N03 chẩn Đoán bệnh tv bằng shpt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO GIỮA KỲ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN THẾ HỆ MỚI DỰA TRÊN CRISPR VÀ KHUẾCH ĐẠI ĐẲNG NHIỆT ĐỂ PH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO GIỮA KỲ

PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN THẾ HỆ MỚI DỰA TRÊN CRISPR VÀ KHUẾCH ĐẠI ĐẲNG NHIỆT

ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS TRONG CỦ CẢI ĐƯỜNG

Môn học : Chẩn đoán bệnh thực vật bằng SHPT Giảng viên : PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc

Nhóm học : Thứ 5 ca 3

TP Hồ Chí Minh, 12/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO GIỮA KỲ

PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN THẾ HỆ MỚI DỰA TRÊN CRISPR VÀ KHUẾCH ĐẠI ĐẲNG NHIỆT

ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS TRONG CỦ CẢI ĐƯỜNG

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu chung về củ cải đường 2

2.1.1 Giới thiệu 2

2.1.2 Thành phần dinh dưỡng và công dụng 3

2.2 Giới thiệu về bệnh trên củ cải đường 4

2.2.1 Bệnh Rhizomania 4

2.2.2 Virus BNYVV – virus vàng hoại tử củ cải đường 5

2.2.3 Các bệnh thường gặp khác 6

2.3 Giới thiệu chung về phương pháp CRISPR 7

2.3.1 CRISPR 7

2.3.2 CRISPR – Cas12a 7

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 9

3.1 Vật liệu 9

3.2 Phương pháp nghiên cứu 10

3.2.1 Tái nhiễm virus từ mẫu đất lên giống củ cải đường 10

3.2.2 Phiên mã ngược – khuếch đại polymerase tái tổ hợp 10

3.2.3 Xét nghiệm xác nhận CRISPR Guide RNA 12

3.2.4 Xét nghiệm CRISPR-Cas12a Reporter 13

4.1 Kết quả 15

4.1.1 Khuếch đại đẳng nhiệt và xác nhận trình tự của BNYVV từ rễ B vulgaris bằng RT-RPA 15

4.1.2 Xác nhận RNA hướng dẫn (gRNA) được thiết kế để nhắm mục tiêu vào bộ gen BNYVV 17

4.1.3 Đánh giá độ nhạy của việc phát hiện BNYVV dựa trên CRISPR-Cas12a bằng cách

sử dụng các mục tiêu tổng hợp 18

4.1.4 Phát hiện BNYVV dựa trên CRISPR-Cas12a trong rễ cây B Vulgaris nhiễm bệnh

Rhizomania từ đất đồng ruộng 204.2 Thảo luận 21TÀI LIỆU THAM KHẢO 24

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi, ssDNA reporter, RNA định vị CRISPR và mục tiêu

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1 Hình thái phần thân của các cây củ cải đường. 15

Hình 4.4 Sơ đồ bộ gen RNA1 của BNYVV cho thấy vị trí của vị trí mục tiêu RNA

Hình 4.6 Sơ đồ độ nhạy của phát hiện BNYVV dựa trên CRISPR-Cas12a sử dụng các

Hình 4.7 Đồ thị so sánh kết quả tín hiệu huỳnh quang của mẫu nhiễm bệnh và mẫu

Hình 4.8 Minh họa sơ đồ các quy trình từng bước liên quan đến việc phát triển chẩn

đoán BNYVV dựa trên CRISPR-Cas12a cho bệnh rễ giả ở rễ củ cải đường 21

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây củ cải đường là một trong những nguồn cung cấp đường quan trọng trên thếgiới Tuy nhiên, cây trồng này thường xuyên phải đối mặt với nhiều loại bệnh do virusgây ra làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng sản phẩm Một trongnhững bệnh nghiêm trọng phải kể đến là bệnh rhizomania do vi-rút hoại tử gân vàng củcải đường (BNYVV) gây ra Việc phát hiện sớm và chính xác các loại virus này là vôcùng quan trọng để có thể đưa ra các biện pháp phòng trừ kịp thời, hạn chế thiệt hại kinh

tế cho người nông dân

Các phương pháp chẩn đoán virus truyền thống như ELISA, PCR thường gặp một sốhạn chế như độ nhạy thấp, thời gian phân tích lâu, đòi hỏi thiết bị hiện đại và nhân lực cótrình độ cao Do đó, việc tìm kiếm một phương pháp chẩn đoán virus mới, nhanh chóng,chính xác và dễ thực hiện là một nhu cầu cấp thiết

Trong những năm gần đây, công nghệ CRISPR/Cas9 đã tạo ra một cuộc cách mạngtrong lĩnh vực chỉnh sửa gen Với khả năng nhận biết và cắt chính xác các đoạn DNAmục tiêu, CRISPR/Cas9 hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng tiềm năng trong lĩnh vựcchẩn đoán bệnh Bài nghiên cứu này đã đưa ra một phương pháp chẩn đoán virus thế hệmới dựa trên công nghệ CRISPR-Cas12a, kết hợp với kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệtRT-RPA để phát hiện virus BNYVV gây bệnh rhizomania trên cây củ cải đường

1.2 Mục tiêu

Sử dụng kỹ thuật CRISPR-Cas12a kết hợp với kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt RPA, để phát hiện virus BNYVV gây bệnh rhizomania trên cây củ cải đường

RT-CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về củ cải đường

2.1.1 Giới thiệu

Củ cải đường hay còn gọi Beta vulgaris, thuộc họ rau dền (Amaranthaceae) Là cây

thảo có rễ phình thành củ lạc, ngọt, màu đỏ thẫm Thân đứng có vằn, ít phân nhánh Lá cóphiến hình trứng, màu lục, có mép lượn sóng Hoa màu lục nhạt, mọc thành bông khá dài.Nước củ cải đường chứa hàm lượng sucrose cao và chỉ đứng sau mía nguồn cung cấpđường chính trên thế giới Củ cải đường là một loại rất phổ biến ở Đông và Trung Âu,nhưng ít quan trọng hơn ở Tây Âu và Hoa Kỳ, Nó được trồng để lấy rễ sưng tấy và là

dạng làm vườn của loài Beta Vulgaris subsp Vulgaris cũng bao gồm các loại cây nông

nghiệp như củ cả đường, củ cải và củ cải làm thức ăn gia súc Loài này cũng bao gồm củ

cải (subsp cicla) và củ cải biển (subsp maritima), được cho là tổ tiên của hầu hết các

giống cây trồng (Campbell và cộng sự, 1976) Hình thức củ cải thuần hóa sớm nhất là củcải lá Những chiếc lá đã được ăn và rễ cây chỉ được sử dụng cho mục đích y tế DeBockcoi đó là lần đầu tiên những báo cáo đáng tin cậy về cây củ cải đường có rễ sưng tấy xuấthiện ở tiếng Ả Rập thế kỷ 12

Hình 2.1 Củ cải đường

Tuy nhiên, Campbell nói rằng củ cải đường đặc trưng trong công thức nấu ăn La Mãcủa thế kỷ thứ hai và thứ ba Các công thức nấu ăn bằng tiếng Anh thế kỷ 14 cũng đượccho là mô tả công dụng của củ cải đường, và các loại thảo dược châu Âu thế kỷ 16 đã chia

củ cải đường thành củ cải đường (là loại cây trồng chính) và củ cải đường mọng nước,màu đỏ sẫm Loại thứ hai chỉ dành riêng cho con người và phải đến đầu thế kỷ 18 củ cảiđường được sử dụng làm thức ăn gia súc (Toxopeus, 1984) Bởi củ cải đường làm thức

ăn gia súc vào đầu thế kỷ 19 đã trở thành một phần không thể thiếu trong hệ thống canhtác hỗn hợp của Châu Âu Củ cải đường phát triển từ củ cải đường Củ cải đường là mộtloại cây nông nghiệp ôn đới quan trọng và vì vậy đã nhận được nhiều sự quan tâm từ cácnhà nhân giống cây trồng, nhà nghiên cứu bệnh học và nhà nông học (Van Geyt và cộng

sự, 1990) Mặc dù phần lớn nghiên cứu này là áp dụng cho việc nhân giống củ cải đường,tình trạng thứ yếu của cây trồng làm vườn đã dẫn đến việc tốn ít công sức hơn cho nghiêncứu nhân giống Do đó thường có một sự chậm trễ đáng kể trước những phát triển mớitrong việc nhân giống củ cải đường được áp dụng cho củ cải đường Chương này tậptrung vào nghiên cứu đã được thực hiện trực tiếp trên củ cải đường

2.1.2 Thành phần dinh dưỡng và công dụng

Người ta đã biết trong Củ cải đường đều có các vitamin A, B, C, PP, nhiều đường,các chất khoáng như K (chỉ thua men bia), Mg, P, Rb, Ca, Fe, Cu, Br, Zn, Mn, và các acidamin; asparagin, betaine, glutamine… Màu đỏ của Củ cải đường là do có chất betanin,một β-cyanin khi vào cơ thể con người có thể bị thoái hoá hay không Ở Ấn Độ, người ta

đã định được lượng Zn trong Củ dền là 2mg/kg Củ cải đường còn xanh chứa nhiều sắt vàgiàu vitamin hơn, nhất là Vitamin A

Củ cải đường có nhiều công dụng quan trọng như giúp thanh lọc máu, Một nghiêncứu trên tờ báo Journal of Nursing and Health Science cho kết quả rằng những thiếu nữ

bị tình trạng thiếu máu có thể được cải thiện hàm lượng sắt trong khoảng thời gian 20ngày bằng cách sử dụng nước ép củ cải đường uống hàng ngày Thành phần sắt có chứanhiều trong củ cải đường, hợp chất cần thiết cho sự hình thành hợp chất hemoglobin –protein có trong các tế bào hồng cầu có nhiệm vụ vận chuyển oxy tới các cơ quan của cơthể Như vậy, dung dịch này mang lại nhiều lợi ích cho phụ nữ thời kỳ mang thai, bởi vì ởgiai đoạn này phụ nữ rất cần cung cấp lượng sắt nhiều hơn so mức bình thường, ngoài ra,

củ cải đường còn giúp cho tim được khỏe mạnh, hợp chất nitrat có trong củ cải đường cókhả năng giúp cải thiện sức khỏe tim Trong trường hợp bạn có tình trạng cao huyết áp và

bệnh liên quan đến tim mạch, thì nên sử dụng nước ép củ cải đường sẽ mang lại khánhiều lợi ích cho sức khỏe tim Bởi vì, dung dịch nước củ cải đường có thể giúp thanh lọcmáu đồng thời cải thiện tình trạng lưu thông máu Khi sử dụng nước ép củ cải đườngđược chiết xuất từ 500mg loại rau củ này trong thời gian liên tục 2 tuần có thể giúp giảmhuyết áp trong vòng 6 giờ sau khi sử dụng, giúp ngăn chặn quá trình lão hóa, kiểm soátbệnh tiểu đường, phòng ngừa bệnh ung thư bênh cạnh đó còn có tác dụng giảm béo.

2.2 Giới thiệu về bệnh trên củ cải đường

ra nhờ kiến thức nâng cao về các tác nhân gây bệnh (củ cải đường vi rút hoại tử tĩnh mạchmàu vàng và Polymyxa betae) thu được ở Nhật Bản và Đức

Rhizomania được xếp hạng là bệnh gây hại nặng nhất trên củ cải đường (Scholten vàLange, 2000) Điều này là do nó vẫn tiếp tục được phổ biến ở hầu hết các nước sản xuất

củ cải đường (McGrann và cộng sự, 2009), do nó tồn tại rất lâu trong đất, và thiệt hại

tiềm ẩn có thể làm giảm năng suất củ cải đường từ 80% trở lên so với tình trạng khỏemạnh (Peltier và cộng sự, 2008 ) Trong các thử nghiệm trên ruộng không bị bệnh vàkhông có bệnh rhizomania, chỉ số diện tích lá giảm 24 % (LAI) kèm theo tổn thất 57%chất khô ở rễ (Rezaei và cộng sự, 2014) Ở Đức, ước tính sản lượng đường giảm 15% đãgây thiệt hại kinh tế khoảng 5,5M$ (Schoufele, 1983 ) Ở Áo, việc trồng các giống nhạycảm với Rhizomania ước tính các năm 1981, 1982 và 1983 gây thiệt hại từ 1,5 đến 3,5triệu USD (Graf 1984 ) Nếu các giống kháng bệnh được gieo trồng thì thiệt hại có thể làtương ứng giảm 0,3–1,5 triệu đô la.

2.2.2 Virus BNYVV – virus vàng hoại tử củ cải đường

Hiện nay, rhizomania là bệnh quan trọng nhất ở củ cải đường trên toàn thế giới vàbệnh có thể gây ra thiệt hại nghiêm trọng về năng suất Bệnh này do vi-rút hoại tử gân

vàng củ cải đường (BNYVV) gây ra và được truyền qua nấm đất Polymyxa betae P.

betae có thể hình thành các bào tử có khả năng phân hủy sinh học, hạn hán và xử lý thuốctrừ sâu cực tốt, cho phép các bào tử độc hại tồn tại trong hơn hai thập kỉ ở những vùng đất

bị nhiễm khuẩn BNYVV sở hữu bộ gen RNA chuỗi đơn có cảm giác tích cực tuyến tínhgồm nhiều phần bao gồm bốn đến năm RNA sở hữu 5 nắp và 3 đầu được polyadeny hóa

BNYVV thuộc siêu nhóm giống alphavirus và là loài điển hình của chi Benyvirus, chứa

cả virus Beet soil – borne mosaic (BSBMV) (Lee và cộng sự, 2001) BNYVV và

BSBMV có hình que, có chung tổ chức bộ gen (Lee và cộng sự, 2001), phạm vi vật chủ

và được truyền bởi vectơ nguyên sinh P betae Tuy nhiên, BSBMV chỉ được phát hiện ở

Bắc Mỹ BSBMV và BNYVV có liên quan chặt chẽ với nhau nhưng là các loại viruskhác nhau vì các gen kháng Rz không có tác dụng đối với sự tích lũy BSBMV (Wisler vàcộng sự, 2003) và không có phản ứng chéo với kháng huyết thanh protein vỏ cũng nhưkhông có bảo vệ chéo nào được mô tả Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằngBNYVV RNA-1 và -2 có thể khuếch đại BSBMV RNA-3 và -4, nhưng chỉ khi không cócác RNA nhỏ BNYVV (Claudio Ratti và David Gilmer, chưa được công bố) Cả hai loạivirus đều có thể cạnh tranh để giành được các yếu tố vật chủ tương tự Giả thuyết như vậy

sẽ được kiểm tra ngay khi có sẵn các dòng vô tính truyền nhiễm đầy đủ của BSBMVRNA-1 và -2

BNYVV có bộ gen RNA phân đoạn bao gồm 4 đến 5 thành phần bộ gen (Tamada,1999) Tất cả các thành phần đều có đuôi 5 Cap (m7 GpppG) và đuôi 3 polyA Giải trình

tự cùng với các dòng vô tính truyền nhiễm có chiều dài đầy đủ (Quillet và cộng sự, 1989;

Link và cộng sự, 2005) cho phép giải mã tổ chức bộ gen của virus và các chức năng chínhcủa protein được mã hóa bằng virus RNA-1 tham gia vào quá trình sao chép các RNAcủa virus (Gilmer và cộng sự, 1992) và RNA-2 cần thiết cho quá trình đóng gói, dichuyển từ tế bào này sang tế bào khác và ức chế làm im lặng RNA (RNA-2), như đã đượcchứng minh bằng nhiễm trùng nguyên sinh và cơ học của lá RNA-1 và -2 là cần thiết và

đủ để lây nhiễm sau khi tiêm cơ học vào lá trong đó các thành phần nhỏ có thể được phânphối và nếu có mặt, chúng có thể bị xóa hoặc biến mất (Bouzoubaa và cộng sự, 1991).Tuy nhiên, trong nhiễm trùng tự nhiên, những thành phần nhỏ này là cần thiết Thật vậy,RNA-3 cho phép khuếch đại virus trong rễ củ cải đường và biểu hiện của nó ảnh hưởngđến các triệu chứng (Tamada và cộng sự, 1989; Jupin, 1992), trong khi RNA-4 có liênquan đến sự lây truyền virus (Tamada và Abe, 1989) Hơn nữa, p31 được mã hóa RNA-4được mô tả như một chất ức chế sự im lặng đặc hiệu của rễ Do đó, BNYVV là một loạivirus độc nhất vì nó hoạt động như một loại virus lưỡng cực khi được tiêm chủng hoặcnhư một loại virus tetra hoặc pentapartite trong nhiễm trùng tự nhiên Đặc tính như vậy

đã được sử dụng để thu được các vectơ biểu hiện virus, được đặt tên là các bản sao và cónguồn gốc từ RNA-3 và RNA-5 Những bản sao như vậy cho phép biểu hiện nhiều trình

tự khác nhau trong các mô bị nhiễm bệnh

2.2.3 Các bệnh thường gặp khác

Củ cải đường bị một số bệnh gây rối loạn trao đổi chất ít nhiều nghiêm trọng, làmgiảm năng suất đường và giảm chất lượng chế biến Các mầm bệnh không phân biệtđược giữa các loại cây củ cải đường Vì vậy, điều được phát hiện đầu tiên chống lại cácbệnh của củ cải đường do tầm quan trọng kinh tế lớn của nó sau đó có thể được chuyểnsang lá, vườn, củ cải làm thức ăn gia súc, v.v (McGrath và cộng sự 2007) Các bệnh

thường gặp trên củ cải đường phải kể đến như bệnh thối rễ do nấm Phytophthora (Thối

rễ Phytophthora), bệnh sương mai do Peronospora farinose, bệnh thối thân do Erwinia

carotovora, bệnh đóm lá do Cercospora beticola hoặc Alternaria spp gây ra,…

2.3 Giới thiệu chung về phương pháp CRISPR

2.3.1 CRISPR

CRISPR được viết tắt của những chữ cái đầu của cụm từ Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats CRISPR được phát hiện lần đầu tiên ở trong vikhuẩn và vi khuẩn cổ năm 1987 (Ishino và cộng sự, 1987) Tại thời điểm đó, CRISPRđược mô tả là một họ các trình tự DNA ngắn xuôi ngược lặp lại (đọc theo hướng xuôi hay

ngược thì đều có trình tự DNA giống nhau) và các trình tự này được ngăn cách với nhaubởi các vùng đệm (spacer) Tuy nhiên các nhà khoa học vẫn chưa biết chức năng củavùng CRISPR này là gì Năm 2012, lần đầu tiên công nghệ CRISPR được áp dụng làm kĩthuật chỉnh sửa hệ gen nhờ công trình nghiên cứu của nhóm tác giả Jennifer Doudna vàEmmanuelle Charpentier tại trường đại học California (Jinek và cộng sự, 2012) Trongnghiên cứu này nhóm tác giả đã đưa vào trong tế bào một phức hệ bao gồm enzyme Cas9nuclease và RNA dẫn đường (guide RNA) tự thiết kế để cắt đoạn DNA tại những vị trímong muốn Sau nghiên cứu này, hàng loạt các nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật CRISPR

đã được tiến hành tạo nên sự bùng nổ về công nghệ CRISPR trong những năm sau đó.Hiện nay rất nhiều tiến bộ trong việc ứng dụng công nghệ CRISPR đã được tìm ra vớimục đích cải thiện hệ thống để làm việc hiệu quả hơn, an toàn hơn khi ứng dụng cho việcchữa bệnh trên người

2.3.2 CRISPR – Cas12a

Trong số những tiến bộ khoa học quan trọng nhất trong những năm gần đây chính là

sự phát hiện và phát triển những phương pháp mới nhằm thực hiện biến đổi di truyền củasinh vật sống bằng cách sử dụng một loại công nghệ có đặc tính nhanh với giá cả hợp lýđược gọi là CRISPR Mới đây, các nhà khoa học tại Đại học Texas ở Austin cho biết họ

đã xác định được cách nâng cấp đơn giản cho công nghệ này, từ đó có thể giúp việc chỉnhsửa gen trở nên chính xác hơn và gia tăng độ an toàn, tạo điều kiện cho việc chỉnh sửagen trở nên an toàn để thích hợp ứng dụng trên người Nhóm nghiên cứu gồm những nhàsinh học phân tử đã tìm thấy bằng chứng thuyết phục rằng Cas9, một loại enzyme phổbiến nhất hiện đang được sử dụng trong công cụ chỉnh sửa gen CRISPR đồng thời là loạienzyme được phát hiện đầu tiên, có tính hiệu quả và độ chính xác thấp hơn so với mộttrong những protein CRISPR ít được sử dụng hơn Protein này được gọi là Cas12a

Do bởi Cas9 có nhiều khuynh hướng chỉnh sửa sai vị trí trên bộ gen của động vậthoặc thực vật, phá vỡ những chức năng còn hoạt động tốt, các nhà khoa học đã lý giảiviệc chuyển sang sử dụng Cas12a sẽ giúp việc chỉnh sửa gen trở nên an toàn và hiệu quảhơn trong một nghiên cứu của nhóm được công bố vào ngày 02 tháng 08 trên tạp chíMolecular Cell Nhóm nghiên cứu, dẫn đầu bởi nghiên cứu sinh Isabel Strohkendl vàgiáo sư Rick Russell, đã phát hiện ra rằng Cas12a là lựa chọn tốt hơn do bởi enzyme nàygắn với mục tiêu di truyền theo kiểu băng dán Velcro, trong khi Cas9 liên kết với genmục tiêu giống như keo siêu dính (super glue) Mỗi enzyme mang một trình tự di truyềnngắn có bản chất là RNA và tương thích với một trình tự di truyền đích có bản chất làDNA của virus Khi enzyme tiếp xúc với một số trình tự DNA, enzyme bắt đầu tìm cáchliên kết với DNA bằng việc hình thành các cặp liên kết - bắt đầu từ một đầu và thực hiệnbắt cặp dọc theo đoạn trình tự, đồng thời kiểm tra mức độ bắt cặp của mỗi ký tự ở mộtchuỗi bên (DNA) với ký tự liền kề ở mạch bên kia (RNA) Đối với Cas12a, enzyme nàyhoạt động như một loại băng dán Velcro Tại mỗi vị trí bắt cặp trên chuỗi trình tự, cácliên kết tương đối yếu Quá trình đòi hỏi một sự bắt cặp hoàn hảo trong suốt chiều dài ở

cả hai mạch bên để hai mạch này có thể liên kết đủ lâu và từ đó thực hiện quá trình chỉnhsửa Điều này khiến cho Cas12a có nhiều khả năng sẽ chỉ chỉnh sửa đúng phần đã đượcnhắm tới trên bộ gen

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu

Nội dung 1: Tái nhiễm virus từ mẫu đất lên giống củ cải đường

Mẫu đất: Lấy từ các vùng trồng củ cải đường ở Bắc Dakota và Minnesota, Mỹ.Hạt giống củ cải đường: Giống nhạy cảm với bệnh HD0484 được sử dụng để trồngthử nghiệm

Môi trường nuôi cấy: Sunshine Mix trộn với cát để trồng cây

Phân bón: Multicote để cung cấp dinh dưỡng cho cây

Nội dung 2: Thực hiện phiên mã ngược – khuếch đại polymerase tái tổ hợp

Mô rễ củ cải đường

Hóa chất:

Mồi PCR: Được thiết kế đặc biệt để khuếch đại đoạn gen của virus BNYVV.RNA định vị CRISPR: Để nhắm mục tiêu vào đoạn gen cụ thể của BNYVV.ssDNA reporter: Dùng để phát hiện sự cắt DNA bởi Cas12a

Enzyme: Reverse transcriptase (M-MuLV) để chuyển RNA thành DNA, Cas12a

để cắt DNA mục tiêu

Bộ kit chiết tách RNA: RNeasy Plant Mini Kit để tách RNA từ mẫu mô

Gel agarose: Sử dụng để điện di sản phẩm PCR

Thuốc nhuộm: SyberSafe để nhuộm gel agarose

Plasmid: Mang trình tự gen tổng hợp của BNYVV để làm chuẩn

Nội dung 3: Xét nghiệm xác nhận CRISPR Guide RNA

DNA plasmid: Mang trình tự gen BNYVV RNA-1 tổng hợp (Genewiz, SouthPlainfield, NJ, United States)

DNA khuôn mẫu tuyến tính (linear dsDNA template): Tạo ra bằng PCR từ plasmidDNA chứa trình tự BNYVV (464 bp) sử dụng mồi VR-3 và VR-4

DNA tổng hợp BNYVV: Dùng làm mẫu kiểm tra độ nhạy của xét nghiệm

Enzyme Cas12a: Từ vi khuẩn Lachnospinaceae (New England Biolabs, NEB,Ipswich, MA, United States)

Guide RNA (21 nts): Thiết kế và tổng hợp bởi IDT (Coralville, IA, United States)Hóa chất:

Dung dịch đệm: Cung cấp kèm với enzyme Cas12a