th vstyh nhóm 4 sáng thứ 3

Mục tiêu Kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn Salmonella trong mẫu ly trích ban đầu thông qua một cặp mồi đặc hiệu cho vùng gen bằng phương pháp PCR và điện di có sử dụng ladder.. Quá trình n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

THỰC HÀNH VI SINH TRONG Y HỌC

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Môn học : THỰC HÀNH VI SINH

TRONG Y HỌC Nhóm thực hiện : NHÓM 4- THỨ 3- CA SÁNG Niên khóa : 2021-2025

TP Thủ Đức, 05/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

THỰC HÀNH VI SINH TRONG Y HỌC

Giảng viên hướng dẫn: PGS TS NGUYỄN BẢO QUỐC

Sinh viên thực hiện:

STT Mã số sinh viên Họ và tên Ký tên

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH v

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Vi khuẩn Salmonella 2

2.2 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 3

2.2.1 Khái niệm 3

2.2.2 Thành phần 3

2.2.3 Các bước thực hiện 3

2.2.4 Ứng dụng 4

2.3 Điện di 4

2.3.1 Khái niệm 4

2.3.2 Thành phần 4

2.3.3 Phương pháp 5

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 6

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 6

3.2 Vật liệu nghiên cứu 6

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 6

3.2.2 Thiết bị 6

3.2.3 Hóa chất 6

3.3.1 Điện di (kiểm tra DNA tổng số) 6

3.3.2 Thực hiện phản ứng PCR ở vùng 16S rRNA 8

3.3.3 Điện di mẫu PCR primer 16S rRNA 9

3.3.4 Thực hiện PCR với primer Salmonella sp 10

3.3.5 Điện di mẫu PCR primer Salmonella sp 11

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12

4.1 Kết quả 12

4.1.1 Kết quả điện di DNA tổng số 12

4.1.2 Kết quả điện di mẫu PCR primer 16S rRNA 12

4.1.3 Kết quả điện di mẫu PCR primer Salmonella sp 13

4.2 Thảo luận 13

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 14

5.1 Kết luận 14

5.2 Đề nghị 14

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCR : Polymerase Chain Reaction

DNA : Deoxyribonucleic acid

rRNA: Ribosome Ribonucleic acid

TBE : Tris-Boarate-EDTA

UV : Ultraviolet

bp : base pair

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 8 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 9

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Salmonella sp 10

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Salmonella dưới kính hiển vi điện tử quét 2

Hình 3.1 Vortex mẫu trên máy lắc vortex 7

Hình 3.2 Cho lần lượt các chất vào tube 7

Hình 3.3 Mix đều hỗn hợp điện di và bơm vào giếng 8

Hình 3.4 Chu trình nhiệt được cài đặt trên máy PCR 9

Hình 3.5 Chu trình nhiệt được cài đặt trên máy PCR 11

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số 12

Hình 4.2 Kết quả điện di mẫu PCR primer 16S rRNA 12

Hình 4.3 Kết quả điện di mẫu PCR với primer Salmonella sp 13

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Vi khuẩn Salmonella phân bố rộng rãi trong thiên nhiên Gia súc, gia cầm và con

phẩm gây ra là rất lớn: ước tính có khoảng 600 triệu người - gần 1 trong 10 người trên thế giới bị bệnh và có đến 420.000 ca tử vong mỗi năm sau khi ăn thực phẩm bị ô nhiễm Các bệnh do thực phẩm có thể nghiêm trọng, đặc biệt là đối với trẻ nhỏ Tiêu chảy là bệnh phổ biến nhất do thực phẩm không an toàn, mỗi năm có 550 triệu người mắc bệnh, trong đó có

220 triệu trẻ em dưới 5 tuổi Vi khuẩn Salmonella là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm

hàng đầu trên thế giới Nghiên cứu phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) trở thành chủ đề nóng trong lĩnh vực y sinh, kiểm nghiệm và sinh học phân tử

Việc phát hiện và định danh vi sinh vật trong thực phẩm nhằm nhanh chóng phát hiện các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và ngăn ngừa một cách có hiệu quả các tác hại từ ngộ độc thực phẩm là thực tế và cấp thiết Tuy nhiên, các phương pháp nuôi cấy hiện nay chủ yếu là truyền thống, tốn nhiều thời gian, vì thế điện di và phản ứng PCR giúp nâng cao độ chính xác và tiết kiệm nhiều thời gian

1.2 Mục tiêu

Kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn Salmonella trong mẫu ly trích ban đầu thông qua

một cặp mồi đặc hiệu cho vùng gen bằng phương pháp PCR và điện di có sử dụng ladder

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Điện di kiểm tra sự có mặt DNA có trong mẫu ly trích ban đầu

Nội dung 2: Thực hiện phản ứng PCR vùng 16S rRNA thông qua một cặp mồi đặc hiệu cho vùng gen 16S rRNA và điện di có sử dụng ladder

Nội dung 3: Thực hiện phản ứng PCR thông qua cặp mồi đặc hiệu Salmonella sp

và điện di có sử dụng ladder kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn Salmonella

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi khuẩn Salmonella

Salmonella là một trực khuẩn gram âm trực thuộc họ Enterobacteriaceae, kị khí tùy

nghi không tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính

khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình roi Salmonella

là một loại vi khuẩn phổ biến và cứng cáp, có thể sống vài tuần trong môi trường khô ráo

và vài tháng trong nước

Giới (regnum): Bacteria

Ngành (phylum): Proteobacteria

Lớp (class): Gammaproteobacteria

Bộ (order): Enterobacteriales

Họ (family): Enterobacteriaceae

Chi (genus): Salmonella

Salmonella phổ biến hơn trong thực phẩm từ động vật, như trứng, thịt bò và gia cầm Nhưng đất hoặc nước cũng có thể làm ô nhiễm trái cây và rau quả Ngoài ra, Salmonella có

thể được lây nhiễm từ thực phẩm này sang thực phẩm khác bằng tay hoặc dao, thớt, đĩa và các dụng cụ nhà bếp khác Khi lượng vi khuẩn đã vượt qua axit dạ dày và hệ thống miễn

dịch dẫn đến nhiễm khuẩn Salmonella Vi khuẩn Salmonella xâm nhập và phá hủy các tế

bào lót trong ruột khiến cơ thể khó hấp thụ nước, có thể gây ra đau bụng Nước rời khỏi cơ thể dưới dạng tiêu chảy

Những nguy cơ nhiễm khuẩn Salmonella cao: Sống hoặc làm việc xung quanh động

vật có nguy cơ nhiễm khuẩn cao, dùng thuốc kháng axit hoặc gần đây đã dùng thuốc kháng

sinh làm giảm khả năng miễn dịch chống lại vi khuẩn Salmonella, mắc bệnh hồng cầu hình liềm nguy cơ bị viêm tủy xương, một biến chứng hiếm gặp của vi khuẩn Salmonella

Hình 2.1 Salmonella dưới kính hiển vi điện

tử quét (Wikipedia)

2.2 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.2.1 Khái niệm

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 cho phép nhân bản in vitro một đoạn DNA dựa vào cơ chế sao chép DNA trong tự nhiên ở sinh vật Quá trình này được tiến hành khi có sự gắn kết của các trình tự mồi (primer) trên đoạn khuôn, tiếp đó enzyme DNA polymerase bám vào đầu 3' tự do của mồi và tiến hành tổng hợp nên sợi DNA mới có trình tự bố sung với mạch khuôn Như vậy, nếu được cung cấp đoạn mồi gắn kết đặc hiệu với đoạn khuôn, mồi, enzyme DNA polymerase, các nucleotide tự do (dNTP) và các thành phần khác như dung dịch đệm, chúng

ta có thể thực hiện nhân tạo quá trình sao chép DNA trong ống nghiệm

Với y học hiện đại ngày nay, xét nghiệm sinh học phân tử PCR đang được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán và chữa bệnh Nổi bật là ứng dụng của PCR trong chẩn đoán các bệnh đặc hiệu liên quan tới virus mà các xét nghiệm truyền thống không thể chẩn đoán hoặc chẩn đoán cho kết quả không chính xác

2.2.2 Thành phần

DNA mẫu là DNA chứa vùng được sao chép Thông tin cần thiết được sao chép là trình tự của hai vùng nucleotide ngắn ở hai đầu của vùng quan tâm Hai trình tự mẫu ngắn phải được biết để có thể tổng hợp được hai đoạn mồi

Hai đoạn mồi là các đoạn nucleotide ngắn tương ứng với các trình tự mẫu có thể được tổng hợp Các đoạn mồi gắn kết với khuôn mẫu tại các vị trí bổ sung và đóng vai trò

là điểm bắt đầu cho quá trình sao chép Một cặp mồi phổ biến được sử dụng để phân tích

Nucleotide tự do được sử dụng để xây dựng các chuỗi DNA mới và DNA polymerase

Một loại enzyme bổ sung tuần tự các nucleotide tự do theo trình tự của khuôn mẫu Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho enzyme

2.2.3 Các bước thực hiện

PCR là một quá trình gồm ba bước được thực hiện theo chu kỳ lặp đi lặp lại Bước

nguyên liệu ban đầu đến nhiệt độ khoảng 95°C Mỗi sợi là một khuôn mẫu để tổng hợp một sợi mới Ở bước thứ hai, nhiệt độ được giảm xuống khoảng 62°C để mồi có thể gắn vào khuôn Ở bước thứ ba, nhiệt độ được nâng lên khoảng 72°C và DNA polymerase bắt đầu thêm nucleotide vào đầu của mồi đã ủ Vào cuối chu kỳ, kéo dài khoảng năm phút, nhiệt

độ tăng lên và quá trình bắt đầu lại Số lượng bản sao tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ Thông thường 25 đến 30 chu kỳ sẽ tạo ra đủ lượng DNA

2.2.4 Ứng dụng

PCR được sử dụng để chẩn đoán bệnh di truyền và phát hiện mức độ nhiễm virus thấp Trong y học pháp y, được sử dụng để phân tích các dấu vết nhỏ của máu và các mô khác nhằm xác định người hiến tặng bằng “dấu vân tay” di truyền của người đó Kỹ thuật này cũng được sử dụng để khuếch đại các đoạn DNA được tìm thấy trong các mô được bảo quản

2.3 Điện di

2.3.1 Khái niệm

Điện di là một kỹ thuật phân tách trong các phòng thí nghiệm lâm sàng và nghiên cứu, là sự di chuyển và tách hạt tích điện (ion) qua dung dịch dưới tác dụng của điện trường Kể từ khi được phát hiện, điện di đã là một công cụ thiết yếu được các nhà sinh học

và hóa học sử dụng để tách các hỗn hợp, đặc biệt là protein và axit nucleic

Điện di được chứng minh lần đầu tiên vào năm 1807 bởi Ruess, người đã ghi nhận

sự di chuyển của các hạt về phía cực dương và đã được cải tiến từ phương pháp điện di trên giấy thô ban đầu sang hệ thống tự động hiện đại Lợi ích của sự cải tiến là đáp ứng yêu cầu

về độ phân giải kết quả nhanh hơn và tốt hơn

2.3.2 Thành phần

Gel agarose tạo một môi trường giúp DNA di chuyển trật tự và do trong cấu trúc gel agarose có những lổ nhỏ li ti vì vậy khi DNA di chuyển sẽ làm cản trở DNA di chuyển và các DNA có khích thước lớn sẽ di chuyển chậm, các DNA nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn còn các DNA có khích thước bằng nhau sẽ di chuyển cùng nhau

Gelred là một chất hóa học mà khi liên kết với DNA mạch đôi nó sẽ chèn vào các khoảng trống giữa 2 liên kết hidro, dưới sự tác động của tia UV ta có thể nhìn thấy trực tiếp

gelred và thông qua đó có thể thấy được band

Dung dịch đệm tạo điện trường giúp DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương, DNA có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn DNA có kích thước lớn

Thang chuẩn là hỗn hợp nhiều đoạn DNA ngắn có kích thước khác nhau tùy vào loại

sử dụng Có tác dụng để so sánh các DNA điện di có khích thước tương đối là bao nhiêu

Nó dựa theo việc các DNA có khích thước giống nhau sẽ di chuyển cùng với nhau Từ đó

ta có thể dựa vào sự ngang bằng của các đoạn DNA với thang chuẩn mà suy ra khích thước đoạn DNA đó là bao nhiêu Ngoài ra ta có thể dựa vào độ sáng mạnh yếu của đoạn DNA

so với thang chuẩn mà có thể suy ra nồng độ tương đối của DNA trong hỗn hợp

vào gel điện di và theo dõi quá trình chạy gel, là hỗn hợp gồm Glycerol và Bromphenol

dùng xác định vị trí di chuyển của mẫu trên gel trong quá trình chạy điện di Glycerol giúp tăng độ dày của mẫu, làm cho nó dễ dàng nạp vào giếng gel mà không bị rơi ra khỏi giếng

2.3.3 Phương pháp

Khi gel đã ở trong hộp, mỗi mẫu DNA sẽ được bơm cẩn thận vào một trong các giếng Một giếng được dành riêng cho thang DNA Tiếp theo, nguồn điện của hộp gel được bật và dòng điện bắt đầu chạy qua gel Các phân tử DNA có điện tích âm do có các nhóm photphat, vì vậy khi bật nguồn sẽ có dòng điện chạy qua gel, các DNA bắt đầu di chuyển qua gel về phía cực dương

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian từ 09/04/2024 đến 07/05/2024

Địa điểm: Phòng 304 Bệnh học và Chẩn đoán, Viện nghiên cứu công nghệ Sinh học

và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu ly trích nghi ngờ chứa vi khuẩn Salmonella được cung cấp bởi phòng 304 Bệnh

học và Chẩn đoán, Viện nghiên cứu công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Nhận mẫu đã được ly trích nghi ngờ chứa vi khuẩn Salmonella Sau đó tiến hành

điện di kiểm tra DNA tổng số

3.3.1 Điện di (kiểm tra DNA tổng số)

Điện di DNA tổng số với thuốc nhuộm Gelred, tỷ lệ 3μl DNA trộn với 1μl GelRed

và 0,5 μl Loading dye Quá trình điện di trên Gel agarose 1% được thực hiện ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút

Quá trình điện di được thực hiện theo quy trình như sau:

Bước 1: Chuẩn bị 25 mL gel agarose 1%, cho 0,25 g agarose vào 25 mL dung dịch TBE 0,5X đun hỗn hợp trên trong lò vi sóng cho tới khi agarose tan hoàn toàn

Bước 2: Làm nguội agarose gel sau khi đun đến khoảng 60°C trong khoảng 10 phút, sau đó đổ vào khuôn đã được đặt lược vào trước, đợi đến khi gel đông hoàn toàn

Bước 3: Lấy luợc ra, đưa gel vào bồn điện di (cho vào bồn điện di một lượng TBE Buffer 0,5X đủ ngập miếng gel)

Bước 4: Bước 4: Vortex mẫu DNA

Bước 5: Dùng micropipette hút 1 µl gelred + 0,5 µl loading dye + 3 µl mẫu

Bước 6: Mix đều hỗn hợp bằng micropipette và bơm vào giếng đã chuẩn bị sẵn

Hình 3.1 Vortex mẫu trên máy lắc vortex A) Mẫu của nhóm B) Vortex mẫu

Bước 7: Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút

Bước 8: Đọc kết quả dưới tia UV

Bước 9: Chụp gel để lưu lại kết quả

Bước 1: Pha loang mẫu DNA gốc 2 lần: hút 5 μL DNA gốc (mix đều để DNA không

lần lượt Primer F và R với thể tích mỗi loại là 0,5 μL Cuối cùng cho vào tube 1 μL DNA mẫu Mix đều hỗn hợp (tránh tạo bọt trong tube)

Bước 3: Cho vào máy PCR để tiến hành chạy phản ứng theo nhiệt độ và chu kì theo bảng sau

Hình 3.3 Mix đều hỗn hợp điện di và bơm vào giếng A) Mix hỗn hợp điện

di B) Bơm hỗn hợp điện di vào giếng

B

A

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 16S rRNA

1489R

Bước 4: Sau khi chạy PCR 16S xong, tiếp tục kiểm tra kết quả bằng phương pháp điện di

3.3.3 Điện di mẫu PCR primer 16S rRNA

Điện di kiểm tra DNA vi khuẩn và sản phẩm PCR của primer 16S rRNA Điện di DNA vi khuẩn với thuốc nhuộm Gelred, tỷ lệ 1 μL Gelred trộn với 4 μL dung dịch sản

phẩm PCR Kết quả PCR 16S thành công nếu xuất hiện band có chiều dài khoảng 1500bp

Bước 1: Chuẩn bị 35 mL Gel agarose 1% cần 0,35 g gel agarose vào 35 mL dung dịch đệm TBE 0,5X, lắc đều và đun hòa tan trong lò vi sóng, để nguội đến khoảng 60℃ rồi

đổ vào khuôn đã gắn lược tạo các giếng nạp mẫu Sau khi bản gel đông cứng, đặt bản gel

Hình 3.4 Chu trình nhiệt được cài đặt trên

máy PCR

Bước 2: Tiến hành hút 4 μL sản phẩm PCR, trộn với 1 μL thuốc nhuộm Gelred Đồng thời thêm thang chuẩn DNA 1 Kb vào giếng để kiểm tra kích thước các đoạn DNA

Bước 3: Bổ sung đối chứng (-) có thể dùng nước với mục tiêu kiểm tra thao tác và kiểm tra hóa chất sử dụng

Bước 4: Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút

Bước 5: Đọc kết quả dưới tia UV

Bước 6: Chụp để lưu lại kết quả

3.3.4 Thực hiện PCR với primer Salmonella sp

Sau khi chạy PCR 16S thành công, tiến hành chạy PCR với mồi Salmonella sp., để xác định DNA mẫu có chứa Salmonella hay không

Dream Taq, 0,5 μL cho từng loại mồi F và R vào tube Cuối cùng cho 1 μL DNA mục tiêu Mix đều sau mỗi thao tác

Bước 2: Cho vào máy PCR để tiến hành chạy phản ứng theo nhiệt độ và chu kì theo bảng sau:

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Salmonella sp

F3