Nhóm 4 chẩn Đoán bệnh tv thứ 5 ca 3

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ CHẨN ĐOÁN BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY DÂU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

CHẨN ĐOÁN BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY DÂU TÂY DO

VI KHUẨN Colletotrichum acutatum BẰNG RT-PCR

Nhóm sinh viên thực hiện : Nhóm 4 – Nhóm tổ hợp 02

TP Thủ Đức, 12/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

CHẨN ĐOÁN BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY DÂU TÂY DO

VI KHUẨN Colletotrichum acutatum BẰNG RT-PCR

Nhóm sinh viên thực hiện : Lê Thị Thùy Trang 21126550

Nguyễn Thị Bảo Trân 21126548 Châu Nguyên Huyền Trân 21126546 Nguyễn Đinh Bảo Trân 21126547

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH BẢNG ii

DANH SÁCH HÌNH iii

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Cây dâu tây và ảnh hưởng của nó đến với nông sản Việt Nam 2

2.2 Giới thiệu về nấm colletotrichum 2

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

3.1 Vật liệu 4

3.2 Phương pháp 4

3.2.1 Chiết DNA từ sợi nấm 4

3.2.2 Thiết kế mồi PCR 5

3.2.3 Phản ứng PCR 5

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 6

4.1 Thiết kế mồi đặc hiệu loài C acutatum 6

4.2 Sự khuếch đại của đoạn đặc hiệu C acutatum từ dâu tây bị nhiễm 7

TÀI LIỆU THAM KHẢO 11

DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1 Phân lập Colletotrichum được sử dụng trong điều tra hiện tại 6

DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Dâu tây 2

Hình 2.2 Mặt trên và mặt sau của các khuẩn lạc và bào tử nấm 7 ngày tuổi của các phân

lập Colletotrichum được thu thập từ cây họ cam chanh ở Tây Úc 3

Hình 4.1 Sự liên kết của CaInt2 với các vùng tương tự trong trình tự ITS1 của

Colletotrichum spp 7

Hình 4.2 Khuếch đại một mảnh cụ thể từ DNA nấm bằng cách sử dụng mồi mục tiêu

CaInt2 và ITS4 8

Hình 4.3 (a) Khuếch đại một mảnh từ mô dâu tây bị nhiễm C acutatum bằng CaInt2 và

ITS4, và (b) Phân tích lai miền Nam của mảnh 9

Hình 4.4 Độ nhạy của việc phát hiện PCR của C acutatum trong mô dâu tây 9

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong nền kinh tế đang trên đà phát triển của đất nước hiện nay, nông nghiệp góp phần phát triển của kinh tế, Đà Lạt nổi tiếng với khí hậu mát mẻ và đất đai màu mỡ, là một trong những trung tâm nông nghiệp quan trọng của Việt Nam Nông nghiệp ở Đà Lạt chủ yếu chuyên về trồng cây ăn quả như cam, dâu tây, dâu đào, và các loại cây công nghiệp như chè, cà phê, và trà Ngoài ra, Đà Lạt còn nổi tiếng với các loại cây trồng lạnh như dâu tây, dâu đào, và các loại cây hoa như hoa anh đào, hoa hồng

Nông nghiệp ở Đà Lạt không chỉ giúp địa phương phát triển kinh tế mà còn góp phần vào việc bảo vệ môi trường và duy trì sự cân bằng sinh thái Các nông trại thường

áp dụng các phương pháp canh tác bền vững và sử dụng hóa chất hạn chế để bảo vệ cây trồng và môi trường

Hiện tại, sản xuất dâu tây tại Đà Lạt đang phát triển mạnh mẽ, với nhiều nông trại

và nhà sản xuất chuyên nghiệp hóa quy trình sản xuất để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường trong và ngoài nước

Dâu tây Đà Lạt được biết đến với chất lượng cao, đặc biệt là các loại dâu tây trồng theo phương pháp hữu cơ, không chất lỏng hóa Điều này đã giúp sản phẩm này thu hút

sự quan tâm của người tiêu dùng cả trong và ngoài nước

Sản xuất dâu tây tại Đà Lạt gặp nhiều trở ngại do các bệnh tật phổ biến, bao gồm các bệnh như:

bệnh vết đốm đen, bệnh vết đốm lá, bệnh nấm đỉnh, bệnh vết đốm lá, Như được

biết bệnh vết đốm đen gây ra bởi vi khuẩn Colletotrichum acutatum, bệnh này ảnh

hưởng nặng nề đến cả quả dâu non và quả chín, gây ra vết đốm đen trên quả và lá

1.2 Mục tiêu

Thiết kế mồi đặc hiệu loài Colletotrichum acutatum trên dâu tây tại Đà Lạt, Việt

Nam

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cây dâu tây và ảnh hưởng của nó đến với nông sản Việt Nam

Cây dâu tây (Fragaria x ananassa) là một loại cây trồng thuộc họ hoa hồng (Rosaceae), nổi bật với quả mọng nước, hương thơm ngon và giá trị dinh dưỡng cao Dâu tây không được biết đến như một loại trái cây giàu vitamin C, chất chống oxy hóa, mà còn là cây trồng mang lại giá trị kinh tế lớn cho nông nghiệp Việt Nam

2.2 Giới thiệu về nấm colletotrichum

Colletotrichum sp là một loại nấm gây bệnh phổ biến trên nhiều loại cây trồng,

bao gồm cả cây dâu Tây ( Fragaria × ananassa )

Bệnh do nấm Colletotrichum sp gây hiếm thường được gọi là bệnh thư , một loại

bệnh quan trọng làm giảm năng suất và chất lượng của cây dâu tây

Đặc điểm sinh học của nấm:

Tên khoa học: Các loài thường gặp trên dâu Tây là Colletotrichum acutatum,

Colletotrichum gloeosporioides và Colletotrichum fragariae.

Hình thái:

Nguyên tạo ra bào tử đơn bào hình giáo dục hoặc hình thoi, dễ dàng phát tán qua nước, gió, và côn trùng

Hình 2.1 Dâu tây.

Nguồn: Thiên Hà WTO Tổng Hợp.

Trên môi trường nuôi cấy, nấm thường tạo ra ra khu dân cư lạc màu cam hoặc hồng nhạt

Chu kỳ phát triển:

Nấm tồn tại dưới dạng bào tử và sợi nấm trên tàn dư cây trồng, đất, và các vật liệu

bị nhiễm bệnh

Điều kiện thuận lợi cho sự phát triển là nhiệt độ từ 20–30°C, độ ẩm cao (>90%)

Hình 2.2 Mặt trên và mặt sau của các khuẩn lạc và bào tử nấm 7 ngày tuổi của các

phân lập Colletotrichum được thu thập từ cây họ cam chanh ở Tây Úc (a–c) Phân lập C gloeosporioides VPRI 44140 (d–f) Phân lập C gloeosporioides VPRI 44145 (g–i) Phân lập C kar

Nguồn: Plant Pathology

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu

Mẫu nấm Colletotrichum acutatum được phân lập từ vết bệnh thán thư trên lá và

quả dâu tây thu thập từ vườn dâu tây thuộc thành phố Đà Lạt

Từ sợi nấm được phân lập trong môi trường lỏng axit casamino glucose và DNA được chiết xuất từ bột sợi nấm đông khô

3.2 Phương pháp

3.2.1 Chiết DNA từ sợi nấm

Lá từ cây dâu tây bị nhiễm C acutatum được đông khô sau khi đông lạnh trong

chất lỏng N2 trong 15–20 phút Vật liệu đông khô được nghiền thành bột mịn bằng cối và chày Đối với 50 mg bột khô trong ống Eppendorf 2 mL được thêm 1 mL dung dịch 2 CTAB (chứa 0,4% (vol./vol.) 2-mercaptoethanol và 0.5 mmol L-1 natri bisulfit) Sau khi trộn kỹ và thêm 100 L chloroform: octanol (24: 1), hỗn hợp được ủ trong nồi cách thủy ở

65oC trong 30 phút với thỉnh thoảng trộn nhẹ

Ngoài ra, 100 mg mô lá tươi bị nhiễm bệnh được nghiền trong một thể tích nhỏ N

2 lỏng bằng cách sử dụng cối và chày đã khô kỹ Trước khi mô rã đông, 1 mL 2 dung dịch CTAB (chứa 2-mercaptoethanol và natri bisulfite, như trên) được thêm vào với sự trộn nhẹ Hỗn dịch được trộn nhẹ với 100 L chloroform: octanol (24:1) trong ống Eppendorf

2 mL sau đó ủ trong nồi cách thủy ở 65oC trong 30 phút với thỉnh thoảng trộn nhẹ

Các mẫu của các chiết xuất này được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và xử lý như sau Đủ chloroform: octanol (24:1) được thêm vào để gần lấp đầy ống Eppendorf và một nhũ tương được hình thành bằng cách trộn mạnh Các pha nước và hữu cơ được tách ra ở

7000 g trong 10 phút Pha nước trên được chuyển sang ống Eppendorf 2 mL sạch DNA

được kết tủa với 2 thể tích lạnh 95% ethanol DNA được cuộn ra khỏi dung dịch và chuyển sang một ống Eppendorf 2 mL khác có chứa 1,5 mL 0,2 mol L-1 natri axetat trong

etanol 76% (thể tích/thể tích) sau đó rửa trong 5 phút và ép viên ở 7000g trong 2 phút.

Phần nổi trên được loại bỏ càng kỹ càng tốt mà không để DNA khô DNA được hòa tan trong 100 – 200 L TE (pH 8,0), 25 L (1 mg mL-1 dung dịch gốc) RNase được thêm vào và

ủ ở 37℃ trong 30 phút Phenol trung tính (0.66 tập.) được thêm vào, xoáy trong 10 giây

và ly tâm ở 7000 g trong 2 phút Lớp nước trên được loại bỏ và quy trình với phenol trung

tính được lặp lại một lần Pha nước được chuyển sang một ống sạch, 0,66 lượng ete bão

hòa nước được thêm vào, trộn đều trong 10 giây và ly tâm ở 7000 g trong 2 phút Lớp

ether đã được loại bỏ triệt để nhất có thể Pha nước được giữ ở 55℃ trong 15 phút sau đó chuyển sang ống Eppendorf 2 mL sạch DNA được kết tủa với 2 vol rượu tuyệt đối lạnh

và tạo viên bằng cách ly tâm ở 7000 g trong 5 phút Phần nổi trên được loại bỏ và DNA

được rửa hai lần bằng ethanol 70% (thể tích/thể tích) Sau khi loại bỏ etanol, DNA được làm khô và hòa tan trong 50 – 100 L TE (pH 8,0)

Giao thức tương tự đã được sử dụng để chiết xuất DNA từ mô quả dâu tây bị thối

rữa bởi C acutatum DNA từ các mô dâu tây không bị nhiễm bệnh được sử dụng làm đối

chứng

3.2.2 Thiết kế mồi PCR

Trình tự nucleotide ITS 1 của C acutatum phân lập 397 và NI90 được đặc trưng trước đó, C gloeosporioides cô lập 231, C fragariae cô lập 163–1 (Sreenivasaprasad et

al 1992; Sreenivasaprasad et al 1994) và các phân lập của C coccodes, C dematium,

C trichellum, C graminicola và C linicola (Sreenivasaprasad et al 1996) (Bảng 4.1)

được căn chỉnh và phân tích bằng cách sử dụng gói CLUSTAL V (Higgins et al.,1992).

3.2.3 Phản ứng PCR

Các đoạn mồi ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG), ITS2

(GCTGCGTTCTTCATCGATGC), ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) và C.

acutatum từ vùng ITS1 (CaInt1 và CaInt2) được cung cấp bởi Operon Technologies Inc (CA, Hoa Kỳ) Phản ứng PCR (100 µL) được thực hiện với mồi ITS1 / ITS2 và mồi đặc

thù loài / ITS4 Hỗn hợp PCR chứa DNA bộ gen (40–50 ng), dung dịch đệm phản ứng,

200 mol L-1 của mỗi dNTP, 0,5 mol L-1 mỗi đoạn mồi ITS1 và ITS2 hoặc đoạn mồi đặc trưng cho loài và ITS4 và 2,5 đơn vị Taq DNA polymerase, và được trải qua 30 chu kỳ 1,5 phút ở 94oC, 2 phút ở 55oC và 3 phút ở 72oC

Sau khi điện di, các sản phẩm PCR được tạo ra với các đoạn mồi được chuyển đến màng nylon bằng phương pháp mao quản chuyển giao (Sambrook et al 1989) Một đầu

dò, được dán nhãn với [α-32P]deoxy-adenosine 5’-triphosphate (Amer sham) sử dụng hệ

4.1 Thiết kế mồi đặc hiệu loài C acutatum

Bảng 4.1 Phân lập Colletotrichum được sử dụng trong điều tra hiện tại

Trình tự nucleotide của đơn vị lặp lại ribosome vùng ITS1 của các phân lập tham

chiếu C acutatum 397 và NI90 được căn chỉnh với cùng một vùng từ các giống

Colletotrichum khác Các vùng thích hợp đã được chọn để thiết kế các mồi dành riêng

cho loài Primer CaInt1 (20 bazơ) từ phân lập 397 (50CCGGCCCCCACGGGGAC-30) c

ó bốn điểm khác biệt bazơ so với cùng một vùng của cô lập NI90 (50 * GT

G 30) Primer CaInt1 và primer ITS4 (từ vùng bảo tồn của gen rRNA 25/28) đã được

sử dụng trong PCR với DNA bộ gen từ một loạt các chủng phân lập C acutatum từ dâu tây và các vật chủ khác (Sreenivasaprasad et al., 1992, 1994) và các chủng phân lập của

Colletotrichum spp Ở nhiệt độ ủ 45–55oC, một mảnh đã được khuếch đại tốt từ nhóm

phân lập C acutatum 397 nhưng sự khuếch đại chỉ tốt vừa phải với DNA từ nhóm NI90

và các sản phẩm không đặc hiệu của 1,0 kb trở lên được tạo ra với DNA từ một số

lập

EMBL ITS1

C acutatum 397 Fragaria x ananassa Z32915

C acutatum NI90 Fragaria x ananassa Z32928

C acutatum 493/88 Fragaria x ananassa Z32916

C acutatum 615/91.414 Fragaria x ananassa Z32925

C acutatum 616/91.414 Fragaria x ananassa Z32926

C acutatum 534/90.368 Ceanothus sp. Z32918

C acutatum 602/91.326 Phormium sp. Z32924

C acutatum 495/17729 Lupinus sp. Z32917

C acutatum 547/90.410 Lupinus sp. Z32921

C acutatum 549 Lupinus sp. Z32922

C coccodes 527.77 Lycopersicon esculentum Z32930

C dematium 288810 Dianthus sp. Z32938

C fragariae 63-1 Fragaria x ananassa Z32943

C gloeosporioides 561 Fragaria x ananassa Z32961

C graminicola 84032 Zea mays Z32981

C Linicola 172.51 Linum usitatissimum Z32984

C trichellum 180.52 Hedera sp. Z33000

Colletotrichum spp khác Ở 65oC, phản ứng không đặc hiệu ngừng nhưng CaInt1 sau đó

không thể khuếch đại nhóm NI90

Mồi thứ hai CaInt2 (GGGGAAGCCTCTCGCGG) từ vùng ITS1 của cô lập 397

chỉ có một sự khác biệt bazơ so với cô lập NI90 (Hình 1) và kết hợp với mồi ITS4, một đoạn 490 bp được khuếch đại tốt như nhau (ở quá trình ủ 55℃) với DNA từ tất cả các

phân lập C acutatum được thử nghiệm (Hình 4.2) Mồi đặc hiệu cho C acutatum; không

có sản phẩm khuếch đại nào thu được với DNA bộ gen từ Colletotrichum spp khác DNA

bộ gen của tất cả các phân lập được sử dụng trong xét nghiệm này giống như DNA được

sử dụng để tạo ra trình tự nucleotide ITS1 và được khuếch đại thành công với các mồi phổ quát ITS1 / ITS2 (dữ liệu không được hiển thị)

4.2 Sự

khuếch đại của đoạn đặc hiệu C acutatum từ dâu tây bị nhiễm

Một sản phẩm có kích thước giống hệt với sản phẩm được khuếch đại từ DNA

nấm đã được tạo ra khi mồi CaInt2 và ITS4 được sử dụng trong PCR với tổng DNA được chiết xuất từ lá dâu tây bị nhiễm bệnh với C acutatum và từ quả đốm đen (Hình 4.3a).

Dải mờ < 300 bp có thể được nhìn thấy ở làn 2 (Hình 3a) có lẽ là kết quả của sự khuếch đại không đặc hiệu trong hỗn hợp phản ứng có chứa một lượng tương đối lớn DNA bộ

Hình 4.1 Sự liên kết của CaInt2 với các vùng tương tự trong trình tự ITS1 của

Colletotrichum spp -, cho biết trình tự đồng nhất với C acutatum *, biểu thị khoảng trống

được đưa vào

C acutatum (397, CaInt2) G G G G * * * A A G C C T C T C G C G G

C acutatum (NI90) – – – – * * * – – – T – –

C Linicola – – A – G A C – – C – C – C – T – – –

C graminicola A – – – G T C * C – – – – – – – C G – –

C mã cầu – – – – G * * * * * T G C – G – C T – C

C trichellum – – A – * * * * * * * * T C – C – C – – – –

C dematium – – – – G * * * * * T * C – C – T – – – –

C gloeosporioides – – * * * * * * * gt – tc – * * * * * * –

C fragariae – – * * * * * * * G T – – C – * * * * * * –

ra của phương pháp phát hiện này là CaInt2 có thể phát hiện các nhân giống không tồn tại cũng như khả thi của C acutatum Để chắc chắn chỉ phát hiện các nhân giống khả thi, cần

phải phát triển một giao thức cụ thể dựa trên RNA

Các pha loãng nối tiếp của một lượng DNA bộ gen C acutatum đã biết đã được sử

dụng làm khuôn mẫu để đánh giá độ nhạy của việc phát hiện PCR Khuếch đại thành công, với một sản phẩm có thể nhìn thấy rõ ràng trên gel agarose nhuộm ethidium bromide đã đạt được xuống 100 fg DNA nấm (Hình 4.4a) Tương tự, quá trình khuếch đại PCR của các pha loãng nối tiếp của một lượng DNA dâu tây bị nhiễm bệnh đã được thực hiện (Hình 4.4b) So sánh các sản phẩm khuếch đại từ loạt pha loãng này chỉ ra rằng khoảng 100 fg DNA nấm có thể được phát hiện trong khoảng 2,5 ng tổng số DNA được chiết xuất từ mô dâu tây Các ước tính thô, dựa trên năng suất DNA từ sợi nấm, cho thấy

100 fg DNA có thể đại diện cho ít nhất 1 ng sợi nấm

Việc phát hiện thành công C acutatum trong mô dâu tây phụ thuộc vào phương

pháp chiết xuất DNA Một số phương pháp đã được sử dụng để tạo ra DNA không thể khuếch đại

Hình 4.2 Khuếch đại một mảnh cụ thể từ DNA nấm bằng cách sử dụng

mồi mục tiêu CaInt2 và ITS4 (A, C acutatum; B, C linicola; C, C.

graminicola; D, C coccodes; E, C trichellum; F, C dematium; G, C.

gloeosporioides; và H, C fragariae) M, pGEM tiêu hóa được sử dụng

làm dấu hiệu kích thước phân tử

Hình 4.3 (a) Khuếch đại một mảnh từ mô dâu tây bị nhiễm C acutatum b

ằng CaInt2 và ITS4, và (b) Phân tích lai miền Nam của mảnh Sản phẩm khuếch đại trong làn đường: 1, mô lá dâu tây bị nhiễm bệnh; 2, mô quả dâu tây bị nhiễm bệnh; 3, mô lá dâu tây khỏe mạnh; 4, sản phẩm mô lá dâu tây khỏe mạnh sử dụng ITS1 và ITS2 mồi làm đối chứng; và 5, C acutatum DNA.