Báo cáo thực hành sắc ký nhóm 4 sáng thứ 3 19 11

Khối lượng của 2 mẫu khi sử dụng dung môi Ethyl acetate và Ethanol Dung môi Khối lượng mẫu khô Khối lượng giấy lọc Khối lượng sau sấy ra khi chiết vỏ măng cụt nên sử dụng dung môi chiết

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện Mã số sinh viên

TS Trịnh Thị Phi Ly Dương Phạm Phương Nguyên 21126428

Thành phố Thủ Đức, 11/2024

ĐÁNH GIÁ LÀM VIỆC NHÓM

Nội dung công việc:

Dương Phạm Phương Nguyên: Hỗ trợ thí nghiệm, báo cáo nội dung ẩm độ nguyên liệu, báo cáo nội dung chiết mẫu, chụp ảnh

Nguyễn Ngọc Nhi: Hỗ trợ thí nghiệm, chỉnh sửa báo cáo, định dạng báo cáo, ghi chép số liệu, chụp ảnh, làm bài tập xác định nồng độ mẫu 4

Lê Đặng Phú Quý: Hỗ trợ thí nghiệm, báo cáo nội dung sắc ký bản mỏng Nguyễn Văn Tân: Hỗ trợ thí nghiệm, báo cáo nội dung sắc ký cột, chụp ảnh

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH v

BÀI 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU 1

1.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu 1

1.1.1 Cơ sở lý thuyết 1

1.1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 1

1.1.2.1 Vật liệu nghiên cứu 1

1.1.2.2 Phương pháp thực hiện 1

1.1.3 Kết quả và thảo luận 3

1.1.3.1 Kết quả 3

1.1.3.2 Thảo luận 3

1.2 Ly trích các chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau 3

1.2.1 Cơ sở lý thuyết 3

1.2.2 Vật liệu và phương pháp 3

1.2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 3

1.2.2.2 Phương pháp thực hiện 3

1.2.3 Kết quả và và thảo luận 6

1.2.3.1 Kết quả 6

1.2.3.2 Thảo luận 6

BÀI 2 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG 7

KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT 7

2.1 Cơ sở lý thuyết 7

2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 7

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 7

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 7

2.3 Kết quả và thảo luận 10

BÀI 3 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG 11

KỸ THUẬT TLC 11

3.1 Cơ sở lý thuyết 11

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 11

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 11

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 11

3.3 Kết quả và thảo luận 12

3.3.1 Kết quả 12

3.3.2 Thảo luận 13

BÀI 4 BÀI TẬP MẪU 4 15

4.1 Đường chuẩn các chất 15

4.1.1 Đường chuẩn Protocatechuic acid 15

4.1.2 Đường chuẩn Chlorogenic acid 15

4.1.3 Đường chuẩn Caffeic acid 15

4.2 Nồng độ chất chuẩn 16

4.2.1 Chuẩn Protocatechuic acid 16

4.2.2 Chuẩn Chlorogenic acid 16

4.2.3 Chuẩn Caffeic acid 16

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

TLC : Thin Layer Chromatography - Sắc ký lớp mỏng

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Các khối lượng chén 1 và chén 2 ……… 3 Bảng 1.2 Khối lượng của 2 mẫu khi sử dụng dung môi Ethyl acetate và Ethanol… 6

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Bột vỏ măng cụt……… …….… …1

Hình 1.2 Chén và mẫu trước khi sấy.……… ………2

Hình 1.3 Mẫu được đem sấy ở 105oC.……….… …2

Hình 1.4 Bột vỏ măng cụt sau khi thêm 15 mL dung môi.……… …4

Hình 1.5 Mẫu được đưa vào bồn siêu âm.……… …4

Hình 1.6 Tiến hành lọc dịch chiết thô lần 1.……….… …4

Hình 1.7 Lọc dịch chiết thô lần 2.……… ……5

Hình 1.8 Tiến hành sấy bã.……… … …5

Hình 2.1 Cân 1g mẫu lá sài đất.……… …8

Hình 2.2 Cân 0,75 g silica gel.………8

Hình 2.3 Hút hỗn hợp silica gel vào cột.……… ……… …8

Hình 2.4 Hút 1 mL mẫu vào cột.……… … …9

Hình 2.5 Thời gian sau 10 phút phân tách.……… ……… 9

Hình 2.6 Chất sau khi quá trình phân tách hoàn thành a) Carotenoid, b) Diệp lục tố 10

Hình 3.1 Kết quả thu được sau khi hoàn thành ly giải a) Tỉ lệ hexane và acetone là 7:3; b) Tỉ lệ hexane và acetone là 6:4.……… ………… …………12

BÀI 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG

NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU

1.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu

1.1.1 Cơ sở lý thuyết

Làm mất hơi nước có trong nguyên liệu thông qua phương pháp bay hơi ở nhiệt

độ cao Mẫu biết trước khối lượng được sấy ở 105°C đến khi khối lượng không đổi Khối lượng thay đổi giữa trước và sau sấy chính là khối lượng nước bay hơi Từ đó, độ

ẩm được xác định qua công thức:

𝑤(%) =𝑤1 −𝑤 2

𝑚 × 100 (%) Trong đó:

w1 (g) là khối lượng của mẫu thử và chén trước khi sấy

w2 (g) là khối lượng của mẫu thử và chén sau khi sấy

m (g) là khối lượng của mẫu thử trước khi sấy

1.1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

1.1.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Bước 1: Xác định khối lượng chén (chén đã sấy ở 105oC và làm nguội trong bình hút ẩm silica gel) Tiếp đó, cân 2 (g) mẫu chưa sấy lần lượt vào 2 chén

w1 (g) là khối lượng của mẫu thử và chén trước khi sấy

Hình 1.2 Chén và mẫu trước khi

sấy

Hình 1.3 Mẫu được đem sấy ở 105oC

w2 (g) là khối lượng của mẫu thử và chén sau khi sấy

m (g) là khối lượng của mẫu thử trước khi sấy

1.1.3 Kết quả và thảo luận

1.2.2 Vật liệu và phương pháp

1.2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Dung môi: Ethyl acetate và Ethanol

Vật liệu: bột vỏ măng cụt, kích thước hạt ≤ 1 mm, độ ẩm 7,1804 %

Điều kiện chiết: sóng siêu âm tần số 40 KHz, công suất 250W, công suất sinh nhiệt 300W, nhiệt độ phòng, thời gian 30 phút (chiết 2 lần, mỗi lần 15 phút)

1.2.2.2 Phương pháp thực hiện

Phương pháp chiết: chiết bằng dung môi với sự hỗ trợ của sóng siêu âm

Bước 1: Cân 1 g bột vỏ măng cụt vào erlen, thêm vào 15 mL dung môi cho thấm

ướt Sau đó đem đi siêu âm trong 15 phút Dịch chiết sau siêu âm được lọc qua giấy lọc

Bình 1: Ethyl acetate với khối lượng mẫu 1,0097 (g) Khối lượng giấy lọc: 0,8405 (g)

Bình 2: Ethanol với khối lượng mẫu 1,0074 (g) Khối lượng giấy lọc: 0,8458 (g)

Bước 2: Thu lấy bã trên giấy lọc cho vào bình erlen mới Thêm tiếp 15 mL dung

môi mỗi loại vào 2 bình và thực hiện lại bước 1, chiết tiếp lần 2 (15 phút)

Hình 1.4 Bột vỏ măng cụt sau khi thêm

Bước 3: Lọc hết bã trong bình qua giấy lọc Sấy khô cả bã và giấy lọc trong tủ

sấy (xếp kín che phủ phần bã gói gọn trong giấy lọc) Sấy ở 105oC

Bước 4: Cân và ghi nhận khối lượng bã sau sấy

Hiệu suất chiết được xác định qua công thức:

H (%) = 𝑚1−𝑚2

𝑚1 × 100%

Trong đó:

m1 (g) là khối lượng nguyên liệu khô ban đầu

m2 (g) là khối lượng bã khô còn lại trên giấy lọc

Hình 1.7 Lọc dịch chiết thô lần 2

Hình 1.8 Tiến hành sấy bã

1.2.3 Kết quả và và thảo luận

1.2.3.1 Kết quả

Mẫu cân bột vỏ măng cụt chiết với Ethyl acetate 1,0097 g với độ ẩm 7,1804% suy ra khối lượng khô 0,9372 g

Mẫu cân bột lá hoàn ngọc chiết với methanol 1,0074 g với độ ẩm 7,1804 % suy

ra khối lượng khô 0,9350 g

Bảng 1.2 Khối lượng của 2 mẫu khi sử dụng dung môi Ethyl acetate và Ethanol

Dung môi Khối lượng mẫu (khô) Khối lượng giấy lọc Khối lượng sau sấy

ra khi chiết vỏ măng cụt nên sử dụng dung môi chiết có độ phân cực cao để thu được nhiều hoạt chất nhất

BÀI 2 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG

KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT

2.1 Cơ sở lý thuyết

Sắc ký cột là một quá trình tách được thực hiện trong cột mở dựa trên sự phân

bố khác biệt của các hợp chất giữa hai pha

Có hai pha: pha tĩnh là chất hấp phụ rắn (silica gel, alumina) và pha động là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi (hòa tan, tách mẫu và rửa giải vật liệu khỏi cột)

Nguyên lý: Các thành phần có ái lực thấp hơn với pha tĩnh sẽ di chuyển nhanh hơn các thành phần có ái lực cao hơn với pha tĩnh

Tương tác: không phân cực – không phân cực, phân cực – phân cực Nghĩa là nếu pha động là hợp chất không phân cực thì các thành phần không phân cực, có ái lực thấp hơn pha tĩnh sẽ di chuyển nhanh hơn và thu được trước tiên, và ngược lại

Ứng dụng của sắc ký cột: tách các thành phần trong hỗn hợp; tách các hợp chất

để nghiên cứu các hợp chất mới; tinh chế các hợp chất quan tâm, loại bỏ tạp chất

Các sắc tố có trong thực vật như: diệp lục A và B, carotenoid…

2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu: Lá sài đất

Pha tĩnh: Silica gel

Cột pipet Pasteur, ống hút, cốc thủy tinh, bông thủy tinh

Pha động: n – hexane

Dung dịch rửa giải: hexan + acetone (7:3)

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

Bước 1: Chuẩn bị dịch chiết

Cân 1 g mẫu lá sài đất + 10 ml hỗn hợp hexane:aceton (8:2) đem đi ủ trong bồn sóng siêu âm 5 phút, sau đó lọc thu dịch chiết

Hình 2.1 Cân 1g mẫu lá sài đất

Hút từ từ hỗn hợp vào trong cột, dùng dung môi hexan rửa theo thành ống, gõ nhẹ vào thành ống để hỗn hợp silica gel rơi xuống, để cho không khí không bị giữ lại khi hỗn hợp silica gel lắng xuống, đảm bảo bề mặt cột bằng phẳng và không có bọt khí

Hình 2.3 Hút hỗn hợp silica gel

vào cột

Hình 2.2 Cân 0,75 g silica gel

Bước 3: Đưa mẫu vào cột

Khi pha động cách bề mặt pha tĩnh 1 mm, thêm khoảng 1 mL hỗn hợp sắc tố vào cột dọc theo thành, tránh xao động bề mặt pha tĩnh

Tiếp tục cho pha động là n-hexane qua cột, tránh để cột khô Sau đó để cho phép tốc độ nhỏ giọt khoảng 1 giọt mỗi giây

Bước 4: Rửa giải

Thêm pha động vào cột, để pha tĩnh tách ra và rơi xuống Rửa giải khi mẫu cách

bề mặt pha tĩnh khoảng 1 mm Thêm chất rửa giải dọc theo thành cột để rửa giải dung dịch màu vàng cam trước

Tiếp tục dùng dung dịch rửa giải có độ phân cực cao hơn để rửa giải các chất tiếp theo có độ phân cực cao hơn

Quan sát khả năng phân tách sắc tố

Hình 2.4 Hút 1 mL mẫu vào cột Hình 2.5 Thời gian sau 10 phút

phân tách

2.3 Kết quả và thảo luận

Sau khi rửa giải thu được carotenoid màu vàng cam (độ phân cực kém), điều này chứng tỏ carotenoid là hợp chất không phân cực, có ái lực yếu với pha tĩnh nên sẽ

di chuyển ra khỏi cột nhanh hơn

Sau khi thêm dung dịch rửa giải độ phân cực cao hơn thu được nhóm diệp lục màu xanh, chứng tỏ diệp lục là nhóm phân cực và có ái lực mạnh với pha tĩnh nên tồn tại lâu trong cột Khi tăng độ phân cực bằng với độ phân cực của các hợp chất cần tách, chúng sẽ di chuyển ra khỏi cột

Hình 2.6 Chất sau khi quá trình

phân tách hoàn thành

a) Carotenoid, b) Diệp lục tố

a) b)

TLC dựa trên sự phân tách của các hợp chất trong một mẫu khi chúng di chuyển qua một lớp vật liệu hấp phụ (thường là silica gel hoặc alumina) trên một bề mặt phẳng Quá trình này sử dụng sự khác biệt về tính tương tác của các hợp chất với pha tĩnh và pha động

Pha tĩnh (stationary phase): Là lớp vật liệu hấp phụ, thường là silica gel hoặc alumina, được phủ lên bề mặt của một tấm kính hoặc nhựa

Pha động (mobile phase): Là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi di chuyển qua lớp pha tĩnh, giúp các hợp chất trong mẫu di chuyển

Khi mẫu được chấm lên tấm sắc ký, dung môi sẽ di chuyển qua lớp vật liệu hấp phụ, tách các hợp chất trong mẫu dựa trên khả năng hòa tan và khả năng tương tác với pha tĩnh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Nguyên liệu: Dịch chiết sắc tố của lá sài đất

Pha tĩnh: Bảng mỏng silicagel F254

Pha động:

Dung môi ly giải chứa hexane và acetone tỉ lệ 7:3

Dung môi ly giải chứa hexane và acetone tỉ lệ 6:4

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

Bước 1: Đánh dấu vạch xuất phát và vị trí chứa dịch chiết sắc tố trên bảng mỏng silicagel

Bước 2: Đưa dịch chiết sắc tố lên các bảng mỏng ở các vị trí đã đánh dấu

Bước 3: Đặt bản mỏng vào bình chứa hỗn hợp dung môi ly giải sao cho phần dung dịch ly giải ngập qua vạch xuất phát

Bước 4: Chờ quá trình ly giải hoàn thành rồi đánh dấu vạch kết thúc bằng bút chì

3.3 Kết quả và thảo luận

3.3.1 Kết quả

Hình 3.1 Kết quả thu được sau khi hoàn thành ly

giải a) Tỉ lệ hexane và acetone là 7:3; b) Tỉ lệ

hexane và acetone là 6:4

Sau 15 phút thì có thể thấy được các sắc tố chạy tách biệt nhau hoàn toàn, carotene không phân cực nên không có tương tác ái lực mạnh với silica gel (phân cực) nên di chuyển nhanh hơn so với chlorophyll A và chlorophyll B

Công thức tính hệ số lưu giữ (Rf):

Rf =𝑠 1

Trong đó:

S1 là quãng đường di chuyển của chất tan (cm)

S2 là quãng đường di chuyển của dung môi (cm)

Đối với dung môi ly giải chứa hexane và acetone tỉ lệ 7:3

Carotene: Rf =4,8

5,2 ≈0,92 Chlorophyll a: Rf =3,2

5,2 ≈0,62 Chlorophyll b: Rf =2,9

5,2 ≈0,56

Đối với dung môi ly giải chứa hexane và acetone tỉ lệ 6:4

Carotene: Rf =5,2

5,2 =1 Chlorophyll a: Rf =4,5

5,2 ≈0,87 Chlorophyll b: Rf =4,3

5,2 ≈0,83

3.3.2 Thảo luận

Ta biết rằng, khi sử dụng hệ dung môi hexan-acetone ly giải, tốc độ di chuyển của các chất trên bản TLC sẽ phụ thuộc vào tính phân cực của các hợp chất và tính phân cực của pha động Cụ thể, hexan là dung môi không phân cực, có xu hướng mang theo các hợp chất không phân cực và ngược lại, acetone có tính phân cực trung bình, giúp điều chỉnh sự phân cực của pha động để tách các hợp chất phân cực hơn

So sánh khả năng tách của hai dung môi (hexane: acetone 7:3 và 6:4) trong sắc

ký bản mỏng cho thấy rằng dung môi 7:3 có độ phân cực thấp hơn, điều này giúp cải thiện khả năng tách các hợp chất trong dịch chiết, bao gồm caroten và chlorophyll a, b, khi sử dụng với pha tĩnh là silicagel phân cực Ngược lại, dung môi 6:4 có độ phân cực cao hơn, khiến cho các chất chlorophyll a và b dễ bị kéo theo pha động, dẫn đến việc

tách rời khó khăn hơn Do đó, dịch chiết với tỷ lệ 7:3 sẽ phù hợp hơn so với dịch chiết 6:4 trong việc tách các sắc tố thực vật

BÀI 4 BÀI TẬP MẪU 4

4.1 Đường chuẩn các chất

4.1.1 Đường chuẩn Protocatechuic acid

4.1.2 Đường chuẩn Chlorogenic acid

4.1.3 Đường chuẩn Caffeic acid

14.6927 67.1505

140.4686

357.7658

y = 14.372x - 2.2918 R² = 0.9998

4.2 Nồng độ chất chuẩn

4.2.1 Chuẩn Protocatechuic acid

Phương trình chuẩn ở phần 4.1.1 là y=14.372x - 2.2918 Thay y là diện tích peak trong sắc ký đồ Ta có: x=68.7499+2.2918

14.372 ≈4.94 (mg/L)

4.2.2 Chuẩn Chlorogenic acid

Phương trình chuẩn ở phần 4.1.1 là y= 40.015x - 9.7092 Thay y là diện tích peak trong sắc ký đồ Ta có: x=578.0308+9.7092

40.015 ≈14.69 (mg/L)

4.2.3 Chuẩn Caffeic acid

Phương trình chuẩn ở phần 4.1.1 là y=21.456x - 4.1538 Thay y là diện tích peak trong sắc ký đồ Ta có: x=53.8372+4.1538

21.456 ≈ 2.70 (mg/L)