BÁO CÁO THỰC HÀNH KĨ THUẬT DI TRUYỀN

Bài 1: Phương pháp tách chiết Plasmid từ tế bào vi khuẩn I.Cơ sở lý thuyết 1.Giới thiệu về E.coli Giới thiệu vi khuẩn E.coli Escherichia coli, còn được gọi là E. coli, là vi khuẩn coliform Gram âm, kỵ khí tùy nghi, hình que, thuộc chi Escherichia. Vi khuẩn thường gặp ở đoạn dưới ống tiêu hóa của các sinh vật máu nóng. Hầu hết các chủng E. coli đều vô hại, nhưng một số serotype như EPEC, ETEC, v.v. có thể gây ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng cho vật chủ và đôi khi là nguyên nhân gây ra các sự cố ô nhiễm thực phẩm khiến sản phẩm bị thu hồi. Hầu hết các chủng không gây bệnh cho người và là một phần của hệ vi sinh vật đường ruột bình thường; những chủng như vậy là vô hại hoặc thậm chí có lợi cho con người. Cấu tạo của vi khuẩn E.Coli: Bộ gen của vi khuẩn E.coli Trình tự DNA hoàn chỉnh đầu tiên của bộ gen E. coli (chủng K12 dẫn xuất MG1655 trong phòng thí nghiệm) được công bố vào năm 1997. Đó là phân tử DNA dạng vòng dài 4,6 triệu cặp base, chứa 4288 gen mã hóa protein (nằm trong 2584 operon), 7 operon RNA ribosome (rRNA) và 86 gen RNA vận chuyển (tRNA). Mặc dù bộ gen E. coli được phân tích di truyền chuyên sâu trong khoảng 40 năm, tuy nhiên nhiều gen trong số này chưa được biết đến. Mật độ mã hóa rất cao, với khoảng cách trung bình giữa các gen chỉ là 118 cặp base. Bộ gen có chứa một số lượng đáng kể gen nhảy, vùng lặp lại, thể tiền thực khuẩn (prophage) và tàn tích của thể thực khuẩn. 2. Các bước tách chiết Plasmid từ sinh khối vi khuẩn sử dụng cột silica spin

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCMVIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM

Bài 1: Phương pháp tách chiết Plasmid từ tế bào vi khuẩn 2 Bài 2 Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn (retriction enzyme) 7 Bài 3:Chuyển gene vào tế bào vi khuẩn bằng phương pháp shock nhiệt 11 Bài 4 Phương Pháp PCR khuẩn lạc xác định dòng tế bào vi khuẩn mang gene mục tiêu 15

Bài 1: Phương pháp tách chiết Plasmid từ tế bào vi khuẩn

I.Cơ sở lý thuyết1.Giới thiệu về E.coli

Giới thiệu vi khuẩn E.coli Escherichia coli, còn được gọi là E coli, là vi khuẩn coliform Gram âm, kỵ khí tùy nghi, hình que, thuộc chi Escherichia Vi khuẩn thường gặp ở đoạn dưới ống tiêu hóa của các sinh vật máu nóng Hầu hết các chủng E coli đều vô hại, nhưng một số serotype như EPEC, ETEC, v.v có thể gây ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng cho vật chủ và đôi khi là nguyên nhân gây ra các sự cố ô nhiễm thực phẩm khiến sản phẩm bị thu hồi Hầu hết các chủng không gây bệnh cho người và là một phần của hệ vi sinh vật đường ruột bình thường; những chủng như vậy là vô hại hoặc thậm chí có lợi cho con người.

Cấu tạo của vi khuẩn E.Coli:

Bộ gen của vi khuẩn E.coli Trình tự DNA hoàn chỉnh đầu tiên của bộ gen E coli (chủng K-12 dẫn xuất MG1655 trong phòng thí nghiệm) được công bố vào năm 1997 Đó là phân tử DNA dạng vòng dài 4,6 triệu cặp base, chứa 4288 gen mã hóa

2

protein (nằm trong 2584 operon), 7 operon RNA ribosome (rRNA) và 86 gen RNA vận chuyển (tRNA) Mặc dù bộ gen E coli được phân tích di truyền chuyên sâu trong khoảng 40 năm, tuy nhiên nhiều gen trong số này chưa được biết đến Mật độ mã hóa rất cao, với khoảng cách trung bình giữa các gen chỉ là 118 cặp base Bộ gen có chứa một số lượng đáng kể gen nhảy, vùng lặp lại, thể tiền thực khuẩn (prophage) và tàn tích của thể thực khuẩn.

2 Các bước tách chiết Plasmid từ sinh khối vi khuẩn sử dụng cột silica spin

II Tiến hành thí nghiệm

Nhận xét kết quả:

- Ly tâm thu sinh khối bỏ dịch nổi: loại bỏ hết môi trường bám lên khuẩn, hạn chế trường hợp các tế bào vi sinh vật vẫn có thể sinh trưởng khi eppendof vẫn chưa đạt đủ nhiệt độ -80℃

- Bổ sung CaCl2: ion Ca2+ giúp màng tế bào co giãn, tạo khả năng biến nạp cho tế bào.

- Bảo quản lạnh, giúp giữ giống trong gycerol vì glycerol sẽ không tạo các tinh thể băng làm phá hủy tế bào ở nhiệt độ -80℃

3 Tách chiết Plasmid từ sinh khối vi khuẩn

Sử dụng Bộ kit TracePure TM KIT tách chiết DNA plasmid

- Chuẩn bị bản gel agarose có nồng độ 1%

- Tiến hành nạp 5 µl l dung dịch DNA plasmid vào gel - Điện di DNA plasmid ở 100 voltage trong 30 phút

- Quan sát xác định band DNA plasmid, xác định chất lượng và kích thước của DNA plasmid

5 Báo cáo thực hành

5

Kết luận:

-Dựa vào hình ảnh điện di có thể xác định rằng trong tế bào của vi khuẩn BL21 và

DH5α đều đã được tách chiết thành công Và có thể xác định rằng Plasmidcủa vi khuẩn BL21 có kích thước lớn hơn 10000bp so với thang chuẩn,Plasmid của vi khuẩn DH5α có kích thước khoảng 7000bp so với thang chuẩn.

Bài 2 Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn (retriction enzyme)

I.Cơ sở lí thuyết

- Emzym cắt giới hạn (restriction enzyme-RE) là emzym cắt DNA tại vị trị nhận biết đặc hiệu để tạo đầu bằng (blunt end) hoặc đầu dính (sticky end)

- Thông thường, quy trình subcloning yêu cầu sử dụng 1-2 RE cắt ngay bên ngoài đoạn chèn mà không cắt trong chính đoạn chèn Các RE, có một vị trí nhận biết trong vùng đa điểm tạo dòng (multi cloning sites-MCS), thường được chọn sử dụng khi chúng không cắt vị trí khác trong DNA vector và thường tạo ra hai phân đoạn dễ tách biệt.

- Gene mục tiêu được tạo dòng vào một vector với mục tiêu nâng cao hiệu quả biểu hiện thành protein hoặc giúp sàng lọc gene Trong những trường hợp này, gene mục tiêu cần phải được gắn chèn vào đúng hướng và nằm trong khung đọc với promoter phiên mã

Hình Các dạng đầu cắt của emzyme cắt giới hạn

II Vật liệu và dụng cụ thực hành1.Vật liệu

- Plasmid pET -11a

- Sử dụng RE: EcoRI (5675bp) GAATTC

Thực hiện phản ứng cắt plasmid DNA với 2 enzyme cắt giới hạnCắt đồng thời với hai enzyme:

Chuẩn bị phản ứng với các thành phần theo bảng sau:

Điện di kiểm tra kết quả cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn

Kết luận:

Dựa vào hình ảnh chạy điện di gel ta thấy được rằng các đoạn Plasmid đã được cắt bằng Enzyme cắt giới hạn đều chạy chậm hơn so với các đoạn Plasmid không bị cắt bởi các Enzyme cắt giới hạn.

Nguyên nhân là khi các Plasmid có cấu trúc dạng vòng đứt (các DNA bị cắt bởi Enzyme cắt giới hạn) mặc dù có cùng chiều dài và khối lượng với các Plasmid có cấu trúc siêu trúc (các DNA chưa bị cắt bởi Enzyme cắt giới hạn) nhưng lại có hình dạng lớn hơn trong gian ba chiều, điều này dẫn đến việc chúng cần nhiều thời gian hơn để có thể đi qua các lỗ gel.

Bài 3:Chuyển gene vào tế bào vi khuẩn bằng phương pháp shock nhiệt

Qúa trình tạo dòng tế bào biến nạp

Vecor trong tế bào vi khuẩn biểu hiện đoạn

3.Quy trình chuyển gene vào tế bào vi khuẩn khả nạp bằng phương pháp shock nhiệt: Bổ sung 1 ml dung dịch CaCl2 100

mM lạnh vào eppendorf (chứa sinh

Sau 2 ngày cấy Các đĩa mà nhóm thực hiện:

13

Từ hình ảnh đĩa control được quan sát ở các mốc thời gian khác nhau ta có thể đưa ra các giả thuyết:

Gỉa thuyết 1: ampicillin có thể đã không được bảo quản đúng cách hoặc không được pha đúng cách dẫn đến các tế bào vi khuẩn trong đĩa control dù không mang gene kháng kháng sinh nhưng vẫn có thể tồn tại và phát triển được trong môi trường có ampicillin.

Gỉa thuyết 2: dòng tế bào được sử dụng đã có mặt từ rất lâu trong phòng thí nghiệm, nên có thể các tế bào đã được tiếp xúc với 1 lượng ampicillin nhất định hoặc với đoạn gene kháng kháng sinh và sống sót, các tế bào sống sót đó truyền lại gene kháng kháng sinh cho các thế hệ tiếp theo.

14

Bài 4 Phương Pháp PCR khuẩn lạc xác định dòng tế bào vi khuẩnmang gene mục tiêu

- Với mỗi ống phản ứng đã chuẩn bị, dùng que cấy thẳng đã khử trùng lấy một lượng nhỏ sinh khối vi khuẩn và hoà đều vào dung dịch phản ứng

- Vortex và spindown nhanh tất cả các ống phản ứng.

3.2 Quy trình nhiệt của phản ứng colony PCR

- Quy trình nhiệt của phản ứng colony PCR được cài đặt gồm các bước nhiệt với thời gian theo bảng sau:

Các bước nhiệt Thời gian Số lần lặp lại

15 Chọn khuẩn

Hòa tan khuẩn lạc với H2O các loại mồi

Chạy PCR và điện di gel Lưu trữ khuẩn

lạc

3.3 Điện di kiểm tra kết quả phản ứng colony PCR

- Chuẩn bị bản gel agarose có nồng độ 1.5%

- Tiến hành nạp 10 µl sản phẩm phản ứng colony PCR vào gel - Điện di sản phẩm cắt ở 100 voltage trong 30 phút

- Quan sát xác định band sản phẩm PCR và so sánh với marker để xác định kích thước

4 Báo cáo thực hành

Kết quả chạy PCR và điện di gel:

16

Kết luận:

-Từ kết điện di gel có thể kết luận rằng các tế bào được nuôi cấy trên các đĩa Petri có chứa ampicillin đều không chứa đoạn gene mục tiêu vì trên bảng điện di tất cả các giếng có chứa mẫu tương ứng là 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11,12 đều không cho ra band giống với giếng chứa mẫu control Và tất cả đều không xuất hiện bất kì band nào Còn các band nằm ngay miệng giếng chính là các Plasmid của chính vi khuẩn và có kích thước lớn hơn rất nhiều nên không thể di chuyển qua các lỗ gel và bị mắc kẹt lại.

Phần thực hiện trên phần mềm Snap Gene.

Sinh viện thực hiện: Nguyễn Quốc Duy-21137561 Lớp: DHSH17B

Phần 1: Tạo vector tái tổ hợp

Vector được chọn: pRL-null bởi vì có vùng multiple cloning site [1] Restriction enzyme: NdeI dùng chi mồi xuôi và SpeI dùng cho mồi ngược.

Enzyme pRL-null

Trình tự mồi xuôi:TCACATATGGGCAAGATTGCA Trình tự mồi ngược: CTGACTAGTTCACCACTCCCG

Chú thích: trình tự của enzyme cắt giới hạn các trình tự đánh dấu mồi

Lý do chọn Ndel cho mồi xuôi là vì có trình tự giống với đầu của đoạn gen, vị trí cắt không cắt vào các trình tự thuộc đoạn gen  từ đó làm giảm trình tự đoạn mồi xuôi  giảm nhiệt độ nóng chảy của mồi  rút ngắn chênh lệch nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược.

Qúa trình PCR đoạn gen và sau đó chuyển vào vector tạo ra vector tái tổ hợp Phần 2: Phân tích sản phẩm

Giếng 1: vector tái tổ hợp nguyên vẹn (DNA mạch vòng đóng dạng siêu xoắn) Giếng 2: vector được cắt bởi enzyme AbsI (DNA mạch vòng đứt)

Giếng 3: vector được cắt bởi enzyme AbsI + BspQI ( DNA mạch thẳng)

19

Nồng độ agarose 1%

Nồng độ agarose 1,5%

Nồng độ agarose 2%

Giải thích cho việc có sự khác biệt giữa cúa các giếng trong các nồng độ argarose khác nhau DNA dạng siêu xoắn trong không gian sẽ có diện tích bề mặt nhỏ so với DNA mạch thẳng

20

hoặc DNA vòng đứt nhưng đồng thời có độ linh hoạt kém nhất Khi nồng độ agarose là 1% DNA siêu xoắn nhỏ hơn so với DNA vòng đứt và DNA mạch thẳng(phần lớn) nên sẽ đi nhanh hơn, chậm hơn DNA mạch thẳng( phần nhỏ) có kích thước và khối lượng nhỏ nhất DNA vòng đứt có khối lượng, kích thước lớn nhất và có độ linh hoạt kém hơn mạch thẳng nên sẽ đi chậm nhất.Khi nồng độ agarose là 1,5% lúc này các lỗ gel đã nhỏ hơn nên DNA siêu xoắn cần nhiều thời gian để đi qua các lỗ gel vì độ linh hoạt kém, kích thước và khối lượng lớn hơn DNA mạch thẳng Ở nồng độ agarose 2% DNA siêu xoắn di chuyển ngắn nhất vì khối lượng lớn, độ linh hoạt kém và kích thước có thể là chỉ nhỏ hơn lỗ gel 1 chút.

So sánh:

Khối lượng: DNA siêu xoắn = DNA vòng đứt > DNA mạch thẳng.

Độ linh hoạt ( khả năng thay đổi hình dạng): DNA mạch thẳng > DNA vòng đứt > DNA siêu xoắn.

Kích thước trong không gian 3 chiều: DNA vòng đứt > DNA mạch thẳng > DNA siêu xoắn Tài liệu tham khảo:

[1] Ajay Kumar, Vishant Mahendra Boradia, Apurwa Mahajan, S Kumaran, Manoj Raje, Chaaya Iyengar Raje(2023), “Mycobacterium tuberculosis H37Rv enolase (Rv1023)- expression, characterization and effect of host dependent modifications on protein

functionality”, Biochimie Volume 214, Part B, November 2023, Pages 102-113

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trọng Phúc-21088391 Lớp: DHSH17A

Tạo vector tái tổ hợp:

RE: BAMHI + TspMI Vector: pGEX-4T

Trình tự mồi xuôi: TAA GCA GGA TCC ATG GGC AAG ATT GCA

21

Trình tự mồi ngược: TAA GCA CCC GGG TCA CCA CTC CCG AAT

Quá trình PCR đoạn gene và sau đó chuyển vào Vector tạo ra vector tái tổ hợp + Giếng số 1: sản phẩm không cắt

+ Giếng số 2: sản phẩm cắt bởi enzyme BamHI

+ Giếng số 3: sản phẩm được cắt bởi enzyme BamHI và TspMI Gel từ 0,5-1%

Ở nồng độ này thì giếng số 2 chạy nhanh nhất tiếp theo là giếng số 3 và cuối cùng là giếng số 1 chạy chậm nhất.

22

 Giếng số 1 chạy nhanh nhất dần dần tới giếng 2 và 1 Gel có nồng độ từ 3,5-4%

KẾT LUẬN:

Ở giếng đầu DNA ở dạng vòng chạy nhanh hơn so với giếng 2 Giữa DNA có dạng mạch vòng và DNA mạch thẳng có sự khác biệt khi di chuyển là do DNA plasmid dạng thẳng thường di chuyển nhanh hơn dạng vòng Ta nhận biết dạng thẳng trên gel agarose bằng cách so sánh plasmid chưa cắt với plasmid dạng thẳng đã cắt bởi enzyme giới hạn Khi đã gắn 1 trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn thì vector đã thay đổi hình dạng từ vòng sang thẳng.

24

Sinh viên thực hiện: Đặng Thị Huyền Ngân_21094021

- Ezyme cắt giới hạn : EcoRI + TspMI

b) Tạo mồi - Trình tự nhân biết Enzyme cắt giới hạn:

- Mồi xuôi - Trình tự EcoRI:

- Mồi ngược - Trình tự TspMI:

25

c) Tiến hành PCR đoạn gene chứa mồi:

Tiến hành Cloning

27

Sản phẩm Cloned

1 Điện di vector tái tổ hợp (PAG-S1) trên gel agarose 1%

- giếng 1: ko cắt bởi R/E

- giếng 2: cắt bởi 1 enzyme EcoRI

- giếng 3: cắt bởi 2 enzyme EcoRI + TspMI

28

Kết luận:

- Giếng 1 không bị cắt bởi Enz nào nên giữ được cấu trúc nguyên vẹn của đoạn DNA tái tổ hợp => Tạo cấu trúc siêu xoắn

- Giếng 2 bị cắt bởi 1 enzyme nên cấu trúc trở nên tháo xoắn => Tạo cấu trúc dạng vòng, cấu trúc này có xu hướng di chuyến chậm nhất trên gel so với dạng siêu xoắn.

- Giếng 3 bị cắt bởi 2 enzyme nên hình thành 2 sợi plasmid +plasmid dạng thẳng: (3143bp)

+plasmid dạng sợi đơn: (1153bp)

=> Sợi có kích thước nhỏ hơn sẽ đi nhanh hơn trên gel

29

Nồng độ agarose 0.5%Nồng độ agarose 2%

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Minh Đức-21111641 Lớp: DHSH17B

30

NGUOC (enzyme BssHII) TAAGCAGCATGCTCACCACTCCCGAATCTCC 31-mer 55% GC 9345.1 Da Binds at: 1128 <- 1146

Xuoi (enzyme SphI) TAAGCAGCGCGCATGGGCAAGATTGCAT28-mer 54% GC 8662.7 Da Binds at: 1 -> 16

31

Sinh viên thực hiện: Trần Tiểu My-21087211 Lớp: DHSH17A

Trình tự mồi xuôi: TAAGCACCCWGGGATGGGCAAGATTGCATC Trình tự mồi ngược: TAAGCAGGATCCTCACCACTCCCGAATCT

32

Qúa trình PCR đoạn gen và chuyển vào vector => tạo ra vector tái tổ hợp

Kết quả

Giếng 1 chứa vector chưa chỉnh sửa Giếng 2 chứa vector cắt bởi enzyme Ecori

Giếng 3 chứa vector cắt bởi 2 enzyme Ecori và BamHI

33

Kết luận

Giếng 1: không bị cắt bởi Enzyme => giữ cấu trúc nguyên vẹn đoạn DNA tái tổ hợp và tạo cấu trúc siêu xoắn

Giếng 2: cắt bởi enzyme nên cấu trúc trở nên tháo xoắn và trở thành cấu trúc dạng sợi mạch đôi => di chuyến chậm nhất trên gel so với dạng siêu xoắn.

Giếng 3: cắt bởi 2 enzyme tạo thành 2 chuỗi => kích thước sợi nhỏ hơn, di nhanh trên gel

34