Nhóm 7 chẩn Đoán bệnh tv thứ 5 ca 3

Độ nhạy phát hiện ToBRFV trong các mẫu thực địa sử dụng khuếch đại RT-RPA kết hợp với CRISPR-Cas12a một bước...17 3.1.5... Các spacers này được sử dụng làm mẫu để sản xuất RNA dẫn đường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SHPT

CHẨN ĐOÁN NÂNG CAO NHIỄM TRÙNG DO VIRUS GÂY BỆNH NÂU GÂN Ở QUẢ CÀ CHUA (ToBRFV) THÔNG QUA CÔNG NGHỆ CRISPR – CAS12 VÀ CRISPR – CAS9

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SHPT

CHẨN ĐOÁN NÂNG CAO NHIỄM TRÙNG DO VIRUS GÂY BỆNH NÂU GÂN Ở QUẢ CÀ CHUA (ToBRFV) THÔNG QUA CÔNG NGHỆ CRISPR – CAS12 VÀ CRISPR – CAS9

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc Huỳnh Tấn An 21126265

Phan Trung Hậu 21126057Dương Phạm Phương Nguyên 21126428Nguyễn Ngọc Nhi 21126442

TP Thủ Đức, 12/2024

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH v

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Tổng quan về virus nâu gân 1

1.2 Tổng quan về phương pháp CRISPR – Cas 1

1.2.1 Cas9 2

1.2.2 Cas12a 3

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

2.1 Chuẩn bị mẫu 4

2.1.1 Tiêm nhiễm cho cây 4

2.1.2 Thu mẫu 4

2.2 Chuẩn bị crRNA và mồi 5

2.2.1 Chuẩn bị mồi 5

2.2.2 Chuẩn bị crDNA 7

2.3 Khuếch đại đoạn gen virus bằng RT-RPA 7

2.4 Phản ứng và quy trình chẩn đoán của CRISPR – Cas12a 7

2.4.1 Chuẩn bị 7

2.4.2 Quy trình 8

2.5 Phản ứng và quy trình chẩn đoán của CRISPR-Cas9 9

2.5.1 Chuẩn bị 9

2.5.2 Quy trình 11

2.5.2.1 Beacon phân tử 11

2.5.2.2 Thử nghiệm dòng chảy ngang 12

2.5.2.3 Thử nghiệm huỳnh quang 12

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 13

3.1 Kết quả 13

3.1.1 Chuẩn bị mẫu 13

3.1.2 Phát hiện ToBRFV bằng CRISPR – Cas12a 14

3.1.3 Phát hiện ToBRFV trong các mẫu thực địa bằng cách sử dụng khuếch đại RT – RPA kết hợp với CRISPR – Cas12a một bước 16

3.1.4 Độ nhạy phát hiện ToBRFV trong các mẫu thực địa sử dụng khuếch đại RT-RPA kết hợp với CRISPR-Cas12a một bước 17

3.1.5 Cas9 cho phép phát hiện trình tự ToBRFV cụ thể 18

3.2 Thảo luận 20

TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

cDNA : DNA bổ sung sợi đơn

crRNA : DNA lưu hành

ctv : Cộng tác viên

kb : kilobase

PCR : Phản ứng chuỗi polymerase

RT – RPA : Phiên mã ngược – Khuếch đại RPA

ssRNA : RNA sợi đơn

ToBRFV : Virus gây khảm nâu quả cà chua

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang Bảng 2.1 Trình tự cDNA của crRNA và mồi 6

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang Hình 2.1 Trình tự mồi 5 Hình 2.2 Quá trình cắt Cas12a và khuếch đại RT – RPA 9 Hình 2.3 Phản ứng CRISPR – Cas9 10

Hình 3.1 Cây S lycopersicum (cà chua) vào ngày thứ 10 sau khi nhiễm virus (10 dpi)

với RNA virus thực vật ToBRFV (a) Các cây được xử lý giả lập (mock-inoculated)

không biểu hiện bất kỳ triệu chứng bệnh nào; b) Hiện tượng hoại tử gây ra bởi

ToBRFV). … 13

Hình 3.2 Mồi RT – RPA được thiết kế đặc hiệu cho virus ToBRFV 14 Hình 3.3 Kết quả điện di các mẫu RNA tổng số thu từ cây bị nhiễm virus 14 Hình 3.4 Phát hiện ToBRFV bằng dải biotin (A) Mẫu RNA tinh sạch; B) Mẫu RNA thô).

15

Hình 3.5 Sử dụng phương pháp CRISPR – Cas12a, xác định virus thực vật ở các tải lượng

virus khác nhau 18

Hình 3.6 Phát hiện CRISPR-Cas9 R-loop để mở beacon phân tử (COLUMBO) với

CRISPR-Cas9 (sử dụng (A) Beacon 1 và (B) Beacon 2, với các dải biotin) 19

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Tổng quan về virus nâu gân

Tomato Brown Rugose Fruit Virus (ToBRFV) là một loại virus RNA thuộc chiTobamovirus ToBRFV có bộ gen RNA đơn sợi dương dài khoảng 6.4kb (Zhang và ctv,2022) Virus này có hình dạng que với lớp protein capsid bảo vệ bộ gen RNA (Buckley vàctv, 1993) Điều này giúp virus có thể chống lại các tác động từ môi trường như nhiệt độcao, tia UV hay hóa chất khử trùng thông thường, làm tăng khả năng tồn tại của chúng trongđiều kiện khắc nghiệt (Martín-González và ctv, 2023)

ToBRFV lần đầu tiên được phát hiện ở Jordan vào năm 2015 và đã lan rộng ra ít nhất

35 quốc gia (Zhang và ctv, 2022) nhờ khả năng lây lan mạnh mẽ qua hạt giống bị nhiễmhoặc tiếp xúc trực tiếp, gây thiệt hại nghiêm trọng đến sản lượng và chất lượng của cà chua(Salem và ctv, 2021) Virus này có khả năng vượt qua các gen kháng Tm – 22 ở cà chua làmtăng khả năng cây bị nhiễm bệnh (Hak và ctv, 2021)

Triệu chứng bệnh do ToBRFV gây ra rất đặc trưng như quả biến dạng, xuất hiện củacác đốm nâu trên vỏ (Alfaro-Fernández và ctv, 2020) Ngoài ra, ToBRFV còn làm câychậm phát triển, giảm tỷ ra quả, gây tổn thất lớn về năng suất (Guo và ctv, 2023) Việcnghiên cứu và phát triển các biện pháp chẩn đoán, kiểm soát hiệu quả là cần thiết để giảmthiểu tác động của virus này (Van Damme và ctv, 2023)

1.2 Tổng quan về phương pháp CRISPR – Cas

CRISPR – Cas là một công cụ chỉnh sửa gen mạnh mẽ, được phát triển từ hệ miễndịch thích nghi của vi khuẩn để phát hiện và phá hủy DNA của phế bào (Donohue và ctv,2017) Công nghệ này đã cách mạng hóa các phương pháp truyền thống trong công nghệsinh học vi sinh, nông nghiệp, và y học CRISPR – Cas cho phép chỉnh sửa gen với độ chínhxác cao, mở ra nhiều ứng dụng trong nghiên cứu cơ bản và ứng dụng thực tiễn (Sander vàJoung, 2014)

Nguyên lý hoạt động của phương pháp CRISPR – Cas dựa trên cơ chế miễn dịchthích nghi của vi khuẩn nhằm bảo vệ chúng khỏi sự tấn công của phế bào (bacteriophage)

Khi một phế bào tiêm DNA vào vi khuẩn, hệ thống CRISPR ghi nhớ DNA ngoại lai bằngcách chèn các đoạn DNA này vào vùng CRISPR trong bộ gen của vi khuẩn, tạo thành các

"spacers" Các spacers này được sử dụng làm mẫu để sản xuất RNA dẫn đường (gRNA) khiphế bào hoặc DNA ngoại lai tương tự xuất hiện trở lại (Zakrzewska và Burmistrz, 2023).RNA dẫn đường sau đó kết hợp với protein Cas9, hình thành một phức hợp có khả năngnhận diện và tác động lên DNA mục tiêu gRNA định vị chuỗi DNA cần xử lý thông qua sự

bổ sung base (complementary base pairing) và hướng dẫn Cas9 cắt đứt DNA tại vị trí đượcxác định Việc cắt DNA này ngăn phế bào sao chép và gây hại, bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi

sự xâm lấn (Lu và ctv, 2021) Quy trình này đã được cải tiến và áp dụng vào kỹ thuật chỉnhsửa gen, cho phép các nhà khoa học can thiệp chính xác vào bộ gen của nhiều loài sinh vật

để thực hiện các ứng dụng trong nghiên cứu, y học, nông nghiệp và chẩn đoán bệnh (Wang

và ctv, 2020)

1.2.1 Cas9

Hệ Thống CRISPR – Cas9 là một công nghệ endonuclease được dẫn đường bởiRNA có tác dụng thiết kế và chỉnh sửa gene ở tế bào động vật Những trình tự CRISPR baogồm các đoạn lặp lại không liên tục, mang tính bảo tồn cao, và được phân chia bởi nhữngtrình tự gọi là các spacer Những trình tự spacer này tương đương với trình tự plasmid vàvirus bị bắt giữ bởi vi khuẩn và cổ khuẩn Các spacer thường được tìm thấy gắn liền với

những gene protein có mức độ bảo tồn cao, gọi là cas gene (Garneau và ctv, 2010; Horvath

và Barrangou, 2010)

Hệ thống CRISPR – Cas của vi khuẩn là một phương pháp được nghiên cứu nhiềunhất với protein Cas9 là một thành phần tối quan trọng Các đoạn CRISPR được phiên mãthành tiền thân của CRISPR RNA (tiền-crRNA) chứa đầy đủ những đoạn CRISPR lặp lại

và đính kèm với trình tự của tác nhân xâm nhập đã bị chuyển hóa (Deltcheva và ctv, 2011)

CRISPR – Cas9 thường chứa hai thành phần: RNA sợi đơn có chức năng dẫn đường(gRNA) và một endonuclease Hoạt động của RNA dẫn đường Cas9 tạo ra sự cắt đứt sợi đôiđặc hiệu tại bộ gene mục tiêu, theo sau đó là sự chỉnh sửa bởi sự gắn kết đầu không đồngdạng hoặc sự chỉnh sửa đồng dạng trực tiếp (HDR) (Cho và ctv, 2013; Cong và ctv, 2013)

CRISPR – Cas9 là một kỹ thuật linh hoạt, hiệu quả cao, dễ dùng và có thể chỉnh sửabất kỳ gene mục tiêu cần quan tâm (Jinek và ctv, 2012) Thêm vào đó, chức năng của hệthống CRISPR – Cas9 cho phép nhắm đến nhiều gene cùng lúc bằng cách sử dụng nhiềugRNA (Cong và ctv, 2013; Mali và ctv, 2013b)

1.2.2 Cas12a

Cas12a (tên cũ là Cpf1) là một hệ thống CRISPR – Cas thuộc loại V lớp 2, được địnhdanh vào năm 2015 bởi Zetsche và ctv Cas12a, sở hữu hai vùng nuclease RuvC có khảnăng xếp chồng lên nhau với vai trò như vùng hoạt hóa (Swarts và Jinek, 2018) Chỉ có cácđột biến ở vùng cấu trúc của Cas12a RuvC có thể sản sinh Cas12a xúc tác và ở trạng thái bấthoạt (Cas12a chết)

Không giống như hệ thống CRISPR – Cas9, sự hình thành và thuần thục crRNA của

hệ thống Cas12a không cần tracrRNA, và Cas12a nhận biết trình tự PAM nhiều T thay chotrình tự PAM nhiều G (Zetsche và ctv, 2015) Khi nhắc về chức năng sinh hóa học, một sốnhà nghiên cứu kết luận rằng cơ chế phân cắt của Cas12a chỉ phụ thuộc vào protein củachính nó, và sự thay đổi của thyamine nằm giữa trong trình tự PAM có thể dẫn đến khả năngnhận biết trở nên kém đi đáng kể Đối với việc nhận biết ssDNA mục tiêu, Cas12a thậm chíkhông cần sự dẫn đường của trình tự PAM

Bên cạnh đó, khả năng phân cắt của Cas12a đối với sợi DNA mục tiêu và DNAkhông phải mục tiêu chỉ dựa trên vùng RuvC đơn và sự nhận biết đặc hiệu được xác địnhbởi một spacer dài hơn (Stella và ctv, 2018) Những nghiên cứu gần đây cho thấy Cas12a cóthể phân cắt không đặc hiệu các ssDNA sau khi nhận biết được dsDNA hoặc ssDNA mụctiêu (Li và ctv, 2018; Chen và ctv, 2018)

Hiện nay, gene trực giao Cas12a với hoạt động DNAse hiệu quả chủ yếu bao gồm N

ew Francis (Fn), Lachnospiraceae bacteria (Lb) và Acidaminococus sp (As) Bằng cách

đánh dấu huỳnh quang của các sản phẩm phân cắt ssDNA không đặc hiệu, chúng có thểhoạt động như là một chỉ thị cho việc dò tìm nuclease CRISPR, là một chuỗi các phươngpháp chỉ thị được phát triển gần đây như "HOMLES” (Li và ctv, 2019)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Chuẩn bị mẫu

2.1.1 Tiêm nhiễm cho cây

Một chủng ToBRFV có nguồn gốc từ Iran, được xác định với mã số truy cập

P557566.1, đã được sử dụng để lây nhiễm cơ học trên cây cà chua (Solanum lycopersicum

) ở giai đoạn bốn tuần tuổi

Để chuẩn bị mẫu lây nhiễm, khoảng 100 mg mô thực vật đông lạnh bị nhiễm bệnhđược nghiền nhỏ bằng máy nghiền bi, sau đó hòa tan vào dung dịch đệm phosphate có pH7.4 Dung dịch đệm này được pha chế bằng cách sử dụng 3.1 g NaH2PO4.H2O và 10.9 gNaH2PO4 dạng khan, hòa tan trong nước siêu tinh khiết Một tăm bông thấm dịch chiết củavirus sau đó được sử dụng để phủ một lớp bột carborundum lên bề mặt lá phía trên (mặtadaxial) nhằm hỗ trợ quá trình lây nhiễm Các điều kiện môi trường trong buồng sinhtrưởng được thiết lập nghiêm ngặt với chu kỳ chiếu sáng 12 giờ ngày và 12 giờ đêm, kết hợpnhiệt độ ổn định ở mức 25°C

từ nhà sản xuất Sản phẩm cDNA sau đó được bảo quản ở nhiệt độ – 80°C để phục vụ chocác phân tích tiếp theo Việc kiểm tra sự hiện diện của virus trong cây đã cấy chuyền đượcthực hiện bằng phương pháp RT – PCR kết hợp với phân tích điện di gel để xác nhận

2.2 Chuẩn bị crRNA và mồi

2.2.1 Chuẩn bị mồi

Phương pháp phát hiện sử dụng hệ thống CRISPR – Cas12a được triển khai thôngqua việc thiết kế các mồi RT – RPA (được liệt kê trong bảng 2.1.) tại vùng gen mã hóaprotein vỏ (coat protein) của virus ToBRFV Một trình tự PAM (TTTV) phù hợp đã đượcxác định trong vùng khuếch đại để tối ưu hóa hoạt động của Cas12a Đồng thời, các đầu dòDNA sợi đơn (ssDNA) có tính đặc hiệu cao cũng được chế tạo, mang nhãn fluorescein ởđầu 5' và chất dập tắt ánh sáng tối ở đầu 3', nhằm đảm bảo độ nhạy vượt trội cho phản ứng.Các crRNA tương thích với Cas12a được tổng hợp với trình tự có khả năng liên kết bổ sungvới đoạn mục tiêu Trình tự này được định vị từ nucleotide thứ 47 đến 55 trong vùng mụctiêu, như minh họa chi tiết trong hình 2.1

Đối với Cas9, phương pháp tập trung vào việc thiết kế các phân tử ssDNA nhằm tạo

ra các "cổng" lai hóa có độ ổn định ở 37°C Các "cổng" này sử dụng các đoạn "toehold" đặcbiệt làm điểm khởi đầu để tương tác với DNA bị thay thế từ amplicon mục tiêu Quy trìnhchuẩn bị "cổng" bắt đầu bằng việc xử lý ba sợi DNA cấu thành thông qua đun nóng ở 95°Ctrong hai phút, sau đó làm nguội từ từ về 25°C Các trình tự cần thiết cho phản ứng cũng đãđược chi tiết hóa trong bảng 2.1

Hình 2.1 Trình tự mồi.

Bảng 2.1 Trình tự cDNA của crRNA và mồi

to detect

ToBRFV

AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGTTTACAATGGTCCTCTGCACCTATAGTGAGTCGTATTAGCGCToBRFV

Phản ứng sử dụng hệ thống CRISPR được thực hiện trong một dung dịch có thể tích

20 µL Dung dịch bao gồm đệm TAE 1× (pH 8.5, Invitrogen), 0.05% Tween 20 (Merck), và12.5 mM MgCl₂ (Merck) DNA amplicon của ToBRFV sẽ được hòa trộn với 2 µL dịchchiết từ mỗi mẫu lá cây nhiễm bệnh Sau đó, các "cổng" lai hóa được thêm vào dung dịch ở

nồng độ cuối cùng là 200 nM Toàn bộ phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ 37°C trong mộtgiờ bằng máy trộn nhiệt Eppendorf để đảm bảo hiệu quả phát hiện tối ưu.

2.2.2 Chuẩn bị crDNA

Các crRNA được tạo ra thông qua quá trình phiên mã in vitro, sử dụng bộ kitTranscriptAid T7 High Yield Transcription (Thermo) cùng với các mẫu DNA được cungcấp bởi IDT Sau khi tổng hợp, crRNA được tinh sạch bằng cột ly tâm RNA Clean andConcentrator (Zymo) và được đo nồng độ bằng thiết bị quang phổ NanoDrop

2.3 Khuếch đại đoạn gen virus bằng RT-RPA

Bộ kit TwistAmp Basic (TwistDX) được lựa chọn để thực hiện khuếch đại genomevirus mục tiêu thông qua phản ứng RT-RPA, tuân thủ nghiêm ngặt theo hướng dẫn từ nhàsản xuất Quy trình thực nghiệm được tóm lược như sau: Mồi xuôi và mồi ngược (nồng độ

500 nM; trình tự cụ thể được trình bày trong bảng 2.1), 500 U enzyme RevertAid (ThermoFisher Scientific), cùng với 50 U chất ức chế RNase (Thermo Fisher Scientific), được phốitrộn với 29.5 µL dung dịch đệm tái hòa tan để đạt tổng thể tích 43.4 µL, được điều chỉnhbằng nước không chứa RNase Viên nén phản ứng từ bộ TwistAmp Basic được hòa tantrong hỗn hợp này Sau đó, 21.7 µL dung dịch vừa pha chuẩn bị được bổ sung thêm 2 µLRNA tổng số thu được từ cây (hoặc 4 µL dịch chiết thô không qua quá trình tinh sạch RNA)cho mỗi phản ứng

Để khởi phát quá trình phản ứng, 280 mM acetate magiê được thêm vào hệ thốngphản ứng Phản ứng được tiến hành với quá trình ủ ở nhiệt độ 40˚C trong vòng 5 phút, tiếptheo là thao tác lắc trộn (vortex) và ly tâm ngắn để đảm bảo đồng nhất hỗn hợp, rồi tái ủtrong điều kiện tương tự thêm 25 phút Cách tiếp cận này đảm bảo sự tối ưu hóa và hiệu quảcủa quá trình khuếch đại genome mong muốn

2.4 Phản ứng và quy trình chẩn đoán của CRISPR – Cas12a.

2.4.1 Chuẩn bị

Phản ứng hệ thống CRISPR – Cas12a được thiết lập với 50 nM enzyme Cas12a có

nguồn gốc từ vi khuẩn L bacterium (NEB) và 62,5 nM crRNA, được ủ trong 30 phút ở

nhiệt độ phòng với dung dịch đệm NEBuffer 2.1 gồm 10 mM tris – HCl, 50 mM NaCl, 10

mM MgCl2 và 100 µg/mL BSA (pH 7.9; NEB) Sau đó, trong đĩa MicroAmp Fast 96 giếng

(Applied Biosystems), 2 µL mẫu DNA đã được khuếch đại được thêm vào 17 µL hỗn hợpribonucleoprotein CRISPR – Cas12a cùng với 500 nM đầu dò ssDNA gắn nhãn fluorescein– dập tắt (TTATT), tạo thành tổng thể tích 20 µL Phản ứng được giữ ở nhiệt độ 37°C trongvòng 1 giờ, thời gian này tín hiệu huỳnh quang xanh được đo cứ mỗi 5 phút bằng hệ thốngmáy PCR thời gian thực QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific) Bước sóng kích thích

và phát xạ lần lượt được thiết lập ở mức 470/15 nm và 520/15 nm Để khảo sát phát hiện đamục tiêu, mỗi loại crRNA riêng biệt được đưa vào từng giếng phản ứng độc lập, cho phéptiến hành đồng thời các phản ứng CRISPR khác nhau trên cùng một đĩa thí nghiệm

2.4.2 Quy trình

Quy trình phát hiện mục tiêu dựa trên Cas12a kết hợp với khuếch đại đẳng nhiệttrong nền tảng RT – RPA – CRISPR – Cas12a bao gồm hai bước riêng biệt: khuếch đạiDNA và sự nhận diện mục tiêu thông qua cơ chế cắt của Cas12a Tuy nhiên, do đặc điểmchính xác cao của phản ứng khuếch đại RT – RPA, quá trình này dễ tạo ra khí dung, làmtăng nguy cơ nhiễm chéo hoặc dẫn đến các kết quả dương tính giả Thêm vào đó, khi cácthuốc thử RT – RPA và thành phần CRISPR – Cas12a được kết hợp trực tiếp trong một hệthống "one-pot", sự cạnh tranh giữa chúng có thể gây giảm độ nhạy của hệ thống

Cả quá trình cắt Cas12a và khuếch đại RT – RPA đều sử dụng chung cơ chất DNA,điều này góp phần vào vấn đề cạnh tranh Để khắc phục, thành phần Cas12a – crRNA đượcphối hợp với thuốc thử RT – RPA trong cùng một ống phản ứng Trong trường hợp xác địnhToBRFV, phức hợp Cas12a – crRNA được lắc thủ công xuống đáy ống trong suốt quá trìnhkhuếch đại RT – RPA, từ đó tương tác trực tiếp với sản phẩm phản ứng RT – RPA Chiếnlược một giai đoạn RT – RPA – Cas12a này không chỉ loại bỏ được nguy cơ nhiễm khí dung

mà còn giảm thiểu ảnh hưởng từ sự cạnh tranh giữa cơ chất DNA dùng cho cắt Cas12a vàkhuếch đại RT – RPA, đảm bảo độ nhạy cao của quá trình phát hiện mục tiêu (tham khảohình 2.2)

2.5 Phản ứng và quy trình chẩn đoán của CRISPR-Cas9

2.5.1 Chuẩn bị

Phản ứng CRISPR được thực hiện với thể tích cuối cùng 20 µL, trong đó sử dụngđệm TAE 1× pH 8.5 (Invitrogen) kết hợp với 0.05% Tween 20 (Merck) và 12.5 mM MgCl₂(Merck) Phức hợp ribonucleoprotein CRISPR – Cas9 được chuẩn bị ở nồng độ 100 nMbằng cách ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Trong mẫu thử nghiệm, mỗi phản ứng chứa 40

nM DNA sợi kép (dsDNA) đã được khuếch đại, sử dụng mồi có gắn biotin trên một sợi vàmồi ngược ở sợi đối diện

Khi thực hiện phát hiện mục tiêu đơn lẻ hoặc nhiều mục tiêu, mỗi phản ứng sử dụng

2 µL sản phẩm khuếch đại từ các mẫu nhiễm ToBRFV Đối với xác định giới hạn phát hiện,

2 µL sản phẩm RPA tinh sạch được sử dụng Các phản ứng sau đó được ủ trong máy trộnnhiệt Eppendorf ở 37°C trong vòng 25 phút Tiếp theo, thêm 100 nM beacon phân tử và tiếp

Hình 2.2 Quá trình cắt Cas12a và khuếch đại RT – RPA.