Nhóm 2 chiều thứ 4 báo cáo th chẩn Đoán tv bằng shpt

Song song đó, cây mít vẫn có thể mắc một số triệu chứng bệnh thường gặp là do vi khuẩn và nấm và một số loài tuyến trùng trong đó Pantoea stewartii subsp.. Tuy nhiên, trong thời gian gần

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ Nhóm thực hiện : NHÓM 2-THỨ 4-CA CHIỀU

TP Thủ Đức, 12/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

Giảng viên hướng dẫn: PGS TS NGUYỄN BẢO QUỐC

Sinh viên thực hiện:

STT Mã số sinh viên Họ và tên Ký tên

1 21126482 Đặng Thị Bảo Quyên

2 21126413 Dương Võ Phương Ngân

3 21126037 Huỳnh Ngọc Thùy Dương

TP Thủ Đức, 12/2024

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC 3

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH SÁCH CÁC BẢNG 6

DANH SÁCH CÁC HÌNH 7

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về Pantoea stewartii 3

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm hình thái 3

2.1.2 Giới thiệu bệnh đen xơ trên cây mít 3

2.2 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 4

2.2.1 Khái niệm 4

2.2.2 Các bước thực hiện 4

2.2.3 Ứng dụng 4

2.3 Điện di 5

2.3.1 Khái niệm 5

2.3.2 Thành phần 5

2.3.3 Phương pháp 5

2.4 Vùng 16S rRNA 6

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 7

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 7

3.2 Vật liệu nghiên cứu và thiết bị 7

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 7

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 7

3.2.3 Hóa chất 7

3.3 Phương pháp nghiên cứu 7

ii

3.3.1 Ly trích vi khuẩn đã phân lập gây bệnh xơ đen trên mít 7

3.3.2 Điện di (kiểm tra DNA tổng số) 8

3.3.3 Thực hiện phản ứng PCR ở vùng 16S rRNA 8

3.3.4 Điện di mẫu PCR primer 16S rRNA 9

3.3.5 PCR với cặp mồi chuyên biệt cho loài (mồi tự thiết kế) 9

3.3.6 Điện di mẫu PCR primer tự thiết kế 10

3.3.6 PCR với cặp mồi ES16 – ESIG2C 10

3.3.7 Điện di mẫu PCR với cặp mồi ES16 – ESIG2C 11

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12

4.1 Kết quả 12

4.1.1 Kết quả ly trích 12

4.1.2 Kết quả điện di sau ly trích 12

4.1.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 16S – rRNA 13

4.1.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi tự thiết kế 13

4.1.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ES16 – ESIG2C 14

4.2 Thảo luận 14

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 15

5.1 Kết luận 15

5.2 Đề nghị 15

TÀI LIỆU THAM KHẢO 16

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

bp : base pair

DNA : Deoxyribonucleic acid

PCR : Polymerase Chain Reaction

rRNA : Ribosome Ribonucleic acid

TBE : Tris-Boarate-EDTA

UV : Ultraviolet

iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Pantoea stewartii gây bệnh xơ đen trên mít 3

Hình 4.1 Kết quả ly trích từ mẫu 2 11

Hình 4.2 Kết quả điện di tổng số tham khảo 11

Hình 4.3 Kết quả điện di tổng số thực hiện 11

Hình 4.4 Kết quả điện di của phản ứng PCR với primer 16S RNA 12

Hình 4.5 Kết quả điện di của phản ứng PCR với primer tự thiết kế 12

Hình 4.6 Kết quả điện di của phản ứng PCR với primer ES16 – ESIG2C… 13

v

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây mít thuộc giới Plantae, bộ Rosales, họ oraceae, chi Artocarpus là cây ăn quả

có nguồn gốc ở Nam Ấn Độ, các nước Đông Nam Á, Thái Lan, Philip-pines, Ấn Độ,Bănglađét Ở Việt Nam, mít được trồng tập trung ở các tỉnh như Tiền Giang, Hậu Giang,Long An, Đồng Nai, Thành phố Hồ Chí Minh Quả có cấu trúc độc đáo, hương thơm vàhương vị nồng nàn, được coi là một trong những loại quả nặng nhất trên cây trên thế

Hiện nay, trồng mít mang lại lợi nhuận đáng kể giúp vào công việc thu hoạch sớm vànăng suất cao Theo số liệu thống kê từ Tổng cục Hải quan, kim ngạch xuất khẩu quả mítcủa Việt Nam trong tháng 12/2023 đạt 36,3 triệu USD, tăng đột biến 101,5% so với cùng

kỳ bên cạnh việc tiêu thụ trong nước, trái mít còn được xuất khẩu ra nhiều quốc gia,khiến nó trở thành thành chọn lựa ưu tiên của nông dân

Song song đó, cây mít vẫn có thể mắc một số triệu chứng bệnh thường gặp là do

vi khuẩn và nấm và một số loài tuyến trùng trong đó Pantoea

stewartii subsp. stewartii và Dickeya fangzhongdai là hai tác nhân gây bệnh do vi khuẩn

phổ biến gây ra bệnh thối quả và thối trái mít Một số triệu chứng bệnh do nấm gây ra như

đốm lá, chết cành, thối trái và bệnh hồng do Colletrotichum gloeosporioides,

Phytophthora palmivora và Rhizopus sp Tuy nhiên, trong thời gian gần đây, bệnh đen

xơ đã xuất hiện và gây nguy hại nghiêm trọng tại hầu hết các vùng trồng mít, làm ảnh

Hình 1.1 Pantoea stewartii gây bệnh xơ đen

trên mít

hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây và giảm giá trị thương Tác nhân chủ yếu

được nghiên cứu gây nên triệu chứng bệnh này là vi khuẩn Pantoea Stewartii, xâm nhập

vào trái mít theo nước mưa bằng hai con đường: qua nướm hoa cái mở ra nhận phấn vàkhoảng hở giữa trái đơn Vì vậy, việc xác định các tác nhân gây ra triệu chứng này nhằm

đề ra các giải pháp thích hợp để phòng trừ bệnh hại là vấn đề cấp thiết

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh đen xơ gây hại trên cây mít bằng

phản ứng PCR có sử dụng primer 16S, primer tự thiết kế và primer tham khảo bài báo

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Ly trích DNA Pantoea stewartii từ dịch khuẩn và điện di kiểm tra sự có

mặt DNA có trong mẫu ly trích ban đầu

Nội dung 2: Thực hiện phản ứng PCR vùng 16S rRNA thông qua một cặp mồi đặchiệu cho vùng gen 16S rRNA và điện di có sử dụng ladder

Nội dung 3: Thực hiện phản ứng PCR thông qua cặp primer tự thiết kế đặc hiệu cho

vi khuẩn Pantoea stewartii và điện di có sử dụng ladder kiểm tra sự có mặt của DNA vi

khuẩn

Nội dung 4: Thực hiện phản ứng PCR với cặp primer tham khảo đặc hiệu cho vi

khuẩn Pantoea stewartii và điện di có sử dụng ladder kiểm tra kết quả.

2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về Pantoea stewartii

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm hình thái

Pantoea stewartii subsp. stewartii thuộc bộ Enterobacteriales, họ Erwiniaceae,

chi Pantoea và loài Pantoea stewartii, là một loại vi khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không có roi và hình que thuộc về Gamma-proteobacteria Khuẩn lạc có màu kem, vàng

nhạt đến vàng chanh hoặc vàng cam, phẳng, lồi đến tròn với đường kính 1 – 4 µm.Nguồn gốc từ Hoa Kỳ và được phát tán rộng rãi đến Châu Phi, Bắc Mỹ, Trung Mỹ vàNam Mỹ, Châu Á và Châu Âu Xác định các loài vi khuẩn thông qua hình thái khuẩn lạc

và tế bào, nhuộm Gram và các đặc điểm chuyển hóa và tăng trưởng Trong khi đó, King's

B bổ sung thạch chiết xuất nấm men trong môi trường dinh dưỡng hoặc thạch glucose

peptone nấm men đã được sử dụng làm môi trường chọn lọc để nuôi cấy Pantoea

stewartii subsp. stewartii ở nhiệt độ từ 25 đến 28°C Các xét nghiệm sinh hóa được thực

hiện để xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Các phương pháp phân tử là một

trong những xét nghiệm nhận dạng chính đối với Pantoea stewartii subsp. stewartii Các

phương pháp sử dụng hai phương án thay thế, hoặc là lai tạo tương đồng DNA-DNA đểxác định mối quan hệ của hai vi sinh vật hoặc giải trình tự RNA ribosome 16S (rRNA) đểxác định loài vi khuẩn (Jeger và ctv, 2018; Coplin và ctv, 2002)

2.1.2 Giới thiệu bệnh đen xơ trên cây mít

Bệnh đen xơ mít do vi khuẩn Pantoea stewartii gây ra lần đầu tiên được phát hiện ở

Philippines vào năm 2014 và lan sang Malaysia và Mexico vào năm 2017 Bệnh đen xơxuất hiện quanh năm nhưng tỷ lệ bệnh xuất hiện nhiều và phổ biến trong mùa mưa, nơi

có ẩm độ cao Bên cạnh đó, việc cung cấp thiếu Bo cho cây mít thiếu chất hữu cơ, dinhdưỡng bề mặt dễ bị rửa trôi làm tăng tỷ lệ bệnh trên cây Vi khuẩn xâm nhập vào trái quakhe hở giữa các múi hoặc theo nước mưa vào cửa ngõ là nướm, sau đó đi vào vòi nhụy vàbầu noãn Trái mít bị xơ cứng thường biểu hiện các triệu chứng bất thường về hình thái,màu sắc, gai và cuống Quá trình xơ cứng xuất hiện ở giai đoạn trái, có thể hoạt động lênmột phần hoặc toàn bộ trái Khi bệnh tiến triển, các vết đen xuất hiện giữa phần cứng và múi Cuống trái bệnh thường có màu nâu kéo dài theo chiều dọc của mạch trong cuống Cùi trái khi bệnh sẽ xuất hiện các loại nước màu nâu nhạt ở giai đoạn nhẹ và các loại thủy

lực này sẽ mở rộng, trở nên sống lửa khi bệnh trở nên nguy hiểm Đối với quá trình sảnxuất, trên bề mặt sản xuất các loại mèo nâu đến màu đen có hình dạng và kích thướckhông đều, khi cảm giác giác thô nhanh, dẻo và dẻo Múi trái nhiễm bệnh thường không

có sự khác biệt rõ ràng về màu sắc và mùi vị so với vùng bình thường, nhưng các biểuhiện bệnh lý sẽ rõ ràng hơn trên phần xơ Khi bệnh tiến triển nặng, phần cứng và múi gầnnhau sẽ đóng lại, các dây đai đen mở rộng và rõ ràng trên bề mặt múi, làm giảm giá trị sảnphẩm giá trị của trái Bệnh này thường xảy ra phổ biến hơn trên cây tơ so với cây trưởng thành (Gao và ctv, 2018; Hassan và ctv, 2017; Kumar và ctv, 2019)

2.2 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.2.1 Khái niệm

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 cho phép nhân bản in vitro một đoạn DNA dựa vào cơ chế sao chép DNA trong tự nhiên ở sinh vật Quá trình này được tiến hành khi có sự gắn kết của các trình tự mồi (primer) trên đoạn khuôn, tiếp đó enzyme DNA polymerase bám vào đầu 3' tự docủa mồi và tiến hành tổng hợp nên sợi DNA mới có trình tự bố sung với mạch khuôn,cung cấp enzyme DNA polymerase, các nucleotide tự do (dNTP) và các thành phần khácnhư dung dịch đệm, có thể thực hiện nhân tạo quá trình sao chép DNA trong ống nghiệm Việc sử dụng kỹ thuẩt phân tử PCR đang được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnhhọc

2.2.2 Các bước thực hiện

PCR là một quá trình gồm ba bước được thực hiện theo chu kỳ lặp đi lặp lại Bướcđầu tiên là biến tính (tách hai chuỗi của phân tử DNA) được thực hiện bằng cách nungnóng 4 nguyên liệu ban đầu đến nhiệt độ khoảng 95°C Mỗi sợi là một khuôn mẫu đểtổng hợp một sợi mới Ở bước thứ hai, nhiệt độ được giảm xuống khoảng 62°C để mồi cóthể gắn vào khuôn Ở bước thứ ba, nhiệt độ được nâng lên khoảng 72°C và DNApolymerase bắt đầu thêm nucleotide vào đầu của mồi đã ủ Vào cuối chu kỳ, kéo dàikhoảng năm phút, nhiệt độ tăng lên và quá trình bắt đầu lại Số lượng bản sao tăng gấpđôi sau mỗi chu kỳ Thông thường 25 đến 30 chu kỳ sẽ tạo ra đủ lượng DNA

2.2.3 Ứng dụng

PCR được sử dụng để chẩn đoán bệnh di truyền và phát hiện mức độ nhiễm virusthấp Trong y học pháp y, được sử dụng để phân tích các dấu vết nhỏ của máu và các môkhác nhằm xác định người hiến tặng bằng “dấu vân tay” di truyền của người đó Kỹ thuật

4

này cũng được sử dụng để khuếch đại các đoạn DNA được tìm thấy trong các mô đượcbảo quản

Gelred là liên kết với DNA mạch đôi nó sẽ chèn vào các khoảng trống giữa 2 liên kếthidro, dưới sự tác động của tia UV ta có thể nhìn thấy và thông qua band

Dung dịch đệm tạo điện trường giúp DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương,DNA có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn DNA có kích thước lớn

Thang chuẩn là hỗn hợp nhiều đoạn DNA ngắn có kích thước khác nhau tùy vàoloại sử dụng, tác dụng để so sánh các DNA điện di có khích thước tương đối là bao nhiêu.Ngoài ra ta có thể dựa vào độ sáng mạnh yếu của đoạn DNA so với thang chuẩn mà cóthể suy ra nồng độ tương đối của DNA trong hỗn hợp

Loading dye giúp việc xử lý mẫu DNA hoặc RNA dễ dàng hơn trong quá trình nạpvào gel điện di và theo dõi quá trình chạy gel, giúp người dùng xác định vị trí di chuyểncủa mẫu trên gel trong quá trình chạy điện di

2.3.3 Phương pháp

Khi gel đã ở trong hộp, mỗi mẫu DNA sẽ được bơm cẩn thận vào một trong cácgiếng Một giếng được dành riêng cho thang DNA Tiếp theo, nguồn điện của hộp gelđược bật và dòng điện bắt đầu chạy qua gel Các phân tử DNA có điện tích âm do có cácnhóm photphat, vì vậy khi bật nguồn sẽ có dòng điện chạy qua gel, các DNA bắt đầu dichuyển qua gel về phía cực dương

2.4 Vùng 16S rRNA

Vùng 16S rRNA của vi khuẩn là một phần quan trọng trong cấu trúc ribosome nhỏ(30S), đóng vai trò trong quá trình dịch mã và có sự bảo tồn cao giữa các loài vi khuẩn.Vùng này bao gồm cả các vùng bảo tồn và vùng biến đổi Các vùng bảo tồn có chức năngthiết yếu cho ribosome, vì vậy chúng ít thay đổi qua các loài vi khuẩn, trong khi các vùngbiến đổi lại có sự khác biệt rõ rệt giữa các loài và chi, tạo điều kiện thuận lợi cho việcphân biệt chúng (Woese, 1987) Chính sự biến đổi này làm cho vùng 16S rRNA trởthành công cụ lý tưởng để định danh vi khuẩn, bởi nó cho phép phân biệt chính xác cácloài vi khuẩn dựa trên các khác biệt trong trình tự gen (Weisburg và ctv, 1991) Trình tự16S rRNA có thể được sử dụng để xây dựng các cây phát sinh loài, từ đó hiểu rõ hơn vềmối quan hệ tiến hóa giữa các vi khuẩn (Hugenholtz và ctv, 1998) Phương pháp này đãtrở thành một công cụ quan trọng trong nghiên cứu phân loại vi khuẩn, đặc biệt là trongcác nghiên cứu phân tích gen vi khuẩn nhờ vào khả năng xác định rõ ràng loài vi khuẩnchỉ thông qua việc so sánh trình tự gen (Ludwig và ctv, 2004) Do đó, vùng 16S rRNA làmột phần lý tưởng cho việc định danh vi khuẩn, đặc biệt là khi các phương pháp nuôi cấytruyền thống chưa thể phân biệt được chúng

6

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian từ 16/10/2024 đến 13/11/2024

Địa điểm: Phòng 304 Bệnh học và Chẩn đoán, Viện nghiên cứu công nghệ Sinh học

và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu và thiết bị

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu vi khuẩn được phân lập từ mẫu bệnh, dựa trên các đặc điểm hình thái nghi ngờ

là Pantoea stewartii tiến hành ly trích và thực hiện phàn ứng PCR để xác định tác nhân

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Ly trích vi khuẩn đã phân lập gây bệnh xơ đen trên mít

Tiến hành ly trích DNA vi khuẩn bằng Lysis buffer:

Bước 1: Thu cặn khuẩn Hút 1 ml dịch tăng sinh khuẩn vào tube 1,5 ml Ly tâm

10000 vòng/3 phút Sau đó loại bỏ dịch nổi Lặp lại tương tự 2 lần

Bước 2: Thêm vào dịch 400 µl STE nhằm loại bỏ một số chất tan trong tube vàvortex đều Sau đó ly tâm 10000 vòng/3 phút Lặp lại tương tự 2 lần

Bước 3: Thêm vào 400 µl Lysis bufer và vortex đều Ủ ở 65oC trong 1 giờ

Bước 4: Thêm 300 µl CI để kéo tạp chất xuống đáy tube, sau đó đảo đều Ly tâm

Bước 7: Rửa tủa bằng 480 µl Ethanol 70% Ly tâm 13000 vòng/ 10 phút Tiến hànhloại bỏ dịch nổi và để cặn khô tự nhiên.

Bước 8: Thêm 50 µl dung dịch TE buffer và Elution buffer nhằm làm tan và giúp bảoquản DNA Bảo quản ở -20 oC

3.3.2 Điện di (kiểm tra DNA tổng số)

Điện di DNA để kiểm tra độ tinh sạch của DNA và quan sát đánh giá nồng độ DNAthông qua độ sáng, kích thước band để đánh giá có pha loãng nồng độ DNA Nồng độDNA quá cao ảnh hưởng việc thực hiện phản ứng PCR có thể làm ức chế phản ứng.Bước 1: Chuẩn bị 30 ml gel agarose 1%, cho 0,3 g agarose vào 30 ml dung dịch TBE0,5X đun hỗn hợp trên trong lò vi sóng cho tới khi agarose tan hoàn toàn

Bước 2: Đổ gel vào khuôn đã được đặt lược vào trước, đợi gel đông Chuyển miếnggel vào bồn điện di (đã chuẩn bị sẵn một lượng TBE Buffer 0,5X đủ ngập miếng gel).Bước 3: Vortex mẫu DNA, dùng micropipette hút 1 µl gelred, 3 µl mẫu, 0,5 μlloading dye Mix đều hỗn hợp bằng micropipette và bơm vào giếng đã chuẩn bị sẵn Tiếnhành điện di ở hiệu điện thế 100 V trong 25 phút Đọc và chụp kết quả dưới tia UV Kíchthước sản phẩm nằm khoảng 1200 – 1500 bp

3.3.3 Thực hiện phản ứng PCR ở vùng 16S rRNA

Bước 1: Pha loang mẫu DNA gốc bằng H2O không chứa Dnase nếu mẫu khi điện

di tổng số có band quá sáng (nồng độ DNA cao tiến hành pha loãng để giảm tình trạng ứcchế phản ứng PCR) Mẫu 2 pha loãng hai lần: 25 μl H2O và 25 μl DNA

Bước 2: Hút 5,9 μl H2O vào tube 0,5 ml Tiếp theo cho 0,1 μl Taq polymerase, sau đócho lần lượt Primer 63F và 1489R với thể tích mỗi loại là 0,8 μl, 1 μl DNA và 2 μl buffer.Mix đều hỗn hợp (tránh tạo bọt trong tube) Bổ sung đối chứng âm (nước) với mục tiêukiểm tra thao tác và kiểm tra hóa chất sử dụng

Bước 3: Cho vào máy PCR để tiến hành chạy phản ứng theo nhiệt độ và chu kì theoBảng 3.1 và Bảng 3.2 Sau khi chạy PCR 16S xong, tiếp tục kiểm tra kết quả PCR bằng

phương pháp điện di.

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR với cặp primer 16S rRNA

Thành phần Thể tích (µl)Frimer forward (63F) 0,5Primer reverse (1489R) 0,5

8