Báo cáo thực hành sắc ký nhóm 2 thứ 4, tiết 7

PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT .... Phân tách sắc tố bột lá ngũ sắc bằng kĩ thuật TLC trong hệ dung môi aceton:hexan 3:7.. Phân tách sắc tố bột lá ngũ sắc bằng kĩ th

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện Mã số sinh viên

NGUYỄN THỊ MỸ NGỌC 21126425

TP Hồ Chí Minh, 11/ 2024

i

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH v

Thí nghiệm 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU 1

1.1.Tổng quan 1

1.2 Vật liệu và phương pháp 1

1.2.1 Vật liệu 1

1.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 1

1.2.3 Phương pháp thực hiện 1

1.3 Kết quả và thảo luận 2

1.3.1 Kết quả 2

1.3.2 Thảo luận 4

Xác định độ ẩm nguyên liệu 5

2.1 Tổng quan 5

2.2 Vật liệu và phương pháp 5

2.2.1 Vật liệu 5

2.2.2 Dụng cụ 5

2.2.3 Phương pháp thực hiện 5

2.3 Kết quả và thảo luận 5

2.3.1 Kết quả 5

2.3.2 Thảo luận 7

ii

Thí nghiệm 2 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ

CỘT 8

1.1 Nguyên tắc 8

2.1 Vật liệu và phương pháp 8

2.1.1 Vật liệu 8

2.1.2 Phương pháp thực hiện 8

2.1.2.1 Phân tách sắc tố thực vật bằng sắc ký cột 8

3.1 Kết quả và thảo luận 11

3.1.1 Kết quả 11

3.1.2 Thảo luận 12

Thí nghiệm 3 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KĨ THUẬT TLC 13

1.1 Tổng quan 13

1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 13

1.2.1 Vật liệu 13

1.2.2 Dụng cụ, thiết bị 13

1.2.3 Phương pháp thực hiện 13

1.4 Kết quả và thảo luận 14

1.4.1 Kết quả 14

1.4.2 Thảo luận 16

BÀI TẬP SẮC KÝ ĐỒ 17

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC 21

iii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

TCL: Thin layer chromatography

iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Khối lượng chén và mẫu trước khi sấy 5

Bảng 4.1 Giá trị Rf của các sắc tố 16

Bảng 1 Nồng độ và diện tích chất protocatechuid acid 17

Bảng 2 Nồng độ và diện tích chất chlorogenic acid 18

Bảng 3 Nồng độ và diện tích chất caffeic acid 19

Bảng 4 Tính nồng độ các hợp chất trong mẫu 3 20

v

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cân mẫu 2

Hình 1.2 Các thông số của tủ siêu âm mẫu 2

Hình 1.3 dịch chiết methanol sau khi lọc 3

Hình 1.4 dịch chiết ethyl acetate sau khi lọc 3

Hình 1.5 Giấy lọc ethyl acetate được cân lại sau khi sấy 4

Hình 1.6 Giấy lọc methanol được cân lại sau khi sấy 4

Hình 2.1 Mẫu trước khi sấy 6

Hình 2.2 Mẫu 1 được cân lại sau khi sấy 6

Hình 2.3 Mẫu 2 được cân lại sau khi sấy 7

Hình 2.1 Cân mẫu và silica gel 9

Hình 2.2 Phá mẫu bằng sóng siêu âm và thu dịch lọc 10

Hình 2.3 Thêm dịch chiết và rửa giải 11

Hình 3.1 Kết quả phân tách diệp lục tố 11

Hình 4.1 Phân tách sắc tố bột lá ngũ sắc bằng kĩ thuật TLC trong hệ dung môi aceton:hexan (3:7) (A) Bản mỏng; (B)Bản mỏng dưới đèn UV 14

Hình 4.2 Phân tách sắc tố bột lá ngũ sắc bằng kĩ thuật TLC trong hệ dung 15

môi aceton:hexan (4:6) (A) Bản mỏng; (B)Bản mỏng dưới đèn UV 15

Hình 1 Đường chuẩn Protocatechuic acid 17

Hình 2 Đường chuẩn chlorogenic acid 18

Hình 3 Đường chuẩn caffeic acid 19

Phương pháp chiết: chiết bằng dung môi có sự hỗ trợ của song siêu âm (hoá lý)

Dung môi: ethyl acetate, methanol

Nguyên liệu: bột vỏ măng cục sấy khô

Điều kiện chiết: sóng siêu âm, nhiệt độ phòng, thời gian 30 phút

1.2 Vật liệu và phương pháp

1.2.1 Vật liệu

Vật liệu thí nghiệm: bột vỏ măng cục

1.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

Hóa chất: dung môi methanol, ethyl acetate

Thiết bị: cân vi lượng, máy siêu âm, tủ sấy

Dụng cụ: Elen, giấy lọc, bình tam giác, chén đựng mẫu…

Bước 3: Sấy khô cả bả và giấy lọc trong tủ sấy

Bước 4: Cân để biết khối lượng bã còn lại trên giấy lọc

4

Hình 1.5 Giấy lọc ethyl acetate

được cân lại sau khi sấy

Hình 1.6 Giấy lọc methanol

được cân lại sau khi sấy

Sau khi thực hiện thí nghiệm và thu được kết quả ta tính được hàm lượng chất chiết thô:

5

methanol cao hơn của ethyl acetate, điều này giúp methanol có khả năng hoà tan và tương tác với mẫu tốt hơn ethyl acetate

Xác định độ ẩm nguyên liệu 2.1 Tổng quan

Bước 1: Sử dụng 2-5g mẫu cho vào chén thuỷ tinh đã sấy khô

Bước 2: Đem sấy chén và mẫu đến khối lượng không đổi

Bước 3: Để nguội trong bình hút ẩm và đem cân khối lượng chén và mẫu, tính độ

ẩm công thức

2.3 Kết quả và thảo luận

2.3.1 Kết quả

Bảng 2.1 Khối lượng chén và mẫu trước khi sấy

6

Hình 2.1 Mẫu trước khi sấy

Hình 2.2 Mẫu 1 được cân lại sau khi sấy

7

Hình 2.3 Mẫu 2 được cân lại sau khi sấy

Sau khi sấy và trừ đi khối lượng chén ta thấy được sự sụt giảm khối lượng của mẫu và từ đó xác định được % độ ẩm của sản phẩm

Trong sắc ký cột, pha tĩnh thường là chất rắn được nhồi vào cột, tạo thành một lớp tĩnh Vật liệu rắn này được chọn dựa trên khả năng hấp phụ hoặc tương tác có chọn lọc với các thành phần mục tiêu Các chất hấp phụ thường được sử dụng bao gồm silica gel, alumina và các loại nhựa khác nhau Pha tĩnh cung cấp diện tích bề mặt lớn để tương tác với các thành phần hỗn hợp

Pha động là chất lỏng hoặc khí, đóng vai trò là chất mang cho hỗn hợp và tạo điều kiện cho nó di chuyển qua cột Việc lựa chọn pha động phụ thuộc vào bản chất của các chất được tách ra và độ hòa tan của chúng Các pha động thường được sử dụng bao gồm dung môi hữu cơ, nước hoặc hỗn hợp các dung môi

2.1 Vật liệu và phương pháp

2.1.1 Vật liệu

Mẫu: Thí nghiệm này sử dụng lá ngũ sắc làm mẫu thí nghiệm

Hóa chất: Dung môi gồm có n-hexan và actetone, hạt silica gel có kích thước hạt dao động từ 230 – 400 mesh

Dụng cụ: Cột sắc ký thủy tinh, pipette pasteur, cốc beccher, bình tam giác, ống đong, giấy lọc

Thiết bị: Cân điện tử 4 số lẻ, máy đánh sóng siêu âm

2.1.2 Phương pháp thực hiện

2.1.2.1 Phân tách sắc tố thực vật bằng sắc ký cột

Mục đích: Xác định sự hiện diện và tính chất của các diệp lục tố và carotenoid

có trong lá ngũ sắc

9

Quy trình thực hiện tuân thủ theo các bước sau đây:

Bước 1: Chiết Tách Dịch Chiết

• Chuẩn bị mẫu: Lấy 1 g bột lá ngũ sắc và đặt vào một cốc becher

• Pha hệ dung môi: Pha hệ dung môi bằng cách kết hợp n-hexan và acetone theo tỷ lệ 3:7 Đong 20 mL hỗn hợp dung môi này vào cốc becher chứa bột lá ngũ sắc

• Phá mẫu bằng sóng siêu âm: Đặt cốc becher chứa hỗn hợp mẫu và dung môi vào máy phá mẫu bằng sóng siêu âm và phá mẫu trong khoảng 5 phút Sóng siêu âm giúp kéo các chất sắc tố từ mẫu lá ngũ sắc hòa vào dung môi

• Lọc mẫu: Lọc dung dịch chiết thông qua giấy lọc để loại bỏ các chất cặn

và hạt rắn từ mẫu Thu dịch chiết đã lọc

Hình 2.1 Cân mẫu và silica gel

10

Bước 2: Tách các sắc tố thực vật bằng sắc ký cột

• Chuẩn bị cột: Pha tĩnh sử dụng cột bằng pipiet Pastuer có nhét 1 lớp bông dưới đáy pipet Cân 0,75 g silica gel (kích thước hạt 230 – 400 mesh) vào cốc thủy tinh khô, thêm vào 5 mL hexan và để khoảng 15 phút Cho hỗn hợp vào pipet Pasteur, gõ nhẹ để không khí không bị giữ lại khi silica gel lắng xuống và toàn

bộ silica gel dính trên thành cột sẽ rơi xuống

• Đưa dịch chiết vào cột: khi hexan (pha động) cách bề mặt silica gel (pha tĩnh) 1

mm, thêm khoảng 1mL dịch chiết vào cột dọc theo thành, tránh xao động bề mặt pha tĩnh Tiếp tục cho n-hexan (pha động) qua cột, tránh để cột khô Sau đó để

cho phép tốc độ nhỏ giọt khoảng 1 giọt mỗi giây

• Rửa giải: Nhóm carotenoid màu vàng cam được rửa giải trước, thu vào ống nghiệm Sử dụng dung môi phân cực hơn là hỗn hợp n-hexan/aceton với tỉ lệ 7:3

để rửa giải diệp lục tố

Hình 2.2 Phá mẫu bằng sóng siêu âm và thu dịch lọc

11

Bước 3: Đánh giá kết quả

• Quan sát và đánh giá kết quả sắc ký cột

• Lặp lại thí nghiệm 2 lần để kiểm tra sự lặp lại và đảm bảo độ chính xác của

Hình 2.3 Thêm dịch chiết và rửa giải

Hình 3.1 Kết quả phân tách diệp lục tố

12

3.1.2 Thảo luận

Dựa vào thứ tự thu nhận các chất và tính phân cực của pha tĩnh ta biết được độ phân cực của 2 loại sắc tố như sau: carotenoid kém phân cực nhất, không được pha tĩnh giữ lại lâu nên thu nhận trước và tương đối nhanh, tiếp theo là chlorophyl có độ phân cực cao, được pha tĩnh giữ lại lâu nên thu nhận sau cùng

Nguyên tắc cơ bản: Sắc ký bảng mỏng hoạt động dựa trên sự phân bố khác nhau của các thành phần trong hỗn hợp giữa hai pha:

• Pha tĩnh: Một lớp mỏng chất hấp phụ (thường là silica gel hoặc alumina) được phủ trên một bề mặt phẳng như kính, nhôm, hoặc nhựa

• Pha động: Một dung môi (hoặc hỗn hợp dung môi) được sử dụng để di chuyển qua pha tĩnh nhờ hiện tượng mao dẫn

Khi hỗn hợp mẫu được chấm lên bản mỏng và cho dung môi di chuyển, các thành phần sẽ phân tách dựa trên độ tương tác khác nhau giữa chúng với pha tĩnh và pha động

Mục tiêu: Phân tích thành phần sắc tố thực vật và đánh giá tính phân cực, độ tương tác ái lực của sắc tố với pha động và pha tĩnh

1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

14

Bước 4: Đưa bản mỏng vào bình chứa dung môi ly giải Khi dung môi di chuyển cách mép 2 mm lấy ra đánh dấu

Bước 5: Soi kết quả dưới đèn UV Đưa ra kết quả và thảo luận

1.4 Kết quả và thảo luận

1.4.1 Kết quả

Hình 4.1 Phân tách sắc tố bột lá ngũ sắc bằng kĩ thuật TLC trong hệ dung môi

aceton:hexan (3:7) (A) Bản mỏng; (B)Bản mỏng dưới đèn UV

Dung môi

Chloropill b Chloropill a

Carotene

A) B)

Chloropill b Chloropill a

Dung môi Carotene

15

Hình 4.2 Phân tách sắc tố bột lá ngũ sắc bằng kĩ thuật TLC trong hệ dung

môi aceton:hexan (4:6) (A) Bản mỏng; (B)Bản mỏng dưới đèn UV

Công thức tính hệ số Rf của sắc tố:

Rf = Quãng đường di chuyển của chất tan

Quãng đường di chuyển của dung môi

Chloropill b Chloropill a

Carotene

Dung môi

Chloropill b Chloropill a

Carotene

Dung môi

Chất tan

Quãng đường đi được của chất tan (cm)

Ngược lại, Carotene là sắc tố kém phân cực nhất, giá trị Rf đều thấp nhất ở hai hệ pha động, cho thấy sự tương tác kém của sắc tố và pha động

17

BÀI TẬP SẮC KÝ ĐỒ

Đề: Xác định nồng độ 1 số hợp chất có trong chiết xuất quả cafe đã phân tách bằng

kỹ thuật sắc kỹ lỏng pha đảo – cột 18

21

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC

Họ và tên Mã số sinh viên Công việc tham gia Tiến độ

hoàn thành

Ngô Hoàng Mai 21126405 Tham gia viết báo cáo (thí

nghiệm 3), làm bài tập

100%

Nguyễn Thị Mỹ Ngọc 21126425 Tổng hợp nội dung và

hoàn thành báo cáo, tham gia viết tổng quan (thí nghiệm 3)