Báo cáo th chẩn Đoán bệnh tv bằng shpt nhóm 01 chiều thứ 4

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KĨ THUẬT PCR VÀ ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE PHÁT HIỆN VI KHUẨN Pantoea stewartii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KĨ THUẬT PCR VÀ ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE

PHÁT HIỆN VI KHUẨN Pantoea stewartii GÂY BỆNH ĐEN SƠ

TRÊN QUẢ MÍT (Artocarpus heterophyllus Lam)

Thủ Đức, 12/2024

ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KĨ THUẬT PCR VÀ ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE

PHÁT HIỆN VI KHUẨN Pantoea stewartii GÂY BỆNH ĐEN SƠ

TRÊN QUẢ MÍT (Artocarpus heterophyllus Lam)

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung thực hiện 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1.Tổng quan về vi khuẩn gây bệnh đen xơ mít Pantoea stewartii 3

2.2 Giới thiệu về phương pháp PCR 4

2.3 Giới thiệu về phương pháp điện di trên gel Agarose 4

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 5

3.1 Nội dung 1: Ly trích DNA vi khuẩn bằng lysis buffer và điện di DNA tổng số trên gel agarose 5

3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 5

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 5

3.1.4 Phương pháp tiến hành 5

3.2 Nội dung 2: PCR trình tự vùng 16s RNA và điện di kiểm tra kết quả 6

3.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 6

3.2.2 Mục tiêu thực hiện 6

3.2.3 Vật liệu, hóa chất, trang thiết bị 6

3.2.4 Quy trình tiến hành PCR và điện di phân tích kết quả 6

3.2.4.1 Quy trình PCR 6

3.2.4.2 Quy trình chạy điện di trên gel Agarose 7

3.3 Nội dung 3: Chạy PCR với cặp primer chuyên biệt cho Pantoea stewartii đen sơ mít (Panto R-F) 8

3.3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 8

3.3.2 Mục đích nghiên cứu 8

3.3.3 Vật liệu nghiên cứu 8

3.3.4 Quy trình thực hiện 9

3.3.4.1 PCR mẫu DNA với primer chuyên biệt thiết kế 9

ii

3.3.4.2 Điện di kiểm tra kết quả 10

3.4 Nội dung 4: Chạy PCR với cặp mồi EST6  ESIG2C 11

3.4.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 11

3.4.2 Mục tiêu nghiên cứu 11

3.4.3 Vật liệu nghiên cứu 11

3.4.4 Quy trình thực hiện 11

3.4.4.1 PCR mẫu DNA 11

2.4.4.2 Điện di mẫu DNA 12

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13

4.1 Ly trích DNA vi khuẩn bằng lysis buffer 13

4.2 Điện di DNA tổng số sau ly trích 13

4.3 PCR vùng trình tự 16s RNA của vi khuẩn và điện di kiểm tra kết quả 14

4.4 Điện di kiểm tra kết quả PCR với mồi chuyên biệt cho Pantoea stewartii 14

4.5 Chạy PCR với cặp primer EST6 - ESIG2C 15

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Triệu chứng đen xơ mít trên giống mít Changai thu tại Tiền Giang 1

Hình 3.1 Máy votex 6

Hình 3.2 Máy PCR 6

Hình 3.3 Bồn điện di 6

Hình 3.4 Voter tube chứa DNA 9

Hình 3.5 Thông số trên máy luân nhiệt PCR 10

Hình 3.6 Điện di 10

Hình 4.1 Ly trích DNA vi khuẩn 13

Hình 4.2 Kết quả điện di DNA tổng số 13

Hình 4.3 Kết quả điện di vùng 16s RNA trên gel agarose 14

Hình 4.4 Điện di kiểm tra kết quả PCR với mồi thiết kế 14

Hình 4.5 Kết quả điện di kiểm tra kết quả PCR (Mồi tham khảo) 15

iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR vùng trình tự 16s RNA của vi khuẩn 7

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng khuyếch đại PCR 16s rARN 7

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với 30 chu kì phản ứng 3

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR với primer tham khảo 9

Bảng 3.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp primer EST6 – ESIG2C 12

LỜI CẢM ƠN

Xin trân trọng cảm ơn Thầy PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc, giảng viên phụ trách bộmôn Chẩn đoán bệnh trên Thực vật và quý Anh/Chị trợ giảng đã tận tình chỉ dạy nhómchúng em và toàn thể sinh viên, về quy trình chẩn đoán bệnh cây trồng (Bệnh đen sơ Mít

do tác nhân vi khuẩn gây ra) bằng cách kĩ thuật sinh học phân tử ( PCR và điện di) trêncác cặp mồi đặc hiệu khác nhau từ đó góp phần định hướng kiến thức chuyên ngành vànâng cao kĩ thuật và kĩ năng thao tác phòng thí nghiệm của chúng em! Trân trọng cảmơn!

vi

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây mít (Artocarpus heterophyllus) là loại cây ăn quả nhiệt đới có giá trị kinh tếcao, được trồng phổ biến tại nhiều địa phương ở Việt Nam Tuy nhiên, trong quá trìnhcanh tác, cây mít đang đối mặt với nhiều loại sâu bệnh, trong đó nghiêm trọng nhất là

bệnh đen sơ mít do vi khuẩn Pantoea stewartii gây ra Bệnh này tấn công vào quả mít,

làm sơ bị thâm đen, gây thối rữa và phát sinh mùi hôi, khiến chất lượng và giá trị thươngphẩm của quả bị giảm sút nghiêm trọng Theo thống kê, tại một số vùng trồng mít chính,

tỷ lệ cây nhiễm bệnh lên đến 30–50%, làm giảm năng suất từ 20–40%, gây thiệt hại kinh

tế từ 10–15 triệu đồng mỗi hecta ( Với diện tích trồng lớn tại các tỉnh như Tiền Giang,Đồng Tháp hay Bình Thuận, tổng thiệt hại hàng năm có thể lên đến hàng chục tỷ đồng

Hình 1.1 Triệu chứng đen xơ mít trên giống mít Changai thu tại Tiền Giang.

vụ cấp thiết để bảo vệ cây mít, nâng cao năng suất, và đảm bảo nguồn thu nhập bền vữngcho người nông dân

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định sự hiện diện của vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh đen sơ trên mít

bằng kĩ thuật khuyếch đại PCR và điện di trên gel agarose

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Ly trích DNA của Pantoea stewartii từ dịch khuẩn tăng sinh và điện ditổng số để kiểm tra sự hiện diện của chủng vi khuẩn này sau ly trích

Nội dung 2: Thực hiện PCR vùng trình tự 16s rARN vùng đặc trưng cho sự hiệndiện vi khuẩn và điện di trên gel agarose quan sát band có sử dụng ladder

Nội dung 3: Thực hiện phản ứng PCR với primer thiết kế cho Pantoea stewartii vàđiện di kiểm tra kết quả khuyếch đại

Nội dung 4: Thực hiện phản ứng PCR với primer tham khảo từ bài báo khoa học vàđiện di kiểm tra kết quả trên gel agarose

2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.Tổng quan về vi khuẩn gây bệnh đen xơ mít Pantoea stewartii

Pantoea stewartii thuộc giới Bacteria, ngành Pseudomonadota, thuộc lớp

Gammaproteibacteria, Bộ Enterobacterales, Họ Erwiniaceae Vi khuẩn Pantoea

stewartii là mối đe dọa của nhiều loại cây trồng, ảnh hưởng lớn đến chất lượng, giá trị

thương phẩm của trái

Pantoea stewartii không chỉ được biết đến như là tác nhân gây bệnh héo vàngStewart trên ngô mà còn có thể gây ra triệu chứng đen xơ trên một số cây trồng khác,

trong đó có mít (Artocarpus heterophyllus) Tình trạng này ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng quả và giá trị kinh tế Mít có tên khoa học là Artocarpus heterophyllus, một loại

cây trồng và canh tác kinh tế ở hơn 60 quốc gia trên toàn thế giới, đặc biệt là ở Châu Á,

với Ấn Độ và Bangladesh Vi khuẩn Pantoea stewartii là tác nhân chính gây ra bệnh đen

sơ mít, đặc biệt là các giống mít có độ ngọt cao như mít Thái, gây ra nhiều thiệt hại chongành trồng mít trên toàn thế giới và cả Việt Nam Các triệu chứng bệnh trên trái mítnhư: thối nhũn thịt quả, đen sơ múi mít và mùi hôi Thịt mít bị nhiễm bệnh sẽ chuyểnmàu từ trắng sang vàng, sau đó sang màu nâu đen và cuối cùng là bị thối nhũn và mềmnhũn Đối với bệnh đen sơ mít có thể gây rụng trái non, giảm số lượng trái chín và làmgiảm chất lượng năng suất của cây mít Vi khuẩn này là một loại vi khuẩn hiếu khí, Gram

âm, sắc tố màu vàng, tạo chất nhầy, không hình thành bào tử, hình que kích thước 0,4 0,8 x 0,9  2,2 µm Một số chủng phát triển ở 4°C, một số ở 37°C Khuẩn lạc trên thạchnấm men-dextrose-canxi cacbonat có màu vàng và lồi Khuẩn lạc trên thạch nutrientdextrose có màu vàng kem đến vàng cam Pantoea stewartii tạo ra các polysaccharidengoại bào có liên quan đến khả năng gây bệnh, tức là độc lực (Bradbury, 1967 ; Pepper,

1967).Vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh chủ yếu ở giai đoạn đang hình thành và phát triển trái Con đường lây nhiễm của vi khuẩn Pantoea stewartii chủ yếu thông qua thông

qua vết thương hở trên vỏ trái, các lỗ tự nhiên như lỗ cuống hoặc theo nước mưa vào các

kẽ hở giữa các trái đơn Sau khi xâm nhập vào trái mít, vi khuẩn sẽ nhanh chóng nhânnhanh số lượng, phát triển và tiết ra các enzyme phân hủy các mô tế bào của trái Quátrình này làm cho thịt quả mít bị thối nhũn và có mùi hôi Ngoài ra còn có thể gây ra cáctriệu chứng khác như: trái bị dị dạng, vỏ tráo có đốm đen và cuống trái bị thối Điều kiện

thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn Pantoea stewartii, chủ yếu xuất hiện vào mùa

mưa khi độ ẩm cao, các trái mít có độ ngọt cao và vỏ mỏng tạo điều kiện cho sự xâm

nhiễm và phát triển của vi khuẩn Pantoea stewartii

2.2 Giới thiệu về phương pháp PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật sinh học phổ biếnđược sử dụng để nhân đôi và tăng số lượng DNA một cách nhanh chóng Kỹ thuật này donhà sinh học người Mỹ là Kary Mullis phát triển vào những năm 1980 và đã đem lạinhững đóng góp quan trọng trong nhiều lĩnh vực như gen học, y học và nhiều lĩnh vựcnghiên cứu khác Kể từ khi Kary Mullis phát minh PCR, phương pháp này đã trải quanhiều cải tiến và biến thể Các phiên bản hiện đại của PCR kết hợp các công nghệ vàthuật ngữ mới để cải thiện độ chính xác, độ nhạy và tốc độ thực hiện Phương pháp PCR(Polymerase Chain Reaction) là một công cụ hữu ích để phát hiện và định danh vi khuẩnPantoea stewartii nhờ khả năng nhân bản DNA đặc hiệu của vi khuẩn từ các mẫu bệnhphẩm

Quá trình PCR thường bao gồm các giai đoạn thăng nhiệt, giảm nhiệt và giữ ổnđịnh nhiệt để tạo ra các bản sao của DNA mẫu Các chu kỳ nhiệt thường được thực hiệnbằng cách sử dụng máy PCR có khả năng kiểm soát nhiệt độ một cách chính xác như:RT-PCR, qPCR, và nested PCR PCR sử dụng cặp mồi (primer) đặc hiệu, nhắm vào mộtđoạn gene đặc trưng của Pantoea stewartii để khuếch đại DNA Sự khuếch đại thànhcông đoạn DNA mục tiêu chứng tỏ sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu

Ưu điểm của phương pháp PCR khi ứng dụng phát hiện vi khuẩn đen xơ mít:

Độ nhạy cao: Có thể phát hiện lượng nhỏ vi khuẩn trong mẫu

Đặc hiệu: Xác định đúng loài Pantoea stewartii mà không nhầm lẫn với các vikhuẩn khác

Thời gian nhanh chóng: Kết quả có thể đạt được trong vài giờ

2.3 Giới thiệu về phương pháp điện di trên gel Agarose.

Điện di trên gel agarose (Agarose gel electrophoresis) là kỹ thuật được sử dụng chủyếu để phân tách DNA, RNA hoặc protein trong mẫu dựa trên trên nguyên tắc di chuyểncủa các phân tử trong điện trường và phụ thuộc kích thước của chúng Thực hiện quátrình điện di trên gel agarose 1% với hiệu điện thế 100V trong thời gian 25 phút

4

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

3.1 Nội dung 1: Ly trích DNA vi khuẩn bằng lysis buffer và điện di DNA tổng số trên gel agarose

3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian thực hiện: ngày 23/10/2024

Địa điểm thực hiện: phòng RIBE 302 tòa A1, Khoa Khoa học sinh học, Trường đạihọc Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu vi khuẩn (mã số 1) từ ống tăng sinh nghi ngờ có sự hiện diên của vi khuẩnPantoea stewartii

3.1.3 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất

Dụng cụ: máy ly tâm, máy votex mẫu, bồn điện di, máy chụp gel UV

Hóa chất: Gel agarose 1%, TBE bufer, Loading dye, Gel red, Chloroform, Ethanol 70%,STE (Sodium Tris EDTA), lysis buffer, CI, Isopropanol

Bước 3: Thêm 400 µL lysis buffer Vortex đều và ủ ở 65oC trong 60 phút

Bước 4: Thêm 300 µL CI, sau đó đảo đều Ly tâm 13.000 vòng/10 phút

Bước 5: Hút 300 µL dịch nổi qua tube mới Sau đó, thêm 100 µL Chloroform với

tỷ lệ 3:1 Ly tâm 13.000 vòng/18 phút

Bước 6: Hút 200 µL dịch nổi qua tube mới Thêm 100 µL Isopropanol vào, đảo nhẹ cho đồng nhất mẫu Ủ lạnh 30 phút và ly tâm 13.000 vòng/13 phút Đổ dịch nổiBước 7: Rửa kết quả bằng 480 µL Ethanol 70% Ly tâm 13.000 vòng/10 phút, bỏdịch nổi và để khô tự nhiên

Bước 8: Thêm 50 µL TE buffer và Elution buffer Bảo quản ở - 20oC

Bước 9: Chuẩn bị 30 ml gel agarose 1%, cho 0,3 g agarose vào 30 ml dung dịch TBE 0,5X đun sôi trong lò vi sóng để hòa tan agarose

Bước 10: Đợi gel còn hơi ấm nóng 50℃, đổ gel vào khuôn có gắn lược để tạo hình giếng, gel đông chuyển miếng gel vào bồn điện di (đã chuẩn bị sẳn một lượng TBE buffer 0,5X sao cho ngập toàn bộ bề mặt gel).

Bước 11: Mẫu DNA được votex cho đều, dùng micropipet hút và mix đều hỗn hợp gồm 3 μlDNA mẫu, 1μl gel red, 0,5 μl loading dye Chuyển hỗn hợp vào giếng điện di và thiết lập điện di trong 25 phút tại hiệu điện thế 100V Chụp gel dưới đèn UV

để quan sát kết quả, band ghi nhận nằm trong khoảng 1200 – 1500 bp

3.2 Nội dung 2: PCR trình tự vùng 16s RNA và điện di kiểm tra kết quả

3.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian thực hiện: ngày 30/10/2024

Địa điểm thực hiện: phòng RIBE 302 tòa A1, Khoa Khoa học sinh học, Trường đạihọc Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2.2 Mục tiêu thực hiện

Sử dụng phương pháp PCR khuếch đại trình tự vùng gen bảo tồn 16S rRNA (vùnggen đặc trưng của vi khuẩn) và kỹ thuật điện di để kiểm tra kết quả khuyếch đại và kíchthước band mục tiêu

3.2.3 Vật liệu, hóa chất, trang thiết bị

Vật liệu: Tube, micropipet, mẫu ly trích DNA (mã số 1)

Hóa chất: Dream taq, Nuclease-Free Water (H2O), Primer xuôi: 63F, Primer ngược:1489R, Gel agarose 1%, Ladder 1Kb, TBE buffer 0,5X, Gelred, Loading dye

Thiết bị gồm có :Máy votex, máy luân nhiệt PCR, bồn điện di trên gel Agarose

3.2.4 Quy trình tiến hành PCR và điện di phân tích kết quả.

3.2.4.1 Quy trình PCR

6

Hình 3.1 Máy votex Hình 3.2 Máy PCR Hình 3.3 Bồn điện di

Bước 1: Votex mẫu số 1 trên máy votex khoảng 1 đến 2 phút Pha loãng mẫu DNA

bằng nước khử ion do nồng độ DNA sau điện di tổng số cao, dể gây ức chế phản ứngPCR, mẫu được pha loãng 2 lần (25 μlnước với 25 μl DNA mẫu 1)

Bước 2: Chuẩn bị Master mix bao gồm 5,9 µL H2O, 2 µL, 0,5 µL primer 63F, 0,5

µL primer 1489R, Tag DNA polymerase 0,1 µL, DNA template 1 µL Mix đều hỗn hợptránh tạo bọt trong tube Bổ sung đối chứng âm là nước cất để kiểm tra quá trình thao tác

và kiểm tra hóa chất sử dung

Bước 3: Hút 1 µl DNA mẫu cho vào 9 µl Master mix, sau đó dùng micropipette

trộn đều mẫu

Bước 4: Tiến hành PCR trong chu trình nhiệt sau: tiền biến tính 95 oC trong 3 phút,biến tính 95 oC trong 30 giây, bắt cặp 52 oC trong 30 giây, kéo dài 72 oC trong 30 giây vàhậu kéo dài 72 oC trong 7 phút Sau đó, mẫu số 1 được bảo quản 25 oC trong 2 phút

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR vùng trình tự 16s RNA của vi khuẩn

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng khuyếch đại PCR 16s rARN

35

-3.2.4.2 Quy trình chạy điện di trên gel Agarose

Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1%, cho 0,3 g agarose vào 30 mL dung dịch TBE

0,5X đun hỗn hợp trên trong máy microwave cho tới khi agarose tan hòa toàn

Bước 2: Làm nguội gel agarose sau khi đun đến khoảng 60°C, sau đó đổ vào khuôn

đã được lắp đặt trước, đợi đến khi gel đông hoàn toàn

Bước 3: Lấy lược ra, đưa gel vào bồn điện di đã có sẵn dung dịch TBE 0,5X Chuẩn

bị mẫu và tiến hành điện di

Bước 4: Trộn đều mẫu số 1 (mẫu vừa PCR xong) trước khi hút Hút 5 µL DNA mẫu

và 1 µL hỗn hợp Gel red và loading dye Cho toàn bộ hỗn hợp trên vào giếng

Bước 5: Hút 2 µL ladder đã được trộn với 1 µL gel red và loading dye cho vào

giếng đầu tiên làm thang chuẩn

Bước 6: Hút 4 µL nước trộn với 1 µL gelred và loading dye cho vào giếng thứ 2 để

làm đối chứng âm

Bước 7: Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút.

Bước 8: Chụp hình và ghi nhận kết quả điện di trong buồng chụp dưới đèn UV.

Kích thước band nằm trong khoảng 1500 bp

3.3 Nội dung 3: Chạy PCR với cặp primer chuyên biệt cho Pantoea stewartii đen sơ

mít (Panto R-F)

3.3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu bắt đầu vào lúc 12 giờ 15 phút, ngày 6 tháng 11 năm 2024, tại phòngNghiên cứu Chuẩn đoán bệnh học (BIO 304), Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại họcNông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.3.2 Mục đích nghiên cứu

Sử dụng primer chuyên biệt Panto R-F để xác định tính hiện diện của loài đen sơ

mít (Pantoea sp.)

Kiểm tra khả năng khuếch đại đặc hiệu của mẫu

3.3.3 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu DNA 01, TBE 0,5X, gel agarose 1%, gel red, Loading dye, PCR master mix20X, primer Panto R-F

Thiết bị: máy luân nhiệt PCR, bộ điện di gel agarose, máy chụp ảnh gel điện dibằng UV, máy votex, pipet, tube,

8