Báo cáo thực hành sắc ký nhóm 3 thứ 6 ca chiều

Ly trích chất chiết thô trong bột lá bạch đàn bằng dung môi acetone và ethyl acetate .... Ly trích lá của cây Bạch Đàn để đánh giá ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng chất chiết thô từ

Thủ Đức, 11/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

Nhóm thực hiện : Nhóm 3

Thủ Đức, 11/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

Thí nghiệm 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI 1

1.1 Tổng quan 1

1.1.1 Cây Bạch Đàn 1

1.1.2 Phương pháp chiết xuất 3

1.2 Vật liệu và phương pháp 3

1.2.1 Thời gian và địa điểm 3

1.2.2 Vật liệu và hóa chất 3

1.2.3 Phương pháp 4

1.3 Quy trình thực hiện 4

1.3.1 Ly trích chất chiết thô trong bột lá bạch đàn bằng dung môi acetone và ethyl acetate 4

1.3.2 Xác định độ ẩm của bột lá Bạch Đàn 5

1.4 Kết quả và thảo luận 6

1.4.1 Kết quả 6

1.4.2 Thảo luận 7

Thí nghiệm 2 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT 9

2.1 Tổng quan 9

2.1.1 Rau Chân Vịt 9

2.1.2 Kỹ thuật sắc ký cột 9

2.2 Vật liệu và phương pháp 10

2.2.1 Thời gian và địa điểm 10

2.2.2 Vật liệu và hóa chất 10

2.2.3 Phương pháp thực hiện 10

2.3 Kết quả 12

2.3.1 Trước khi rửa giải 12

ii

2.3.2 Sau khi rửa giải 13

2.4 Thảo luận 13

Thí nghiệm 3 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT TLC (KỸ THUẬT SẮC KÝ BẢN MỎNG) 14

3.1 Tổng quan về kỹ thuật sắc ký bản mỏng (TLC) 14

3.2 Vật liệu và phương pháp 14

3.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 14

3.2.2 Vật liệu và hóa chất 14

3.2.3 Phương pháp thực hiện 14

3.3 Kết quả 15

BÀI TẬP 17

Nồng độ chất chuẩn Chlorogenic acid (mg/L) từ mẫu 1 đến mẫu 6 17

Nồng độ chất Protocatechuic acid (mg/L) từ mẫu 1 đến mẫu 6 18

Nồng độ chất Caffeic acid (mg/L) từ mẫu 1 đến mẫu 6 18

iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây Bạch Đàn 1

Hình 1.2 Lá cây Bạch Đàn 2

Hình 1.3 Bột lá Bạch Đàn 3

Hình 1.4 Nguyên liệu sau khi được thêm dung môi 4

Hình 1.5 Lọc dịch chiết qua giấy lọc 5

Hình 1.6 Dịch chiết sau khi lọc qua giấy lọc 2 lần 5

Hình 1.7 Mẫu chuẩn bị đem đi sấy 6

Hình 2.1 Rau Chân Vịt 9

Hình 2.2 Cân Silica gel 11

Hình 2.3 Cho dung dịch rửa giải vào cột 2 Dung dịch rửa giải lỏng nhuốm màu dịch mẫu còn sót trên bề mặt có màu xanh nhạt 12

Hình 2.4 Thu nhận dịch phân tách sắc tố chứa carotenoid (1) Cột 1; (2) Cột 2 12

Hình 2.5 Hình cột 1 trước khi rửa giải (A) dải màu xanh lá chứa Chlorophy a,b; (B) Dải màu vàng chứa Carotenoid 12

Hình 2.6 Dịch phân tách sắc tố sau khi thu nhận được ở cả 2 cột 13

Hình 3.1 Kết quả sau quá trình ly giải 15

a) Acetone: Hexan 4:6, b) Acetone: Hexan 3:7 15

Hình 3.2 Khi chiếu đèn UV 16

a) Acetone: Hexan 4:6, b) Acetone: Hexan 3:7 16

Hình 4.1 Nồng độ chất chuẩn Chlorogenic acid (mg/L) 17

Hình 4.2 Đồ thị đường chuẩn của Chlorogenic acid (mg/L) 17

Hình 4.3 Nồng độ của Chlorogenic acid (mg/L) ở các mẫu 17

Hình 4.4 Nồng độ chất chuẩn Protocatechuic acid (mg/L) 18

Hình 4.5 Đồ thị đường chuẩn của Protocatechuic acid (mg/L) 18

Hình 4.6 Nồng độ của Protocatechuic acid (mg/L) ở các mẫu 18

Hình 4.7 Nồng độ chất chuẩn Caffeic acid (mg/L) 19

Hình 4.8 Đồ thị đường chuẩn của Caffeic acid (mg/L) 19

Hình 4.6 Nồng độ của Caffeic acid (mg/L) ở các mẫu 19

iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Khối lượng cân để xác định hàm lượng chất chiết thô 6 Bảng 1.2 Khối lượng cân để xác định độ ẩm của nguyên liệu 6 Bảng 3.1 Bảng tính chỉ số Rf của những sắc tố có trong mẫu rau chân vịt 15

1

Thí nghiệm 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG

NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI

1.1 Tổng quan

1.1.1 Cây Bạch Đàn

Cây Bạch Đàn (Eucalyptus globulus Labill) thuộc loài đại mộc Lá thường thon dài cong có màu xanh hơi mốc trắng hoặc xanh đậm chứa chất dầu Eucalyptone thơm mùi dầu tràm Bạch Đàn rất mau lớn, tán lá hẹp thưa, trồng trong vòng 5, 6 năm thì có chiều cao trên 7 m và đường kính thân cây khoảng 9 -10 cm Cây gôc, cao 20 – 25m, vỏ mềm bong thành mảnh Lá non hình trướng, không cuống, mọc đối ở những đôi lá đầu

Lá già mọc so le, cong lưỡi liềm

Hình 1.1 Cây Bạch Đàn

Bạch Đàn được trồng để phủ xanh đồi trọc ở các vùng núi và trung du hoặc để cải tạo đầm lầy Tuy nhiên ở những đồi trồng Bạch Đàn thuần chủng, dất đai bị nghèo kiệt, làm nghèo thảm thực vật khác, dễ gây xói mòn Vì vậy việc phát triển Bạch Đàn đng được các ngành có liêm quan xem xét Ở Việt nam ta được du nhập khoảng một số loại Bạch Đàn và được trồng tại các vùng như sau:

Bach Đàn Đỏ: Eucalyptus camaldulensis trồng ở các vùng đồng bằng

Bạch Đàn Trắng: Eu Alba, thích hợp trồng ở các vùng gần biển

Bạch Đàn lá nhỏ: Eu Tereticornis thích hợp trồng ở vùng đồi Thừa Thiên – Huế Bạch Đàn lá liễu: E exserta F.V.Muell thích hợp trồng ở các vùng thấp

2

Bạch Đàn là một loại cây cho gỗ có giá trị Với cây sau 20 năm trồng có thể sử dụng cho hầu hết mọi mục đích như làm chất đốt, làm nguyên liệu để sản xuất giấy, đà ngang cho đường rây xe lửa, gỗ để xây dựng Ở Việt Nam, do khả năng phát triển của Bạch Đàn rất nhanh trên các loại đất nên được trồng ở những vùng trung du, đồi núi để phủ xanh đồi trọc, giữ nước chống lụt

Lá: Có thể dùng lá Bạch Đàn trắng hoặc Bạch Đàn liễu để thay thế lá Bạch Đàn

xanh (E globulus) là loại đã được sử dụng rất lâu đời ở các nước châu Âu Dạng dùng:

Thuốc hãm, thuốc xông, hoặc pha chế thành các dạng bào chế như xiro, còn lá Bạch Đàn dùng để chữa ho, sát khuẩn đường hô hấp, chữa các bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp, ho, hen

Hình 1.2 Lá cây Bạch Đàn

Thân: Bạch Đàn thường được sử dụng làm gỗ xây dựng làm và chất đốt Vừa lấy

gỗ, bột gỗ Gỗ Bạch Đàn có độ co dãn cao, có thể dùng để xây dựng thông thường, đóng vật dụng gia đình, đóng thuyền, làm gỗ ép Mùi thơm đặc trưng của Bạch Đàn có tác dụng đuổi muỗi, do đó được trồng ở những vùng đầm lầy ẩm thấp để cải tạo môi sinh, làm giảm tỉ lệ bệnh sốt rét Những năm gần đây, Bạch Đàn được trồng vừa để lấy tinh dầu Bạch Đàn cung cấp tỉnh dầu với năng suất khá cao, có giá trị xuất khẩu đó là một nguồn lợi kinh tế rất lớn mà chúng ta phải biết khai thác

Tinh dầu Bạch Đàn có hai màu: Màu hơi vàng (trích ly bằng phương pháp vi sóng)

và trong suốt Có mùi thơm tự nhiên của lá Bạch Đàn Bạch đàn chứa các thành phần hóa học gồm: Limonene, α – Pinene, Terpinene, 1,8 – Cineol, O – Cymene Ly trích lá của cây Bạch Đàn để đánh giá ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng chất chiết thô

từ mẫu

3

1.1.2 Phương pháp chiết xuất

Chiết xuất là bước đầu tiên để tách chiết các hợp chất mong muốn ra khỏi nguyên liệu ban đầu Chiết xuất bằng dung môi kết hợp với tác nhân vật lý được sử dụng rộng rãi nhất bao gồm các bước sau: Dung môi thâm nhập vào chất nền hoặc nguyên liệu Tiếp theo, chất phân tích hòa tan trong dung môi Sau đó, chất tan được khuếch tan ra khỏi chất nền hoặc nguyên liệu Cuối cùng, thu nhận các chất tan đã chiết Các yếu tố ảnh hưởng gồm dung môi, kĩ thuật tách chiết và nguyên liệu Có 3 phương pháp chính: Phương pháp vật lý: chưng cất, ép

Phương pháp hóa học sử dụng dung môi

Phương pháp hóa lí kết hợp: dung môi kết hợp với nhiêt độ, áp suất, sóng siêu âm hoặc vi sóng

Thí nghiệm sử dụng phương pháp chiết bằng dung môi dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm Nguyên tắc củ sóng siêu âm là phần lớn năng lượng của sóng chuyển thành cơ năng, sự rung kéo dài sẽ làm vỡ các bọt khí tại chỗ Dưới tác động của sóng siêu âm, dung môi tại các hốc nhỏ bị sủi bọt, đẩy chất cần thiết ra khỏi mẫu, chất tan vào trong dung môi

1.2 Vật liệu và phương pháp

1.2.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: ngày 8 tháng 11 và ngày 22 tháng 11 năm 2024

Địa điểm: phòng 306 tòa A2 Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm HCM

1.2.2 Vật liệu và hóa chất

Nguyên liệu: bột lá Bạch Đàn

Hình 1.3 Bột lá Bạch Đàn

4

Dung môi sử dụng: Acetone, Ethyl acetate

Thiết bị: Cân điện tử; Bể siêu âm (J.P.SELECTA, s.a) công suất tiêu thụ điện năng của bể 465W, tần số 50/60 Hz; Tủ sấy (Memmert)

Dụng cụ: Bình tam giác, giấy lọc, pipet, cốc thủy tinh, chén thủy tinh,

1.2.3.2 Xác định độ ẩm của nguyên liệu

Xác định độ ẩm của bột lá bạch đàn bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105°C trong

5

Bước 3: Thêm tiếp 15 mL dung môi vào bã và siêu âm (15 phút), lọc dịch chiết qua giấy lọc lần 2

Bước 4: Lọc hết bã trong bình qua giấy lọc, sấy khô cả bã và giấy lọc trong tủ sấy

Bước 5: Sau khi sấy xong¸cân lại để biết khối lượng bã còn lại

1.3.2 Xác định độ ẩm của bột lá Bạch Đàn

Bước 1: Lấy chén thủy tinh đã được sấy khô (105°𝐶) và làm nguội trong bình hút

ẩm, cân khối lượng chén

Bước 2: Cân 2 – 5 g bột lá bạch đàn trong chén thủy tinh Đem sấy chén và mẫu ở nhiệt độ 105°𝐶 đến khi khối lượng không đổi

Hình 1.5 Lọc dịch chiết qua giấy lọc

Hình 1.6 Dịch chiết sau khi lọc qua giấy lọc 2 lần

6

Bước 3: Để nguội trong bình hút ẩm và cân tổng khối lượng chén và mẫu

1.4 Kết quả và thảo luận

1.4.1 Kết quả

1.4.1.1 Ly trích chất chiết thô trong bột lá bạch đàn bằng dung môi acetone và ethyl acetate

Bảng 1.1 Khối lượng cân để xác định hàm lượng chất chiết thô

Dung môi Khối lượng bột khô

ban đầu (g) Khối lượng giấy lọc (g) Khối lượng bã và giấy sau khi sấy (g)

m1: Khối lượng nguyên liệu khô ban đầu (g)

m2: Khối lượng bã khô còn lại trên giấy lọc (g)

1.4.1.2 Xác định độ ẩm của bột lá bạch đàn

Bảng 1.2 Khối lượng cân để xác định độ ẩm của nguyên liệu

Khối lượng lần 1 (g) Khối lượng lần 2 (g)

Hình 1.7 Mẫu chuẩn bị đem đi sấy

7

Tổng khối lượng cả chén và mẫu

sau khi sấy

m0 là khối lượng của mẫu thử trước khi sấy (g)

m1 là khối lượng của chén và nắp trước khi sấy (g)

m2 là tổng khối lượng chén, nắp và mẫu sau khi sấy (g)

Cả hai dung môi đều có tính an toàn và dễ bay hơi, nhưng acetone cần được kiểm soát và xử lý cẩn thận để tránh mất mát hợp chất Vì vậy, tùy vào mục đích sử dụng mà lựa chọn dung môi cho phù hợp Dung môi acetone phù hợp nếu cần thu được lượng lớn

Kết quả này cho thấy bột lá bạch đàn có độ ổn định và khả năng bảo quản tương đối tốt Độ ẩm thấp cho thấy mẫu bột lá đã qua xử lý để giảm lượng nước, giúp mẫu có thể bảo quản tốt hơn và ngăn ngừa sự phát triển của nấm mốc, vi khuẩn Mặc dù độ ẩm thấp sẽ giúp bảo quản lâu dài nhưng nếu độ ẩm quá thấp thì các hợp chất, hoạt tính trong mẫu có thể bị phá hủy Chính vì vậy, việc kiểm soát độ ẩm trong quá trình chiết xuất và bảo quản một cách hợp lý là rất quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng sản phẩm

Rau chân vịt chứa nguồn chất dinh dưỡng phong phú Phân tích thành phần hóa học của rau, ghi nhận nhiều dưỡng chất có trong lá rau như:Kali, Kẽm, Magiê, Sắt, Canxi, Folate, Niacin, Vitamin A, B6, C, K, B1, B2, đặc biệt chứa nhiều vitamin C Nhờ

sở hữu một kho tàng dưỡng chất phong phú, rau chân vịt được ưa chuộng lựa chọn làm rau ăn trong thực đơn hàng ngày Chiết xuất từ loại rau này còn có mặt trong nhiều loại thực phẩm bổ sung hay thậm chí là các sản phẩm làm đẹp

2.1.2 Kỹ thuật sắc ký cột

10

Sắc ký cột là phương pháp phân tách các thành phần trong hỗn hợp dựa vào sự tương tác khác nhau của các chất tích với pha động và pha tĩnh, dẫn đến sự khác biệt trong phân bố giữa hai pha Pha tĩnh là pha đứng yên, tương tác với các chất và chứa vật liệu rắn có khả năng hấp phụ tốt như silica gel (SiO2), alumina (Al2O3) được nhồi trong cột thủy tinh thẳng đứng và được giữ lại trong cột nhờ lớp để được nhồi vào cột trước

đó (cát hoặc sợi bông thủy tinh) Pha động làpha di chuyển qua pha tính, là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi được rót từ trên đỉnh cột xuống có tác dụng hòa tan mẫu để đưa vào cột, phân tách các thành phần trong mẫu và rửa giải các chất ra khỏi cột đối với các chất tương tác mạnh pha tĩnh Qúa trình phân tách phụ thuộc vào các chất có độ hấp phụ

và ái lực tấp hơn với pha tĩnh sẽ di chuyển nhanh hơn, ra khỏi cột sớm hơn các chất có

độ hấp phụ và ái lực cao hơn pha tĩnh và sự tương tác giữa pha động và pha tĩnh Silica và alumina đều là những chất hấp phụ phân cực nên các phân tử phân cực trong mẫu hay hỗn hợp sẽ bị giữ lại lâu hơn trong pha tĩnh và ra khỏi cột chậm hơn Ứng dụng của sắc ký cột hiện nay được dùng để phân tách các thành phần trong hỗn hợp, cô lập hợp chất để nghiên cứu các hợp chất mới, tinh sạch hợp các chất quan tâm và loại

bỏ tạp chất

2.2 Vật liệu và phương pháp

2.2.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: 13h00 ngày 22 tháng 11 năm 2024

Địa điểm: phòng 306 tòa A2 Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm HCM

2.2.2 Vật liệu và hóa chất

Nguyên liệu: bột rau Chân Vịt

Dung môi: henxan:aceton tỉ lệ 8:2

Vật liệu: Pha tĩnh: Silica gel 0,015-0,040 mm, sợi thuỷ tinh, máy đánh siêu âm pipet pasteur, micro pipet, bình tam giác, becher, ống nghiệm, phễu lọc, giấy lọc, vật tư tiêu hao

2.2.3 Phương pháp thực hiện

2.2.3.1 Chuẩn bị dịch chiết sắc tố

Bước 1: Cân 1, 0073 g rau chân vịt khô xây nhuyễn, cho vào bình tam giác Bước 2: Chuẩn bị dung môi hexan:aceton tỉ lệ 8:2, thêm 10 mL dung môi vào bình, lắc đều, bọc kín miệng bình bằng giấy bạc Đánh sóng siêu âm 5 phút

Bước 2: Chuẩn bị Silica gel: Cân 1, 0512 g Silica gel đựng trong cốc thuỷ tinh Ngâm trong hexan 10 phút

Hình 2.2 Cân Silica gel

Bước 3: Nhồi cột, dùng pipet bơm hỗn hợp từ từ vào cột, xoay đều cột để tạo bề mặt silica gel bằng phẳng, gõ nhẹ để làm phẳng tránh tạo bọt khí trong cột, có thể sử dụng lượng hexan trong hỗn hợp để tráng hết silica gel dính trên thành cột xuống Giữ lại lượng hexan để giữ ẩm silica gel Chia đều lượng silica gel vào 2 cột, mỗi cột khoảng 0.5 g silica gel

2.2.3.3 Đưa mẫu vào cột

Bước 1: Khi pha động cách bề mặt pha tĩnh 1 mm, dùng micro pipet thêm 1 mL hỗn hợp dịch chiết sắc tố vào cột dọc theo thành tránh làm xao động bề mặt pha tĩnh

Có thể sử dụng hexan để đẩy hết dịch mẫu dính trên thành cột xuống Tránh để cột khô Bước 2: Quan sát hiện tượng, các chất phân cực khác nhau sẽ di chuyển nhanh chậm khác nhau tạo ra các dải màu trong pha tĩnh silica gel

2.2.3.4 Rửa giải

Bước 1: Chuẩn bị dung dịch rửa giải là hexan:aceton với tỉ lệ 7:3

12

Bước 2: Thêm dung dịch rửa giải vào cột để rửa giải các sắc tố đã được phân tách Nhóm carotenoid màu vàng cam được rửa giải trước, thu nhận trong ống nghiệm Sau

đó đến nhóm Chlorophyl a và b màu xanh lá thu nhận trong ống nghiệm

Hình 2.3 Cho dung dịch rửa giải vào cột 2 Dung dịch rửa giải lỏng nhuốm màu dịch mẫu

còn sót trên bề mặt có màu xanh nhạt

Hình 2.4 Thu nhận dịch phân tách sắc tố chứa carotenoid (1) Cột 1; (2) Cột 2

Bước 3: Quan sát và đánh giá độ phân cực của các sắc tố được phân tách

2.3 Kết quả

2.3.1 Trước khi rửa giải

Hình 2.5 Hình cột 1 trước khi rửa giải (A) dải màu xanh lá chứa Chlorophy a,b; (B) Dải

màu vàng chứa Carotenoid

B

A

2.3.2 Sau khi rửa giải

Hình 2.6 Dịch phân tách sắc tố sau khi thu nhận được ở cả 2 cột

Thu được 2 dung dịch Dung dịch sắc tố màu vàng có chứa carotenoid và dung dịch sắc tố màu xanh lá có chứa Chlorophyl a và b

Trong dung dịch ống (1) có thể có chứa sắc tố carotenoid màu vàng-cam phân cực kém, di chuyển nhanh hơn trong pha tĩnh silica gel nên được rửa giải và thu nhận trước Bên cạnh đó có thể chứa sắc tố Pheophytin a,b màu xám khiến cho màu của dịch lọc có màu vàng đục (không hiện ánh cam của carotenoid)

Trong dung dịch ống (2) có thể chứa chlorophyl a màu xanh lá và Chlorophyl b màu xanh lá ánh xanh dương Bên cạnh đó sắc tố Xantophyl màu vàng có độ phân cực tương đương với Chloryphyl a, b màu vàng cũng có thể có mặt trong dịch lọc

2.4 Thảo luận

Rau chân vịt có chứa nhiều các sắc tố khác nhau, dễ quan sát và phổ biến nhất là carotenoid, chlorophyl a và b Các sắc tố khác cũng có mặt trong trong dịch chiết sắc tố của rau chân vịt bao gồm Pheophytin a, b và Xantophyl

Độ phân cực từ yếu đến mạnh của các sắc tố trong rau chân vịt được sắp xếp như sau: Carotenoid < Phenophytin a,b < Chlorophyl a < Chlorophyl b < Xantophyl

Phương pháp phân tách bằng sắc ký cột thu được sắc tố khác nhau một cách tương đối, không thể phân tách hoàn toàn các sắc tố khác nhau Để quan sát rõ các sắc tố trong rau chân vịt nên sử dụng nhiều phương pháp sắc ký khác nhau