th vstyh nhóm 2 sáng thứ 3

Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong kiểm tra DNA tổng số .... Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 16S .... Thiết bị, dụng cụ và hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

THỰC HÀNH VI SINH TRONG Y HỌC

Ngành học Chuyên ngành Nhóm thực hiện Niên khóa

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC : CÔNG NGHỆ SINH HỌC : NHÓM 2 SÁNG THỨ 3 : 2021 – 2025

TP Thủ Đức, 05/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

THỰC HÀNH VI SINH TRONG Y HỌC

PGS TS NGUYỄN BẢO QUỐC

TP Thủ Đức, 05/2024

NGUYỄN LƯU VĨNH HẢO MSSV: 21126333

PHẠM THỊ MỸ HẠNH MSSV: 21126054

LÝ GIA HÂN MSSV: 21126325 NGUYỄN NHẬT HÒA MSSV: 21126347

i

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu thực hiện 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về phương pháp 2

2.1.1 Phản ứng PCR 2

2.1.2 Điện di 2

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Salmonella 3

2.2.1 Vị trí phân loại 3

2.2.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của Salmonella 3

2.2.3 Bệnh có tác nhân từ Salmonella 4

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 5

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 5

3.2 Vật liệu 5

3.3 Phương pháp nghiên cứu 6

3.3.1 Nội dung 1: Kiểm tra DNA tổng số bằng phương pháp điện di 6

3.3.2 Nội dung 2: Kiểm tra sản phẩm PCR 7

3.3.3 Nội dung 3: Kiểm tra sự hiện diện của DNA Salmonella trong mẫu 8

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 9

4.1 Kết quả 9

4.1.1 Kiểm tra DNA tổng số bằng phương pháp điện di 9

4.1.2 Kiểm tra sản phẩm PCR 9

4.1.3 Kiểm tra sự hiện diện của DNA Salmonella trong mẫu 10

4.2 Thảo luận 10

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 11

ii

5.1 Kết luận 11 5.2 Đề nghị 11 TÀI LIỆU THAM KHẢO 12

iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong kiểm tra DNA tổng số 5 Bảng 3.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng

cặp mồi 16S 5

Bảng 3.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong kiểm tra sự hiện diện của DNA

Samonella trong mẫu 6

iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu tạo của phân tử DNA 3

Hình 2.2 Vi khuẩn Salmonella 3

Hình 3.1 Vortex mẫu 6

Hình 3.2 Bơm mẫu vào giếng 7

Hình 4.1 Kết quả chạy điện di mẫu DNA tổng số 9

Hình 4.2 Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR sau khi khuếch đại với mồi 16S 9

Hình 4.3 Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR sau khi khuếch đại với mồi chuyên biệt cho Salmonella 10

1

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Salmonella là một trong những vi khuẩn được biết đến với khả năng gây các bệnh

như thương hàn, nhiễm trùng máu và đặc biệt là ngộ độc thực phẩm Hằng năm, số lượng

bệnh nhân nhập viện và tử vong vì thực phẩm nhiễm Salmonella là vô cùng lớn Ở Việt

Nam, vào ngày 14 tháng 10 năm 2015 tại thành phố Đồng Hới, gần 250 người phải nhập

viện vì ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn Salmonella

Từ thực trạng nêu trên, chúng ta cần có các biện pháp sàng lọc các thực phẩm trước khi đưa tới tay khách hàng Chính vì vậy, các thử nghiệm được đưa ra nhằm kiểm tra,

phân tích để nhằm phát hiện Salmonella

1.2 Mục tiêu thực hiện

Nhằm kiểm tra phát hiện DNA của Salmonella từ mẫu DNA đã có

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Kiểm tra DNA tổng số bằng phương pháp điện di

Nội dung 2: Kiểm tra sản phẩm PCR

Nội dung 3: Kiểm tra sự hiện diện của DNA Salmonella trong mẫu

2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về phương pháp

2.1.1 Phản ứng PCR

Kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) là một kỹ thuật hiệu quả trong sinh học phân tử được dùng để nhân các đoạn DNA mục tiêu lên hàng đến triệu hoặc thậm chí hàng tỷ bản sao Điều này có thể giúp các nhà khoa học về các nghiên cứu gen hoặc các trình từ DNA

Các bước cơ bản của PCR:

Bước 1 ly trích DNA - bước đầu ly trích DNA mục tiêu từ mẫu tế bào, mẫu mô hoặc thậm chí là mẫu hoá thạch

Bước 2 thiết kế primer đặc hiệu cho trình tự gen mục tiêu – cặp primer xuôi vào ngược có trình từ đặc hiệu cho đoạn DNA mục tiêu được thiết kể kiểm tra bằng các phần mềm sinh tinh, tối ưu nhiệt độ nồng độ hoặc được tham khảo từ các bài báo trước đó Bước 3 chuẩn bị phản ứng – bao gồm các thành phần cơ bản như DNA mục tiêu, nước, enzyme polymerase, buffer, dNTP, MgCl2, cặp primer

Bước 4 thiết kế chu trình nhiệt độ phản ứng – gồm các bước tiền biến tinh, biến tình, bắt cặp, kéo dài, hậu kéo dài, bảo quản Bước 5 đọc kết quả và xử lý thông tin – sản phẩm PCR sẽ đọc kết quả dựa trên các kỹ thuật điện di trên gel agarose

Nhờ khả năng đặc hiệu, nhân nhanh số lượng lớn DNA, liên tục mà kỹ thuật PCR được sử dụng rộng rãi Các ứng dụng của kỹ thuật PCR được phát triển rộng rãi như: chọn giống cây trồng và vật nuôi; chẩn đoán sớm các bệnh về di truyền; chẩn đoán, phát hiện mẫu chứa vi khuẩn hoặc virus; hỗ trợ nghiên cứu về metagenomic hệ vi sinh vật trong ruột người,

2.1.2 Điện di

Điện di ngang trên gel agarose (Agarose gel electrophoresis) là kỹ thuật được sử dụng chủ yếu để phân tách DNA trong mẫu dựa trên kích thước, kỹ thuật này cũng được

sử dụng để phân tách RNA hoặc protein

Phân tử DNA được cấu tạo từ các nucleobase được nối với nhau bởi khung sườn (backbone) từ đường dideoxybose và một nhóm phosphate Theo cấu trúc này, mỗi một

3

nucleotide sẽ đều mang điện tích âm, điều này khiến DNA có điện tích âm tỷ lệ thuận với khối lượng (mass-to-charge) Do DNA có điện tích âm, việc sử dụng điện trường có thể khiến DNA di chuyển về phía điện cực dương

Hình 2.1 Cấu tạo của phân tử DNA

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Salmonella

2.2.1 Vị trí phân loại

Về phân loại khoa học Salmonella được xếp vào:

Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gramma Proteobacteria

Bộ: Enterobacteriaceae

Giống: Salmonella

Hình 2.2 Vi khuẩn Samonella 2.2.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của Salmonella

Salmonella là trực khuẩn Gram âm, có kích thước trung bình từ 2-3 x 0,5-1 µm, di

chuyển bằng tiêm mao trừ S gallimarum và S pullorum, và không tạo bào tử

Salmonella có ba loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể sẽ tạo

ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiện với những sản phẩm của sự kích thích đó (gồm: kháng nguyên thân P, kháng nguyên lông H và kháng nguyên vỏ K)

Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển được trên những môi trường

4

nuôi cấy thông thường Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ Có thể mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate), trong đó môi trường XLD ít chất ức chế

hơn nên thường được dùng để phân lập Salmonella Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella

trên môi trường này là tròn, lồi, trong suốt, có tâm den, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường chuyển sang màu đỏ Salmonella phát triên tốt ở nhiệt độ 6oC –

42oC, thích hợp nhất ở 35oC – 37oC, pH từ 6 – 9 và thích hợp nhất ở pH = 7,2 Salmonella

không lên men lactose, lên men đường glucose và sinh hơi Thường không lên men sucrose, salicin và inositol, sử dụng được citrate ở môn trường Simmons

2.2.3 Bệnh có tác nhân từ Salmonella

Các chủng vi khuẩn Salmonella gây ra các bệnh như thương hàn (do Salmonella

typhi), phó thương hàn, nhiễm trùng máu (do Salmonella choleraesuis) và ngộ độc thực

phẩm (Salmonellosis) Các triệu chứng do Salmonella gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12 - 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella

Các triệu chứng thường kéo dài từ 2 - 7 ngày

5

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện từ ngày 01/04/2024 đến ngày 07/05/2024 tại phòng thí nghiệm Bệnh học phân tử và Chẩn đoán Ribe 304-306 – Tòa A1, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

Bảng 3.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong kiểm tra DNA tổng số

Bảng 3.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng

cặp mồi 16S

Agarose 1%

TBE 0,5X

Larder

6

Bảng 3.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong kiểm tra sự hiện diện của DNA

Samonella trong mẫu

Agarose 1%

TBE 0,5X

Larder

Đối chứng dương

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nội dung 1: Kiểm tra DNA tổng số bằng phương pháp điện di

a, Quy trình đổ gel

Bước 1: Chuẩn bị gel Agarose 1% gồm: 35ml dung dịch TBE, 0,35g Agarose Đun

hỗ hợp trong Microwave cho tới khi tan hoàn toàn

Bước 2: Để nguội hỗn hợp cho đến nhiệt độ khoảng 60C, sau đó đổ vào khuôn đã đặt lược và đợi đến khi miếng gel đông hoàn toàn

b, Quy trình điện di

Bước 1: Vortex mẫu DNA

Hình 3.1 Vortex mẫu

7

Bước 2: Trộn 3μL mẫu DNA, 0,5μL Loading dye với 1 GelRed Bơm hỗn hợp trên vào giếng

Hình 3.2 Bơm mẫu vào giếng

Bước 3: Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút

Bước 4: Bỏ vào buồng UV và đọc kết quả

3.3.2 Nội dung 2: Kiểm tra sản phẩm PCR

Bước 1: Cho lần lượt các thành phần sau vào tube:

Bước 2: Mix đều mẫu và cho vào máy PCR và chạy theo chương trình

8

35

Bước 3: Rã đông và vortex mẫu

Bước 4: Đổ gel như quy trình trước đó Chuẩn bị mẫu bao gồm 1 μL GelRed và

4 μL sp PCR mix đều và bơm vào giếng Ngoài ra chuẩn bị đối chứng âm (1 μL GelRed

và 4 μL nước) Đối chứng âm để kiểm tra sự ổn định của hoá chất vfa thao tác…

Bước 5: Đậy nắp bồn ủ và tiến hành điẹn di trong 25 phút

Bước 6: Bỏ vào buồng UV, tiến hành đọc kết quả

3.3.3 Nội dung 3: Kiểm tra sự hiện diện của DNA Salmonella trong mẫu

Bước 1: Tiến hành rã đông mẫu và chạy PCR như các bước trên Và thiết lập chương trình PCR như sau:

Giai đoạn Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Số chu kì

30

Bước 2: Tiền hành đổ gel và cho gel vào bồn điện di

Bước 3: Tiến hành trộn mẫu bao gồm 1μL GelRed và 4μL DNA mẫu mix đều mẫu và bơm vào giếng

Bước 4: Tiến hành điện di và chụp kết quả

9

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Kiểm tra DNA tổng số bằng phương pháp điện di

Hình 4.1 Kết quả chạy điện di mẫu DNA tổng số

Hình ảnh có sự xuất hiện các band sáng chạy trong gel agarose ở mẫu Q4, cho thấy mẫu có sự hiện diện của DNA sinh vật Tiếp tục thực hiện PCR với cặp primer 16S

để kiểm tra sinh vật trong mẫu có phải là vi khuẩn không

4.1.2 Kiểm tra sản phẩm PCR

Hình 4.2 Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR sau

khi khuếch đại với mồi 16S

Đối chứng âm có xuất hiện chấm nhỏ ở vị trí gần band 1500bp, điều này có thể do quá trình bơm mẫu vào giếng đã làm cho giếng đối chứng âm bị nhiễm chéo Vì vệt sáng

ở đối chứng âm vô cùng nhỏ nên khả năng mẫu bị nhiễm là không cao Nên kết quả chạy điện di này đáng tin cậy

ĐC(-)

10

Hình ảnh cho thấy mẫu xuất hiện band ở khoảng 1500bp, chứng tỏ mẫu Q4 là DNA của vi khuẩn Từ đó tiếp tục tiến hành kiểm tra nhằm xác định mẫu có phải là DNA của

Salmonella không

4.1.3 Kiểm tra sự hiện diện của DNA của Salmonella trong mẫu

Hình 4.3 Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR sau khi

khuếch đại với mồi chuyên biệt cho Salmonella

Đối chứng âm: không có bất kì vệt sáng nào, kết quả đối chứng âm cho thấy quá trình thực hiện không nhiễm chéo giữa các mẫu Vậy kết quả điện di là đáng tin cậy Hình ảnh cho kết quả mẫu chạy điện di có vị trí band tương đồng với band của đối

chứng dương Chưng tỏ mẫu Q4 có sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella

4.2 Thảo luận

Qua quá trình khuếch đại PCR với 2 cặp mồi (16S và mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Salmonella) và chạy điện di sản phẩm đã xác nhận mẫu Q4 có sự hiện diện của vi khuẩn

Salmonella

Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR cho các band còn mờ Nguyên nhân do trong

quá trình thực hiện điện di, lượng mẫu bơm vào giếng chưa đủ Bên cạnh đó, lượng mẫu quá nhiều cũng dẫn đến ức chế và giảm khả năng bắt cặp mồi trong quá trình khuyếch đại PCR

11

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận

Các thí nghiệm được tiến hành đã cơ bản kiểm tra được sự hiện diện của Samonella

đáp ứng được mục tiêu đã đề ra

5.2 Đề nghị

Cần cải thiện các thao tác với mẫu để đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong kết quả kiểm tra

12

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1 https://genesmart.vn/vi/ky-thuat-dien-di-ngang-tren-gel-agarose/

2 Nguyễn Hữu Liêm (2010) Tìm hiểu về vi khuẩn Salmonella Khóa luận tốt

nghiệp Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, Đại học Kỹ thuật Công Nghệ

Tp Hồ Chí Minh