 38,2 38,3 38,0 38,1 38,4 38,1 38,2 38,4 38,3 38,0 38,2 38,4 38,3 38,1 38,2 38,3 38,3 38,1 38,4 38,0 38,4 38,0 38,2 38,0 38,1 38,3 38,2 38,1 38,2 38,3 38,0 38,1 38,5 38,0 38,1 Qua bảng 3.1 hình 3.1 ta thấy nhiệt độ trước gây bệnh thực nghiệm lợn diễn biến tương đối đồng đều, ổn định dao động khoảng phạm vi hẹp 38 – 38,5oC, nằm khoảng dao động nhiệt độ sinh lý bình thường lợn Diễn biến thân nhiệt lợn minh họa Hình 3.1 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 33 Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn thân nhiệt lợn trước gây bệnh thực nghiệm 3.1.2 Kết xét nghiệm kháng thể kháng virus PRRS phương pháp Elisa Elisa phương pháp quan trọng để xác định kháng thể PRRS huyết Trước gây bệnh thực nghiệm, lợn theo dõi vòng tuần thấy lợn khỏe mạnh, ăn uống bình thường, khơng sốt, khơng có ỉa chảy khơng có biểu bất thường Tiến hành lấy máu lợn, chắt huyết kiểm tra tồn kháng thể kháng PRRSV phương pháp ELISA Kết trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2: Kết xét nghiệm kháng thể kháng PRRSV phương pháp ELISA Lợn TN1 TN2 TN3 SP 0.20 0.21 0.20 Kết - ĐC1 0.18 - ĐC2 0.21 Ghi chú: (+) Dương tính; (-) Âm tính - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 Theo hướng dẫn nhà cung cấp kít Elisa, phương pháp Elisa thực Kít Median với tiêu đánh sau: + SP≥ 0,4: Dương tính + 0,3 ≤ SP ≤ 0,4: Nghi ngờ + SP ≤ 0.3: Âm tính Nhìn vào bảng 3.2 cho thấy 05 lợn nghiên cứu có số SP dao động khoảng từ 0,18 – 0,21 (đều < 0,3) có nghĩa huyết lợn không chứa kháng thể kháng PRRSV Hàm lượng kháng thể PRRSR chúng tơi biểu diễn qua đồ thị Hình 3.2 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn hàm lượng kháng thể kháng PRRSV trước gây bệnh thực nghiệm Đồ thị 3.2 thể rõ nét số SP 05 lợn < 0,3 Như vậy: lợn chọn nghiên cứu khơng có kháng thể kháng PRRSV máu 3.1.3 Kết xét nghiệm có mặt virus PRRS số virus khác phương pháp RT – PCR Đồng thời với việc kiểm tra tồn kháng thể kháng PRRSV phương pháp ELISA, tiến hành kiểm tra có mặt virus PRRS số virus khác phương pháp RT – PCR Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35 Kết trình bày bảng 3.3 hình 3.3: Bảng 3.3: Kết xét nghiệm có mặt virus PRRS số virus khác phương pháp RT – PCR STT Lợn PRRS PCV2 LMLM DTL PED TGE TN1 - - - - - - TN2 - - - - - - TN3 - - - - - - ĐC1 - - - - - - ĐC2 - - - - - - Ghi chú: (+) Dương tính; (-) Âm tính PCV2 : Hội chứng cịi cọc sau cai sữa virus Porcine circovirus type (PCV2) gây LMLM: Bệnh lở mồm long móng DTL: Bệnh dịch tả lợn PED: dịch tiêu chảy lợn TGE: Bệnh viêm dày ruột truyền nhiễm Hình 3.3: Kết phản ứng RT – PCR với mồi ORF5 trước gây bệnh thực nghiệm [Virus PRRS phát phản ứng RT – PCR với độ dài gen 603bp, thang chuẩn M 100bp; giếng từ – mẫu lợn nghiên cứu; giếng đối chứng âm (nước sinh lý); giếng đối chứng dương (PRRSV) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36 Theo bảng 3.3 hình 3.3 ta thấy, toàn lợn cho kết âm tính với virus PRRS, PCV2, FMD, DTL, LMLM, PED, TGE Từ kết luận: lợn chọn nghiên cứu hồn tồn bệnh, khơng có kháng thể kháng PRRSV, âm tính với FMD, PVC2, DTL, PED … Từ kết nghiên cứu đến kết luận: 05 lợn đủ điều kiện đối tượng trình nghiên cứu, gây bệnh thực nghiệm 3.2 Kết sau gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 Sau có kết nghiên cứu: 05 lợn hoàn toàn khỏe mạnh, đủ điều kiện đối tượng trình nghiên cứu, tiến hành gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 cho lợn thí nghiệm với liều 106TCID50 3ml/con qua đường niêm mạc mũi Sau gây bệnh thực nghiệm tiến hành theo dõi chặt chẽ biểu lợn, lấy máu thường xuyên để kiểm tra có mặt virus thể lợn Hình 3.4: Gây bệnh thực nghiệm cho lợn thí nghiệm 3.2.1 Triệu chứng lâm sàng lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 3.2.1.1 Thân nhiệt lợn sau gây bệnh thực nghiệm Kiểm tra thân nhiệt khâu quan trọng thiếu chẩn đoán lâm sàng Căn vào nhiệt độ thể thấy phần mức độ ảnh hưởng bệnh với thể lợn phản ứng đáp ứng lợn với bệnh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 37 Để đánh giá tình trạng sức khỏe lợn sau gây bệnh thực nghiệm, tiến hành theo dõi ăn uống, đo thân nhiệt lợn hàng ngày vào thời điểm khoảng – sáng trước cho ăn 21 ngày sau gây bệnh thực nghiệm Kết kiểm tra thân nhiệt lợn sau gây bệnh thực nghiệm trình bày bảng 3.4 Xem bảng 3.4, ta thấy lợn có biểu sốt ngày thứ trở Lợn TN1: ngày đầu sau gây nhiễm khơng có biểu sốt, đến ngày thứ có tượng sốt, sốt cao liên tục ngày, cao vào ngày thứ 10 nhiệt, độ lên đến 41,80C kèm theo biểu khó thở, chảy nước mũi táo bón, đến ngày thứ 11 nhiệt độ giảm xuống ngày thứ 12 nhiệt độ 370C, lợn chết Bảng 3.4: Thân nhiệt lợn sau gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN -10 (0C) Ngày 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 TN1 38,2 38,5 39,5 39,7 40,9 40,5 41,5 41,5 41,4 41,8 39,7 37,0 - TN2 38,3 38,3 39,4 39,5 39,8 40,3 40,4 41,2 40,9 40,3 39,8 40,1 39,5 39,2 39,4 38,7 38,4 38,2 38,0 38,5 38,5 TN3 38,0 38,2 39,1 39,5 39,6 40,5 40,8 40,7 41,2 40,2 40,0 39,8 39,9 39,6 40,4 39,4 39,7 38,5 38,4 38,6 38,6 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp ĐC1 38,2 38,5 38,3 38,4 38,2 38,3 38,2 38,2 38,3 38,0 38,5 38,0 38,2 38,4 38,0 38,2 38,3 38,2 38,2 38,3 38,4 ĐC2 38,4 38,2 38,3 38,2 38,2 38,3 38,4 38,2 38,5 38,3 38,4 38,2 38,3 38,2 38,3 38,0 38,5 38,0 38,2 38,4 38,0 Page 38 Lợn TN2: sốt cao, sốt lên xuống, sốt cao vào ngày thứ 8, nhiệt độ lên đến 41,20C với triệu chứng thở khó rõ rệt, lợn ngồi thở chó ngồi Sau nhiệt độ giảm xuống dần dần, từ thứ 17 trở lợn hết sốt Lợn TN3: sốt cao vào ngày thứ lên đến 41,20C, ngày sau lợn sốt mức độ trung bình từ ngày thứ 18 trở lợn hết sốt Theo 03 ngày đầu lợn chưa sốt số lượng virus chưa nhiều nên thể lợn điều tiết thân nhiệt Sau 03 ngày, virus nhân lên lượng đủ lớn để gây triệu chứng bệnh lý gây sốt cho lợn Từ ngày thứ 17, 18 trở thể lợn thích nghi, tăng cường sức đề kháng chống lại mầm bệnh lúc máu xuất lượng kháng thể định kháng lại virus nên thân nhiệt lợn thí nghiệm dần ổn định dao động khoảng nhiệt độ sinh lý bình thường Các lợn đối chứng: nhiệt độ phạm vi sinh lý bình thường Kết kiểm tra thân nhiệt lợn trước sau gây bệnh thực nghiệm cịn chúng tơi so sánh biểu diễn qua hình 3.5 Hình 3.5: Đồ thị thân nhiệt độ lợn trước sau gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39 Qua hình 3.5 cho thấy: Có biến động lớn thân nhiệt lợn trước sau gây bệnh thực nghiệm, lợn đối chứng lợn gây bệnh thực nghiệm Trước gây bệnh thực nghiệm: Sóng thân nhiệt lợn dao động nhỏ phạm vi sinh lý bình thường lợn : 38 – 38,50C Sau gây bệnh thực nghiệm sóng thân nhiệt lợn thí nghiệm có biến động mạnh, thân nhiệt lợn có thời điểm lên đến 41,80C thân nhiệt lợn cao vào ngày thứ 8, 9, 10 sau gây bệnh thực nghiệm Các lợn đối chứng tưng tự lợn trước gây bệnh thực nghiệm: sóng thân nhiệt dao động nhỏ quanh ngưỡng thân nhiệt sinh lý bình thường lợn (38 – 38,50C) 3.2.1.2 Tần số hô hấp lợn sau gây bệnh thực nghiệm Tần số hơ hấp số lần hít vào thở phút Sự biến đổi tần số hô hấp triệu chứng quan trọng để chẩn đốn bệnh Chúng tơi tiến hành dùng ống nghe nghe vùng phổi kết hợp với việc quan sát lên xuống hõm hông lợn phút để xác định tần số hô hấp lợn trước sau gây bệnh thực nghiệm Kết trình bày bảng 3.5 Hình 3.6 Qua kết bảng 3.5 Hình 3.6 cho thấy tần số hơ hấp lợn thí nghiệm tăng mạnh so với tiêu sinh lý bình thường Sau tiêm virus PRRS tần số hô hấp tất lợn thí nghiệm tăng lên 84 - 94 lần/phút Trong đó, tần số hơ hấp lợn đối chứng lợn trước gây bệnh thực nghiệm dao động 19 – 23 lần/phút, tăng gấp lần so với trước gây bệnh thực nghiệm Theo chúng tôi, tần số hô hấp tăng cao giai đoạn đầu sau gây bệnh phản ứng phịng vệ nhằm giảm bớt thân nhiệt Tuy nhiên triệu chứng nguyên phát tổn thương phổi Trong lâm sàng, tăng thân nhiệt tăng tần số hô hấp thường song hành, tương tác lẫn việc nhiệt độ thể tăng, tăng nhu cầu oxy, tăng axit máu nguyên nhân dẫn đến tần số hô hấp vật tăng Điều chứng tỏ chủng virus PRRS-BN-10 làm cho vật rối loạn thân nhiệt dẫn đến rối loạn hô hấp tăng hơ hấp tác động điều hịa thân nhiệt Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40 Bảng 3.5 Tần số hô hấp lợn trước sau gây bệnh thực nghiệm cho lợn chủng virus PRRSV-BN-10 (lần/phút) TN1 TN2 TN3 ĐC1 ĐC2 21 22 21 21 23 21 20 20 19 20 20 19 18 19 19 19.67± 19.66 ± 20.63 ± Thời gian theo dõi Trước gây nhiễm virus Tổng hợp trước gây nhiễm virus ( X ± mx) Sau gây nhiễm virus 20.67±1 20.33±1.3 03 1.55 1.26 0.57 21 22 20 19 20 28 31 31 21 22 50 42 39 19 18 81 80 78 20 20 85 84 93 19 21 87 89 94 18 21 93 93 92 20 18 90 92 89 22 18 91 90 88 21 20 10 85 84 93 23 21 11 87 89 94 20 17 12 93 93 92 22 18 13 80 78 20 20 14 84 93 19 21 15 74 93 19 21 16 69 74 18 19 17 73 72 20 18 18 42 49 19 18 19 46 46 20 18 20 47 49 22 18 21 52 50 19 18 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 41 Hình 3.6: Biểu đồ tần số hô hấp lợn trước sau gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV- BN-10 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42 3.2.1.3 Tần số tim mạch lợn sau gây bệnh thực nghiệm Tim co bóp ngày lẫn đêm suốt đời theo nhịp điệu định gọi chu kỳ tim Khi tim co gọi tâm thu, tim giãn gọi tâm trương Tần số tim mạch xác định số lần co bóp tim phút Nhịp tim thể cường độ trao đổi chất, trang thái sinh lý, bệnh lý thể tim Vì vậy, với việc kiểm tra thân nhiệt tần số hô hấp, tiến hành kiểm tra tần số tim lợn trước sau gây bệnh thực nghiệm cho lợn chủng PRRSV-BN-10 Kết trình bày bảng 3.6 hình 3.7 Bảng 3.6 Tần số tim lợn trước sau gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 (lần/phút) Thời gian theo dõi TN1 TN2 TN3 ĐC1 ĐC2 Tổng hợp trước gây bệnh thực nghiệm ( X ± mx) 91 90 90 90 90 89 92 90 88 90 89 89 90 90 88 90.33± 0.63 89.67± 1.08 90.33± 1.25 89.33± 1.63 89.63± 1.57 89 115 122 126 125 127 126 124 127 126 130 137 90 109 123 120 127 128 130 127 128 129 127 132 131 127 118 120 97 98 100 111 112 91 116 120 129 125 133 129 130 133 129 131 133 129 125 123 109 120 123 109 120 123 90 91 90 89 90 89 89 90 89 89 90 89 89 90 89 89 90 89 89 90 89 91 91 90 89 91 88 89 91 88 89 91 88 89 91 88 89 91 88 89 91 88 Trước tiêm virus Sau gây bệnh thực nghiệm 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43 Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn nhịp tim lợn sau gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 Qua bảng 3.6 hình 3.7, chúng tơi thấy tần số tim mạch lợn trước gây bệnh thực nghiệm dao động phạm vi 88 – 92 lần/phút Vậy coi trạng thái sinh lý lợn Sau tiêm virus, tần số tim lợn thí nghiệm tăng mạnh108 - 123 lần/phút Sự chênh lệch tần số tim lợn trước sau gây bệnh thực nghiệm lợn thí nghiệm lợn đối chứng lớn Theo số tác giả, sốt, nhiệt độ thể cao ảnh hưởng đến nốt Keithflack tác động lên quan cảm thụ tim, làm tim đập nhanh (Hồ Văn Nam cs, 1996) Khi sốt, tim đập nhanh, nhiệt độ tăng 10C tim tăng lên khoảng 10 nhịp Ngun nhân gây tăng tuần hồn thần kinh giao cảm bị Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44 hưng phấn, so nhiệt độ cao tác động trực tiếp vào thần kinh tự động tim nhu cầu oxy tăng chuyển hóa 3.2.1.4 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 Trong trình gây bệnh thực nghiệm, tiến hành theo dõi, ghi chép triệu chứng lâm sàng lợn dựa tiêu sau: sốt, giảm ăn, bỏ ăn, sưng mí mắt, ho, khó thở, chảy nước mũi, sung huyết vùng da mỏng: tai, bụng, chân, tím tai,… Kết trình bày bảng 3.7: Bảng 3.7: Triệu chứng lâm sàng chủ yếu lợn gây bệnh thực nghiệm Ngày Lợn Sốt Ho Khó thở Giảm ăn, bỏ ăn Sưng Phát mí mắt ban Chảy nước mũi Táo Tím Tiêu bón tai chảy TN1 - - - - - - - - - - TN2 - - - - - - - - - - TN3 - - - - - - - - - - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 - - - - - - - - - - TN2 - - - - - - - - - - TN3 + - - - - - - - - - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 + - + + + - + - - - TN2 + - + + + - + - - - TN3 + - + + + - + - - - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 ++ + + + + - ++ - - - TN2 ++ - + + + - + + - - TN3 ++ - ++ + + + + - - - ĐC1 - - - - - - - - - - Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 Ngày 10 Lợn Sốt Ho Khó thở Giảm ăn, bỏ ăn Sưng Phát mí mắt ban Chảy nước mũi Táo Tím Tiêu bón tai chảy ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 ++ ++ ++ ++ + + ++ - - - TN2 ++ - + + + + + + - - TN3 ++ - + + + + + - - - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 +++ + +++ ++ +++ ++ +++ + - - TN2 ++ + ++ ++ + + ++ + - - TN3 ++ + ++ ++ + + ++ + - - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 +++ + +++ ++ +++ ++ +++ ++ - - TN2 ++ + +++ ++ ++ + ++ ++ - - TN3 +++ + ++ ++ + + ++ + - - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 ++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ + - TN2 ++ ++ +++ ++ ++ + ++ ++ - - TN3 +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + - - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 ++ ++ +++ +++ ++ +++ ++ + + - TN2 +++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ + - TN3 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + - - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 +++ ++ +++ +++ ++ ++ + + ++ - TN2 +++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ +++ + - TN3 ++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ + - Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp + Page 46 Ngày 11 12 13 14 15 16 Lợn Sốt Ho Khó thở Giảm ăn, bỏ ăn Sưng Phát mí mắt ban Chảy nước mũi Táo Tím Tiêu bón tai chảy ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 + ++ +++ +++ +++ + + + ++ - TN2 +++ ++ +++ + ++ ++ +++ ++ ++ - TN3 ++ ++ +++ + ++ ++ +++ + + - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 - + +++ +++ +++ ++ + - +++ + TN2 +++ ++ +++ + ++ ++ +++ +++ ++ - TN3 ++ ++ +++ + ++ ++ +++ + + - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 c c c c c c c c c c TN2 +++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ - TN3 ++ - ++ ++ ++ + +++ + + - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 c c c c c c c c c c TN2 ++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ - TN3 ++ + +++ + + + + + ++ - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 c c c c c c c c c c TN2 ++ + ++ + + + ++ ++ ++ - TN3 +++ + +++ + + + + + ++ - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 c c c c c c c c c c TN2 + - + - + - ++ + + - Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47 Ngày 17 18 19 20 21 Lợn Sốt Ho Khó thở Giảm ăn, bỏ ăn Sưng Phát mí mắt ban Chảy nước mũi Táo Tím Tiêu bón tai chảy TN3 ++ + ++ + + + + - + - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 c c c c c c c c c c TN2 + - - - - - ++ - + - TN3 ++ - + - + + + - + - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 c c c c c c c c c c TN2 + - - - - - + - - - TN3 + - + - - - + - - - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 c c c c c c c c c c TN2 + - - - - - + - - - TN3 + - ++ - - + + - - - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 c c c c c c c c c c TN2 - - + - - - - - - - TN3 + - + - - - - - - - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - TN1 c c c c c c c c c c TN2 - - + - - - + - - - TN3 - - + - + - + - - - ĐC1 - - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - - Ghi chú: (+++) nặng, (++) trung bình, (+) nhẹ, (-) khơng biểu hiện, (c) chết Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48 Qua bảng 3.7 ta thấy triệu chứng lâm sàng quan sát lợn sốt, ho, khó thở, thở thể bụng, ngồi thở chó ngồi, giảm ăn, sưng mí mắt, viêm kết mạc mắt, chảy nước mũi, phát ban xuất lợn biểu rõ rệt vào ngày thứ 6, 7, 8, 9,10 sau gây bệnh thực nghiệm Lợn TN1 ngày thứ sau gây bệnh thực nghiệm bắt đầu sốt sốt tăng dần vào ngày thứ 6, 7, 8, 9, 10 kèm theo triệu chứng quan sát chảy nước mũi, viêm kết mạc mắt, lợn khó thở, mệt mỏi, táo bón, đến ngày thứ 11 nhiệt độ hạ lợn thở khó, xuất hiện tượng tiêu chảy, nhiệt độ giảm mạnh vào ngày thứ 12 38 0C sau lợn chết Lợn TN2, TN3 biểu triệu chứng lâm sàng rõ rệt vào ngày thứ 9, 10, 11 sốt cao, ho, thở khó, ngồi thở chó ngồi, mệt mỏi, ủ rũ, bỏ ăn, phát ban vùng da mỏng da bụng, bẹn,… lợn trì mức độ triệu chứng đến ngày 16 với biểu lâm sàng ln tình trạng báo động, ngày sau mức độ triệu chứng giảm dần, cịn sốt nhẹ, tượng thở khó biểu mức độ nhẹ, lợn trở lại trạng thái ăn uống bình thường Riêng với lợn đối chứng khơng có biểu * Rối loạn hơ hấp Sau gây bệnh thực nghiệm lợn bắt đầu có triệu chứng ho, chảy nước mũi, khó thở từ ngày thứ 3, ban đầu biểu ho, khó thở nhẹ, sau triệu chứng ngày nặng Qua theo dõi có lợn TN1 có triệu chứng ho Biểu ban đầu lợn thường xuyên hắt hơi, mũi có bọt khí, sau chảy nước mũi, nước mũi ban đầu lỗng sau đặc dần, đục, dẫn đến tượng khó thở, mệt mỏi, kèm theo lợn có tượng sốt, ho Sau thời gian ngày, tượng ho, khó thở xuất tất lợn thí nghiệm Biểu ho, khó thở mức nặng với lợn TN1 mức nhẹ với lợn TN2, TN3 Hiện tượng khó thở giải thích virus PRRS có lực cao với đại thực bào đặc biệt đại thực bào phế nang phổi, virus công vào thể đích đến đại thực bào phế nang phổi biểu triệu chứng diễn điển hình phổi Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49 Đại thực bào tế bào có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus Sau xâm nhập vào tế bào đại thực bào chúng nhân lên phá hủy nhanh tế bào Vì virus hấp thụ thực trình nhân lên tế bào phá hủy Một tỷ lệ lớn tế bào đại thực bào phế nang phổi bị virus xâm nhiễm sớm (Nguyễn Bá Hiên cs, 2007) Khi phế nang bị phá hủy, khả trao đổi khí phổi bị giảm sút dẫn đến tượng khó thở, tần số hơ hấp tăng để tăng lượng oxy trao đổi Phổi bị viêm nhục hóa, đặc lại, diện tích trao đổi khí bị thu hẹp khiến lợn khó thở, tình trạng kéo dài lợn bị mệt mỏi, giảm ăn, tăng trọng giảm Những ngày sau tượng khó thở nặng hơn, lợn làm cách để thở được, có thở thể bụng, ngồi để thở mà ta hay gọi tượng “chó ngồi” (Hồ Văn Nam cs, 1996) * Rối loạn tiêu hóa Rối loạn tiêu hóa biểu rõ lợn thí nghiệm, biểu rối loạn tiêu hóa giảm ăn, bỏ ăn Qua theo dõi thấy lợn thí nghiệm có biểu giảm ăn, mức độ nặng lợn TN1 TN2, mức độ trung bình lợn TN3 Sau ngày gây bệnh thực nghiệm lợn bắt đầu có tượng sốt, phân táo, tượng táo bón xảy lợn thí nghiệm, cụ thể lợn TN1 TN3 có tượng táo bón với mức độ trung bình, cịn lợn TN2 mức độ nặng Lợn TN1 gần chết chúng tơi cịn quan sát thấy tượng ỉa chảy, phân nhớt loãng Theo chúng tơi kết giải thích sau: táo bón biểu lợn bị sốt cao nước, lợn sốt cao làm rối loạn điều hoà thân nhiệt dẫn đến rối loạn tiêu hoá, lợn bị tiêu chảy * Da sung huyết Trong q trình quan sát triệu chứng lợn thí nghiệm, chúng tơi có thấy biểu sung huyết da, dễ quan sát vùng da mỏng: sau tai, vùng bụng, chân, vùng bẹn, mặt đùi… Hiện tượng xanh tai virus công vào đại thực bào đặc biệt virus PRRS có lực mạnh với đại thực bào phế nang phá hủy đại thực bào phế nang Phổi bị Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 50 đặc nguyên nhân gây khó thở, máu hàm lượng CO2 cao khơng giải phóng 3.2.2 Bệnh tích đại thể lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN -10 Sau gây bệnh thực nghiệm 12 ngày, lợn TN1 bị chết, tiến hành mổ khám quan sát bệnh tích sau lợn bị chết Còn lại lợn TN2, lợn TN3 lợn ĐC tiến hành mổ khám, quan sát, ghi chép bệnh tích đại thể sau gây bệnh 21 ngày Quy trình mổ khám tiến hành theo quy trình Bộ môn Bệnh lý, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Địa điểm mổ khám khu nuôi động vật thí nghiệm, khoa Thú y Bệnh tích đại thể quan lợn thí nghiệm trình bày bảng 3.8: Bảng 3.8: Bệnh tích đại thể chủ yếu lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN10 STT Cơ quan Hạch lympho Lợn TN1 TN2 Sưng, xuất huyết Sưng, xuất huyết Phổi Viêm, sưng, bị nhục hóa Xuất huyết, viêm Tim Xoang bao tim tích nước Xoang bao tim tích nước, tim nhão Lách Nhồi huyết Sưng, nhồi huyết Ruột Bị bào mòn Xuất huyết Thận Bề mặt thận xuất huyết điểm Xuất huyết đinh ghim Dạ dày Não Xuất huyết Sung huyết Gan Sưng, tụ huyết Xuất huyết Sung huyết Có số điểm thối hóa, hoại tử 10 Cơ quan khác Bàng quang xuất huyết Hạch amidan sưng, sung huyết TN3 Sưng, xuất huyết Viêm phổi, viêm dính màng phổi ĐC1 ĐC2 - - - - Cơ tim nhão - - - - - - - - - - - - - - Rìa lách nhồi huyết Mỏng, bị bào mịn Khơng có bệnh tích Xuất huyết Sung huyết Sưng, sung huyết Dịch xoang phúc mạc có màu vàng Ghi chú: (+) Dương tính; (-) Âm tính Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51 Trong trình mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể chúng tơi thấy bệnh tích điển hình lợn lợn có biểu tím tai, hạch lympho sưng, sung huyết, xuất huyết, viêm phổi kẽ Khi gây bệnh thực nghiệm cho lợn chúng tơi có bệnh tích chủ yếu là: Hạch lympho sưng, xuất huyết, tất hạch lympho có tượng sung huyết, xuất huyết kết hợp hoại tử (hạch hàm, hạch bẹn nông, hạch amidan, hạch phổi…) Xoang bao tim tích nước màu đục, tim nhão Phổi bị xuất huyết, viêm có điểm hoại tử, đặc (phổi bị nhục hóa) Xoang bụng tích dịch màu vàng, dịch màu vàng giải thích sau: Do gan bị xơ chức phận gan giảm kết hợp với gan bị sưng làm chèn ép tĩnh mạch cửa, tĩnh mạch chủ sau làm cho dịch tràn từ mạch máu ngồi xoang bụng kết hợp với viêm làm xuất huyết tất bao tương mạc ruột làm dịch vơ hình ruột thấm qua lỗ viêm xoang bụng Thận bị xuất huyết hình đinh ghim bề mặt Não bị sung huyết, giải thích sau: tác động sản phẩm trung gian q trình oxi hóa thể vật vật bị sốt, thể rối loạn trung khu điều hịa nhiệt rối loạn q trình trao đổi oxi… tất yếu tố tạo sản phẩm độc tăng áp lực tác dụng trực tiếp lên não gây nên tượng sung huyết não Cịn số bệnh tích khác quan sát chúng tơi có kết giống với nghiên cứu tác giả Bùi Quang Anh cs (2008), Nguyễn Hữu Nam Nguyễn Thị Lan (2007), Lê Văn Năm (2007), công bố 3.2.3 Một số bệnh tích vi thể lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 Với lợn thí nghiệm, sau mổ khám quan sát biến đổi đại thể, tiến hành lấy mẫu quan: phổi, lách, hạch lympho, thận, não, gan ngâm bảo quản formalin 10% sau làm tiêu vi thể Mỗi lợn thí nghiệm chúng tơi lấy Block phổi vị trí khác nhau, cịn quan khác gan, thận, lách, não, hạch phổi hạch màng treo ruột chúng lấy block cho quan Sau làm tiêu theo quy trình tẩm đúc parafin nhuộm H.E lựa chọn Block tiêu đẹp để đọc kết kiến hiển vi quang học Bệnh tích vi thể lợn thí nghiệm trình bày bảng 3.9 3.10 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52 Bảng Kết nghiên cứu bệnh tích vi thể phổi lợn gây bệnh thực nghiệm chủng PRRSV-BN-10 Bệnh tích TN1 TN2 TN3 ĐC1 ĐC2 Thâm nhiễm tế bào viêm Thoái hoá tế bào Hoại tử tế bào Huyết khối nhỏ mạch quản + + + + + + + + + - - + + + + + + + + + - - Tăng sinh tế bào xơ Tăng sinh nang lympho Viêm tăng sinh kẽ phổi + + + + + + + + + - + - Sung huyết Xuất huyết Ghi chú: (-) khơng có bệnh tích, (+) có bệnh tích Bảng 3.10: Bệnh tích vi thể số quan lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 Cơ quan có bệnh tích TN1 TN2 TN3 ĐC1 ĐC2 Phổi + + + - - Hạch phổi + + + - - Gan + + + - - Thận + + + - - Lách + + + - - Tim + + + - - Não + + + - - Ruột + + + - - Hạch lympho màng treo + + + - - Ghi chú: (-) bệnh tích, (+) có bệnh tích Bệnh tích vi thể phổi lợn mắc PRRS thực nghiệm Bệnh tích vi thể đáng ý lợn thí nghiệm biến đổi phổi Phế nang chứa đầy dịch viêm tế bào viêm, nhiều xác đại thực bào bị hoại tử lòng phế nang; dịch rỉ viêm tế bào viêm hồng cầu, bạch cầu (bạch cầu đa nhân trung tính chủ yếu) đại thực bào vào kẽ phổi lòng phế quản, phế nang làm cho vùng phổi chức trao đổi khí Phổi xuất huyết rõ, lịng phế quản, phế nang kẽ phổi chứa đầy hồng cầu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53 màu đỏ tươi gây cản trở hoạt động hơ hấp phổi Bệnh tích xuất 100% số tiêu phổi kiểm tra Theo chúng tơi ngun nhân làm cho lợn bệnh bị khó thở chảy nhiều nước mũi Kết phù hợp với kết nghiên cứu Done SH (1996) Khi quan sát chúng tơi thấy số tiêu phổi có tượng chứa nhiều dịch phù lòng phế nang, phổi bị sung huyết, máu dồn phổi nhiều bình thường, làm cho mạch quản phổi giãn rộng chứa nhiều hồng cầu hơn, tượng thường xuất đan xen với vùng phổi bị viêm Ngồi cịn có tượng khí phế, khí hoạt động mạnh vào phế nang làm lòng phế nang, phế quản tận giãn rộng Theo chúng tơi có tượng phổi có nhiều phế nang phế quản bị tổn thương ảnh hưởng đến hoạt động trao đổi khí, phế nang phế quản lành khác phải tăng cường hoạt động Tuy nhiên, bị khí phế nặng làm cho phổi bị đàn tính khả trao đổi khí Đối chiếu với kết quan sát triệu chứng lâm sàng chúng tơi thấy có tượng khí phế nặng biểu thở khó rõ rệt Ở kẽ phổi cịn có tượng viêm tăng sinh tế bào xơ đồng thời xuất cặn tế bào đại thực bào tế bào lymphocyte Bệnh tích có xu hướng lan toả sang vùng phế quản phế nang Mức độ xơ hóa khơng đồng mà tuỳ thuộc vào tiến triển bệnh Theo Pol cs, bệnh tích đặc trưng phổi lợn mắc PRRS Trong đó, bệnh tích viêm phổi kẽ biến đổi bệnh lý cố định phát phương pháp tổ chức học Các tổ chức phổi xuất vùng phế quản-phế viêm, vùng tổn thương xen kẽ vùng lành Vùng trung tâm phế quản viêm nặng xung quanh phế nang viêm mức độ khác nhau, nặng phế nang tiếp giáp với phế quản, phế nang xa phế quản viêm nhẹ Trong lòng phế quản chứa đầy bạch cầu đa nhân trung tính (BCĐNTT) thối hố khơng thối hố, đại thực bào, tế bào biểu mô long Vách phế quản sung huyết bị phù, thâm nhiễm BCĐNTT có tập trung thành đám lớn che khuất cấu trúc phế quản Ngồi chúng tơi cịn tìm thấy thể vùi ngun sinh chất tế bào bị virus phá huỷ Những biến đổi thấy báo cáo kết Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54 Yufeng Li cs (2009) nghiên cứu virus chủng độc lực cao miền Trung Trung Quốc Theo Bet (1995) mầm bệnh làm tăng sinh mô lympho vùng quanh phế quản quanh mạch quản Sofin (1956) sử dụng tượng ngấm bạch cầu kết hợp với tăng sinh để phân biệt bệnh viêm phổi virus với bệnh viêm phổi khác lợn Hiện tượng hoại tử tế bào làm cho tế bào phổi bị phá huỷ bắt màu hồng đều, cấu trúc tế bào, màng tế bào bị vỡ, nguyên sinh chất bị huỷ hoại, nhân tế bào bị teo hẳn tập trung thành đám Bên cạnh lớp lơng rung phế quản bị phá huỷ Vùng phổi bị xuất huyết làm cho lòng phế nang chứa đầy hồng cầu Huyết khối nhỏ lòng mạch quản , tượng thành phần máu tách đông lại lịng mạch quản Trên kính hiển vi chúng tơi thấy cục huyết khối có hồng cầu tập trung thành đám màu đỏ lòng mạch quản Như qua nghiên cứu, nhận thấy bệnh tích vi thể phổi lợn bệnh có biến đổi lớn, đặc biệt tượng sung huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, lông rung phế quản bị phá huỷ, xuất huyết phổi Bệnh tích vi thể số quan, tổ chức khác lợn mắc PRRS thực nghiệm - Bệnh tích hạch lympho: Quan sát bệnh tích hạch lympho chúng tơi thấy đa số hạch lympho sung huyết, xuất huyết vùng rìa hạch - Hạch phổi phổi, nơi chịu tác động tương đối sớm bị ảnh hưởng lớn, bên cạnh hạch cịn tham gia vào q trình đáp ứng miễn dịch nên thể lợn bệnh có biến đổi bệnh lý hạch phổi Hạch phổi sưng to gấp 2-5 lần hạch bình thường, chứa nhiều virus, tụ máu khơng xuất huyết, sưng thuỷ thũng bệnh tích đặc trưng lợn bị bệnh phổi - Gan: gan có vị trí xung yếu có chức phức tạp nên dễ bị tổn thương Sự tổn thương gan tập trung vào tế bào gan xung huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, thoái hoá tế bào Tế bào gan bị thối hố khơng bào, ngun sinh chất có nhiều khoảng trống trắng, hậu trình rối loạn trao đổi protein Chúng tơi thấy dạng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 55 thối hố phổ biến tế bào gan Ở mức độ nhẹ không bào tạo khoảng sang lỗ trỗ cịn nhân tế bào khơng thấy biểu Ở mức độ nặng không bào lớn chiếm gần hết dung tích tế bào chất, lúc nguyên sinh chất vệt dựa vào màng xung quanh nhân Nhân tế bào bị ảnh hưởng rõ rệt, chất nhân tiêu biến đi, xuất khoảng không bào quanh nhân, quan sát thấy nhân to bình thường có cịn lại vỏ nhân trịn, số trường hợp khác thoái hoá mỡ, vi trường thấy giọt mỡ trịn sáng rõ Loại thối hoá thấy nhiều, cấu trúc gan thay đổi, ranh giới tế bào gan không rõ Nhân tế bào gan khơng cịn dạng vốn có mà thường vỡ tan lẫn vào tế bào chất tạo thành hình ảnh đồng nhất, xem kính thấy bắt màu hồng với thuốc nhuộm Eosin - Thận: khác với gan, biến đổi bệnh lý tế bào thận thâm nhiễm tế bào viêm, thoái hoá Ở kẽ có biến đổi xuất huyết; mạch quản bị tổn thương nên gây tượng xung huyết, vi trường thấy mạch quản giãn rộng, lòng mạch quản chứa đầy hồng cầu, xung quanh có dịch phù vùng bắt màu hồng nhạt Biến đổi vi thể thận rõ ràng lợn mắc bệnh phổi keo dài,tăng sinh tế bào xơ; tăng sinh nang lympho hoại tử tế bào - Ruột: xung huyết , thâm nhiễm tế bào viêm; thoái hoá tế bào, tăng sinh nang lympho Ngồi cịn thấy xuất tăng sinh tế bào xơ; huyết khối nhỏ lòng mạch quản - Lách sung huyết, thoái hoá hoại tử Trên tiêu lách thấy vách đứt nát, tế bào thoái hoá xen kẽ với tế bào lành, thâm nhiễm hồng cầu lan tràn nhu mô lách - Não sung huyết Tóm lại: biến đổi bệnh tích vi thể chủ yếu lợn bị bệnh phổi: thâm nhiễm tế bào viêm, xung huyết, thoái hoá tế bào, xuất huyết hầu khắp quan: hạch phổi, gan, thận, ruột Sự biến đổi vi thể quan tác động mạnh tới hô hấp, q trình tiêu hố, hấp thu, giải độc thể, làm ảnh hưởng toàn thân 3.2.4 Kết xét nghiệm có mặt PRRSV quan Sau gây bệnh thực nghiệm tiến hành theo dõi biểu lâm sàng lợn, đồng thời lấy máu, dịch swab, nhử mắt phân vào ngày thứ 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 21 làm xét nghiệm phương pháp RT-PCR để kiểm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 56 tra có mặt virus PRRS thể lợn Kết trình bày bảng 3.11 hình 3.8: Bảng 3.11: Kết xét nghiệm PRRSV phương pháp RT-PCR sau gây bệnh thực nghiệm Ngày lấy mẫu 11 Lợn Máu Swab Phân Tổng hợp chung TN1 - - - - TN2 - - - - TN3 - - - - ĐC1 - - - - ĐC2 - - - - TN1 + + - + TN2 + - - + TN3 + - - + ĐC1 - - - - ĐC2 - - - - TN1 + + + + TN2 + + + + TN3 + + + + ĐC1 - - - - ĐC2 - - - - TN1 + + + + TN2 + + + + TN3 + + + + ĐC1 - - - - ĐC2 - - - - TN1 + + + + TN2 + + + + TN3 + + + + ĐC1 - - - - ĐC2 - - - - TN1 + + + + TN2 + + + + Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 57 Ngày lấy mẫu 13 15 21 Lợn Máu Swab Phân Tổng hợp chung TN3 + + + + ĐC1 - - - - ĐC2 - - - - TN1 * * * * TN2 + + + + TN3 + + + + ĐC1 - - - - ĐC2 - - - - TN1 * * * * TN2 + + + + TN3 + + + + ĐC1 - - - - ĐC2 - - - - TN1 * * * * TN2 + + + + TN3 + + + + ĐC1 - - - - ĐC2 - - - - Ghi chú: (-) Âm tính, (+) Dương tính , (*): lợn chết, khơng có mẫu Hình 3.8: Kết phản ứng RT- PCR với mồi ORF5 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 58 Nhìn vào bảng 3.11 chúng tơi thấy sau ngày gây bệnh thực nghiệm thứ chưa có xuất virus máu, đến ngày thứ sau gây bệnh thực nghiệm thấy virus xuất máu lợn, riêng lợn TN1 thấy virus dịch swabs, đến ngày thứ sau gây bệnh thực nghiệm thấy virus xuất máu, dịch swabs phân lợn thí nghiệm, riêng lợn đối chứng khơng có xuất virus Lợn thí TN chết ngày thứ 12 nên ngày thứ 13, 15 21 khơng có mẫu Theo Wills, 1997; Swenson, 1994; Wagstroms, 2001; Rossowl, 1994; Yoon, 1993): PRRSV phát từ nhiều loại chất tiết chất thải từ lợn bao gồm máu, tinh dịch, nước bọt, phân, thở, sữa sữa đầu Từ kết nghiên cứu bảng 3.11 hình 3.8 cho thấy: chúng tơi tiến hành gây bệnh thực nghiệm cho lợn thành công chủng virus PRRSV-BN-10 kết xét nghiệm có mặt virus máu, phân, 3.2.5 Hàm lượng kháng thể kháng PRRSV phương pháp ELISA Chúng tiến hành lấy máu lợn vào ngày 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 21 chắt huyết kiểm tra tạo thành kháng thể kháng PRRSV phương pháp ELISA để đánh giá đánh mức độ gây bệnh virus, kết trình bày bảng 3.12 hình 3.9 Bảng 3.12: Hàm lượng kháng thể kháng PRRSV phương pháp ELISA sau gây bệnh thực nghiệm cho lợn Ngày lấy máu Lợn TN1 TN2 TN3 ĐC1 ĐC2 TN1 TN2 TN3 ĐC1 ĐC2 TN1 SP 0,21 0,30 0,28 0,18 0,19 0,34 0,47 0,54 0,18 0,20 0,46 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Kết ± + + + Page 59 Ngày lấy máu 11 13 15 21 Lợn TN2 TN3 ĐC1 ĐC2 TN1 TN2 TN3 ĐC1 ĐC2 TN1 TN2 TN3 ĐC1 ĐC2 TN1 TN2 TN3 ĐC1 ĐC2 TN1 TN2 TN3 ĐC1 ĐC2 TN1 TN2 TN3 ĐC1 ĐC2 TN1 TN2 TN3 ĐC1 ĐC2 SP 0,62 0,79 0,21 0,23 0,78 0,97 0,95 0,22 0,25 0,86 1,08 1,19 0,27 0,27 0,65 0,89 0,95 0,20 0,19 * 0,49 0,58 0,21 0,24 * 0,56 0,62 0,23 0,27 * 0,67 0,85 0,23 0,22 Kết + + + + + + + + + + + * + + * + + * + + - Ghi chú: (*) lợn chết, khơng có số liệu Nếu SP ≥ 0,4 dương tính Nếu 0,3 ≤ SP ≤ 0,4 nghi ngờ Nếu SP ≤ 0,3 âm tính Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn hàm lượng kháng thể kháng PRRSV sau gây bệnh thực nghiệm cho lợn Nhìn vào đồ thị ta thấy hàm lượng kháng thể máu sau gây bệnh thực nghiệm có biến động chứng tỏ chúng tơi gây bệnh thực nghiệm thành công cho lợn Từ ngày thứ thấy xuất virus thể lợn, kháng thể tạo để kháng lại chủng virus PRRSV-BN-10 Hàm lượng kháng thể đạt cao vào ngày thứ sau gây bệnh thực nghiệm lợn, lợn TN1 số SP đạt mức 0,86, lợn TN2 số SP 1,08 lợn TN3 số SP vào ngày thứ lên đến 1,19 sau giảm mạnh, điều cho thấy độc lực virus ngày tăng, trung hòa kháng thể máu làm hàm lượng kháng thể máu lợn giảm xuống, lợn TN1 giảm xuống thấp nhất, ngày thứ 11 số SP giảm xuống 0,65 đến ngày 12 lợn chết Lợn TN2, TN3 số SP giảm không giảm mạnh lợn TN1 lợn qua khỏi thời gian hình thành miễn dịch với PRRSV, hàm lượng kháng thể tăng trở lại 3.2.6 Sự phân bố virus chủng PRRSV- BN-10 quan lợn sau gây bệnh thực nghiệm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 61 Phương pháp nhuộm hoá miễn dịch tổ chức (Immunohistochemistry – IHC) thực nguyên tắc kết hợp kháng nguyên kháng thể, phương pháp cho phép xác định có mặt virus tổ chức bệnh lý việc tạo phức màu nâu đỏ lát cắt tổ chức nhuộm hoá miễn dịch Để hiểu phân bố virus quan tổ chức lợn sau gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10, đồng thời làm sở cho việc chọn mẫu bệnh phẩm tiến hành phân lập virus, chúng tơi tiến hành nhuộm hố miễn dịch tổ chức với mẫu phổi, hạch phổi, lách, thận, ruột lợn thí nghiệm Kết trình bày bảng 3.13 Bảng 3.13 Sự phân bố virus quan lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10 TT Cơ quan Lợn TN Lợn TN Lợn TN ĐC1 ĐC2 Phổi +++ +++ ++ - - Hạch phổi +++ +++ ++ - - Lách ++ ++ + - - Gan ++ + + - - Thận + ++ + - - Ruột ++ ++ + - - Não + + + - - Tim + + - - - Ghi chú: + Đám, hạt bắt màu nâu vàng ++ Đám, hạt bắt màu nâu vàng trung bình +++ Đám, hạt bắt màu nâu vàng nhiều - Khơng có đám, hạt bắt màu nâu vàng Sau làm hóa miễn dịch quan chúng tơi nhận thấy mức độ dương tính tiêu phổi hạch phổi hẳn so với tiêu quan khác Theo chúng tơi, điều giải thích phổi quan tiếp xúc với mầm bệnh sớm nhất, số lượng nhiều đồng thời virus có lực cao với đại thực bào đặc biệt đại thực bào phế nang mà virus cư trú nhiều hạch phổi Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 62 Quan sát tiêu hóa miễn dịch qua kính hiển vi nhận thấy: Ở phổi, kháng nguyên virus tập trung nhiều đại thực bào vùng phổi, tế bào biểu mô vách phế nang, phế quản Điều lý giải biến đổi bệnh lý vi thể đặc trưng vùng phổi: viêm kẽ phổi lan toả với dày lên tăng sinh biểu mô vách phế nang Tại hạch lympho: virus phân bố lan tràn toàn tổ chức hạch lympho Virus nằm tế bào bạch cầu, lympho cầu, tế bào lymphocyte Virus công làm cho nang lympho bị teo giảm bớt Tại ruột: virus tập trung chủ yếu tế bào biểu mô ruột, tuyến ruột có nhiều virus, chỗ lơng rung bị đứt nát virus tập trung nhiều Ngồi ra, virus cịn tập trung lớp vịng, dọc Virus cơng làm hoại tử tế bào biểu mô ruột tăng sinh nang lympho, lông nhung bị đứt nát Tại lách: virus phân bố rải rác, nằm lympho bào Tại gan: virus cư trú nhân lên tế bào Kupfer Tại thận, virus nằm cầu thận Do virus công làm cho cầu thận bị viêm, nang Baoman giãn rộng Ở tim, tim bị thoái hoá, nhão bình thường, viêm ngoại tâm mạc Virus nằm tế bào tim Kháng nguyên (PRRSV-BN-10) tổ chức não lợn phân bố nhiều nơi, không tập trung chỗ Khi nhuộm hoá miễn dịch thấy não tổ chức thường cho kết dương tính nhẹ Như vậy, virus công vào tế bào thực bào quan, gây suy giảm miễn dịch mở đường cho virus vi khuẩn khác công làm cho triệu chứng, bệnh tích lợn thêm trầm trọng Chúng tơi đánh giá mức độ dương tính tiêu hóa miễn dịch chủ yếu dựa cảm quan mắt Nó biểu số lượng hạt, đám bắt màu nâu vàng Màu nâu vàng nhiều, rõ mức độ dương tính cao Nơi hóa miễn dịch dương tính rõ nơi tập trung nhiều virus Phổi hạch lympho phổi hai quan có tiêu bắt màu hóa miễn dịch nhiều lượng virus tồn quan cao Điều Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 63 giải thích PRRSV thích ứng với đại thực bào phế nang nên sau xâm nhập vào thể đến công vào đại thực bào sau cơng đến đại thực bào quan khác Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu, rút số kết luận sau: Chủng virus PRRV –BN-10 gây Hội chứng rối loạn hơ hấp sinh sản có độc lực cao, gây bệnh cho lợn với triệu chứng lâm sàng chủ yếu sốt cao, lông xù, thở khó, sưng mí mắt, viêm kết mạc mắt… Bệnh tích đại thể chủ yếu lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRV –BN-10 tập trung chủ yếu phổi, phổi viêm dính sườn, xuất điểm viêm, xuất huyết, hạch lympho sưng, thận bị xuất huyết đinh ghim bề mặt Bệnh tích vi thể chủ yếu lợn quan sát thấy bị viêm kẽ phổinão sung huyết, thận bị thâm nhiễm nhiều tế bào viêm, cầu thận xuất huyết Hàm lượng kháng thể kháng virus chủng PRRSV-BN-10 xuất huyết lợn gây bệnh thực nghiệm từ ngày thứ đạt hàm lượng cao vào ngày thứ Sau gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRV –BN-10 gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản virus phân bố nhiều phổi hạch lympho lợn mắc PRRS Đề nghị Để đề tài nghiên cứu hoàn thiện nữa, mong muốn: Tiến hành đề tài tất nhóm lợn khác mở rộng phạm vi nghiên cứu nhiều địa phương Tiếp tục phân lập virus môi trường tế bào khác để tìm mơi trường tế bào phân lập virus thích hợp xác định đặc tính sinh học virus Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Quang Anh, Nguyễn Văn Long (2007), “Một số đặc điểm dịch tễ Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (lợn tai xanh) tình hình Việt Nam”, Diễn đàn khuyến nơng công nghệ, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn Bùi Quang Anh, Hoàng Văn Năm, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long, Nguyễn Ngọc Tiến (2008), “Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRS)”, NXB Nông nghiệp, tr 7-21 Nguyễn Trọng Cường (2009), “Phân lập giám định virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn, nghiên cứu số đặc điểm bệnh lý lợn mắc bệnh”, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp – ĐHNNI – 2009 Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thị Bích Liên, Trần Thị Dân, Nguyễn Ngọc Tân (2007), “Chẩn đoán virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp đàn heo (PRRS) kỹ thuật RRT-PCR”, Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XIV, Số 2/2007, tr – 12 Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007), “Một số hiểu biết virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn”, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, Đại học Nông nghiệp Hà Nội, tr 01 – 10 Lê Văn Lãnh cs (2007), “Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp – (Porcine Reproductive and Respiratory Syndome)”, Hội thảo Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp bệnh liên cầu gây lợn (10/2007), trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Phạm Sỹ Lăng, Phan Đăng Kỳ (2007), “Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn”, Diễn đàn khuyến nông công nghệ, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn, tháng – 2007 Trần Thị Bích Liên (2008), “Bệnh tai xanh heo”, NXB Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh 2008, tr 16 – 17, tr 54 – 56, tr 62 – 63 Hồ Văn Nam, Nguyễn Thị Đào Ngun, Phạm Ngọc Thạch (1996), Giáo trình chẩn đốn lâm sàng thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 10 Hồ Văn Nam, Nguyễn Thị Đào Nguyên, Phạm Ngọc Thạch (1996), Giáo trình bệnh nội khoa gia súc, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 11 Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Lan (2007), “Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản”, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội 12 Lê Văn Năm (2007), “Kết khảo sát bước đầu biểu lâm sàng bệnh tích đại thể bệnh PRRS số địa phương thuộc đồng Bắc Bộ Việt Nam”, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, Đại học Nông nghiệp Hà Nội 13 Đàm Văn Phải (2008), “Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn – PRRS”, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp – ĐHNNI – 2008 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66 14 Nguyễn Văn Thanh (2007), “Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS)”, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội 15 Tô Long Thành cs (2008), "Kết chẩn đoán nghiên cứu gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Việt Nam từ tháng 3/2007 đến 5/2008”, Tạp chí KHKT Thú y, 15 (5), tr - 13 16 Phạm Ngọc Thạch, Đàm Văn Phải (2007), “Một số tiêu lâm sàng, tiêu máu lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (bệnh tai xanh) số đàn lợn tỉnh Hải Dương Hưng Yên”, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội 17 William T.Christianson Han Soo Joo (2001), Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS), Tạp chí KHKT Thú y, (tập VIII) số 2- 2001, tr 74 - 86 18 Chu Đức Thắng, Hồ Văn Nam, Phạm Ngọc Thạch (2008), Chẩn đốn bệnh thú y, NXB Nơng nghiệp, tr 124 – 159 19 Đỗ Đức Việt, Hoàng Minh Sơn, Trần Thị Đức Tám (2005), Tổ chức – Phôi thai học, Giáo trình giảng dạy, Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 20 A A.Bưtner, B.Strandbygaard, K.J sứrencen, M.B Oleksiewicz and T Storgaard, (2000), "Distinction between ìnfections with European and American/vaccin type PRRS virus after vaccination with a modified - live PRRS virus vaccin” Vet.Ré (31) 1, pp.72 - 72 21 Anette botner (1997), "Diagnosis of PRRS”, Veterinary Microbiology, 55, pp.295 301 22 Benfield DA, Nelson, E et al (1992), “Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (isolate ATCC VR2332)”, JouARNl of Veterinary Diagnostic Investigation 4, pp.127 – 133 23 Christianson WT, Collins JE, Benfield DA, Harris L, Gorcyca DE, Chladek DW, …(1992), “Experimental reproduction of swine infertility and respiratory syndrome in pregnant sows”, Am, J, Vet Res 53, pp 485 – 488 24 Collin JE, Benfield DA, Christianson ƯT, Harris L, Hennings JC, Shaw DP, Goyal SM, McCullough S, Morrison RB, Joo HS, Gorcyca D, Chladek D “Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR - 2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs”, J Vet Diagn Invest 4, pp117- 126, 1992 25 D.L.Delputte (2004), "Effect of virus specific antibodies on attachment internalization and infection of porcine reproductive and respiratory”, Veterinary Immunology and Immunopathology, 142, pp.179 - 188 26 Done SH, Paton DJ, White ME (1996), “ Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS”: a revew, with emphasis on pathological, virological and diagnostic aspects Br Vet J 152, pp.153 - 174 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67 27 E.Weiland (1999), "Monoclonal antibodies to the GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus are more effective in virus neutralization than monoclonal antibodies to the GP4”, Veterinary Microbiology, 10, pp.171 - 186 28 Gonnie Nodelijk (1996), "Comparison of commercila ELISA and immunoperoxidase monolayer assay to detect antibodies directed against PRRS”, Veterinary Microbiology, 49, pp.285 - 295 29 Jian Chen (2006), Genetic Variation of Chinese PRRSV Strains Based Biochemical Genetics”, Veterinary Microbiology, 142, pp.425 - 435 30 Keffaber KK (1989), “Reproductive failure etiology.Am.Assos.Swine.Pract”, Newstlett, 1, pp.1 – 10 of unknown 31 Meng XJ, Paul PS, Halbur PG, Lum Ma (1995), “Phylogenetic analyses of the putative M (ORF 6) and N (ORF 7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication for the existense of two genotypes of PRRSV in the U.S.A and Europe”, Arch Virol 140, pp.745 -755 32 Murakami Y, Kato A, et al (1994), “Isolation and serological characterization of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) virus from pigs with reproductive and respiratory disoders in Jappan”, J Vet Med Sci56, pp.891 – 894 33 Murtaugh MP, Elam MR, et al (1995), “Comparion of the structure protein coding saquences of the VR - 2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus”, Archives of Virology, pp.1451- 1460 34 Nelsen CJ, GenBank, et al, (1998), “ Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Resp PRRS MLV”, complete genome, May 15 35 Neumann EJ, et al (2005), “Assessmment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome swine production in the United States”, J.Am.Vet.Med.Assoss, 227,pp.385 – 392 36 Nodejil G, Nielen M, et al (2003), “A revew of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus in Dutch breeding herd; population dynamics and clinical relevance” 37 Paton DJ, Brown IH, et al (1991), “Blue ear” disease of pigs, Vet Ree , 128, pp.617 38 Rossow KD (1998), “Porcine reproductive and respiratory syndrome”, J Vet Pathol,35, pp.1-20 39 Shimuzi M, Yamada S, et al (1994), “Isolation of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome ( PRRS) virus from Heko- Hekeo disease of pigs J Vet Med Sci 56, pp.389 – 391 40 Suazez P (2000), “Utrastructure pathogenesis of PRRS virus”, Vet Res 31, pp.47 – 55 41 Terpstra C, Wensvoort G, Pol JMA, (1991) “Experimental reproduction of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (Mystery swine disease) by infection with Lelystad virus: Koch’s postulates fulfilled”, The Veterinary Quarterly, vol.13, no.3, pp 131 - 136, Jul 42 Tian K, Yu, Zhao, et al(2007), “Emergence of fatal PRRS variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68 hallmark”, PloS One (6), e 526.doi: 10.137l/ jouARNl.Pone.0000526 43 Wensvoort G, Terpstra C, Pol JMA, et al (1991), “Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus”, The Veterinary Quarterly, vol.13, No.3, pp.121 - 130, Jul 44 Yufeng Li, Xinglong Wang, et al (2007), “Emergence of a highly pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus in the Mid - Eastern region of China” 45 Zimmerman JJ., Yoon, KJ., Willis RW., Swenson SL (1997), “General overview of PRRSV: A perspective from the United States”, Veterinary Microbiology 55: 187196 Tài liệu từ Internet 46 http://www.cucthuy.gov.vn/ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 69 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA TRONG ĐỀ TÀI TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG CỦA LỢN ĐƯỢC GÂY BỆNH THỰC NGHIỆM BẰNG CHỦNG VIRUS PRRSV-BN-10 Ảnh Gây nhiễm qua đường mũi Ảnh 2: lợn thí nghiệm bị tím tai Ảnh 3.Lợn khó thở Ảnh 4.Lợn thí nghiệm bị gầy yếu Ảnh Lợn thí nghiệm ngủ li bì Ảnh Lợn thí nghiệm bị chết Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 70 BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ CỦA LỢN ĐƯỢC GÂY BỆNH THỰC NGHIỆM BẰNG CHỦNG VIRUS PRRSV-BN-10 Ảnh Phổi viêm, sưng to, rìa tù Ảnh Phổi viêm màu đỏ sẫm, phù kẽ phổi Ảnh Hạch lympho sưng to Ảnh Xoang bao tim tích nước vàng Ảnh 5.Thận xuất huyết điểm Ảnh Ruột già phủ tơ huyết Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 71 BỆNH TÍCH VI THỂ MỘT SỐ CƠ QUAN CỦA LỢN ĐƯỢC GÂY BỆNH THỰC NGHIỆM BẰNG CHỦNG VIRUS PRRSV-BN-10 Ảnh Phổi sung huyết nghiêm trọng, Ảnh Phù phổi, dịch phù phế nang (HE 10x) (HE.40x) Ảnh Huyết khối lòng mạch quản Ảnh Viêm kẽ phổi, tế bào viêm tăng phổi (HE.20x) sinh làm dày kẽ phổi (HE.10x) Ảnh 5.Viêm kẽ phổi, tế bào viêm tăng sinh Ảnh Đại thực bào hoại tử lòng làm dày kẽ phổi (HE.20x phế nang (HE 40x) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 Ảnh Hạch lympho viêm, xuất huyết Ảnh Gan sung huyết, hồng cầu tràn (HE10x) ngập tĩnh mạch tiểu thùy vi quản xuyên tâm(HE.10x) Ảnh Thâm nhiễm tế bào viêm kẽ thận Ảnh 10 Lách sung huyết (HE10x) (HE.20x) Ảnh 11 Ruột viêm, lông nhung ruột đứt Ảnh 12 Sung huyết mạch quản não nát (HE10x) (HE10x) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 73 KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MIỄN DỊCH MỘT SỐ CƠ QUAN CỦA LỢN ĐƯỢC GÂY BỆNH THỰC NGHIỆM BẰNG CHỦNG VIRUS PRRSV-BN-10 Ảnh Virus tập trung phổi (IHC10x) Ảnh Virus tập trung phổi (IHC40x) Ảnh3 Virus tập trung gan (IHC10x) Ảnh Virus tập trung gan (IHC40x) Ảnh Virus phân bố thận (IHC10x) Ảnh Virus phân bố thận (IHC40x) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 74